基于AgNCs/HpDNA探針的microRNA SDA檢測法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學和分子診斷領域，是一種基于AgNCs/HpDNA探針的microRNASDA 檢測法，特別是涉及一種基于發夾型DNA模板合成銀納米團簇探針結合鏈取代等溫擴增的 單個microRNA檢測方法。
【背景技術】
[0002]MicroRNA(miRNA)是一類長度約為21nt的內源非編碼小RNA分子，其可通過與 mRNA之間精確或非精確互補配對，參與調控mRNA的表達水平。多個miRNA可協同調控一個 mRNA，或一個miRNA也可同時影響多個靶基因，從而形成一個高度復雜的調控網絡，影響著 從分子到細胞再到組織水平的一系列生物功能。miRNA表達異常與疾病及癌癥發生密切相 關。尤為重要的是，已發現多種miRNA標志物可用于癌癥早期診斷、預后及進程監控。其中， 上海交通大學崔大祥課題組用微陣列芯片miRNA全基因組掃描結合qRT-PCR技術篩選得到 miR-16-5p和miR-19b-3p兩種血衆miRNA標志物，并指出二者可用于指示胃癌發生發展進 (Zhang,J. ,Song,Y. ,Zhang,C. ,etal. (2015)CirculatingmiR-16_5pandmiR-19b_3p astwonovelpotentialbiomarkerstoindicateprogressionofgastriccancer. Theranostics，5, 733-745.)。其中，qRT-PCR是進行miRNA定量檢測的金標準，但由于其需 分步進行逆轉錄和熱循環擴增及檢測，導致該法耗時且費力。所以仍有必要進一步發展便 捷快速的miRNA檢測新方法。
[0003] 等溫擴增技術的出現使核酸擴增技術因擺脫了熱循環變性步驟和儀器的束縛，而 受到了眾多研究者的關注。作為第一代等溫擴增技術，鏈取代擴增Strand-displacement amplification(SDA)受DNA修復中堿基切除修復機制的啟發迅速發展起來，至今，已發展 出包括多引物SDA(multiplyprimedSDA)，剪切誘導SDA(nicking_initiatedSDA)，環介 導等溫擴增（loop-mediatedisothermalamplification(LAMP))和結構轉換誘發SDA(st ructure-switching-triggeredSDA)等多種亞型。其中，由于結構轉換誘發SDA不需要特 殊設計剪切位點和額外使用剪切酶，而僅通過待測靶核酸與發夾結構探針的結合并導致后 者打開而誘導SDA反應，特別適合對短鏈核酸分子及miRNA進行檢測。目前，常用于結構轉 換誘發SDA的檢測探針是一端連接有熒光染料及另一端連接熒光淬滅子的發夾型DNA分子 信標（molecularbeacon(MB))，但由于其需要對DNA進行偶聯修飾，使檢測成本增高，檢測 應用受限。
[0004]隨著以DNA模板合成銀納米團族（DNA-templatedsilvernanoclusters(AgNCs/ DNA))的興起，使得可能發展出除熒光染料或量子點修飾以外的新型核酸熒光探針。銀 納米團簇是僅由幾個或幾十個銀原子組成的直徑小于lnm的集合體，其易于合成，且熒 光可調控。更重要的是，AgNCs/DNA中由于DNA模板的引入，可僅通過改變DNA序列、長 度和構象來獲得特定的光物理學特性。近來，已有多種DNA序列合成AgNCs用于核酸或 miRNA檢測。Yang和Shah以 5' -CCTCCTTCCTCC-3' 為AgNCs成核區序列，并連接以miRNA 雜交序列，借助該探針的熒光淬滅效應，對miR-160和miR-172進行了檢測（Yang，S. ff.andVosch,T. (2011)RapiddetectionofmicroRNAbyasilvernanocluster DNAprobe.Anal.Chem. , 83, 6935-6939.)。Liu利用指數等溫擴增反應生成用于紅色 熒光AgNCs合成的DNA模板，并借助熒光強度與DNA模板濃度間關系，對miR-141進行 了測定。這些檢測或借助熒光淬滅效應，或分別進行信號擴增和信號檢測，導致特異 性不好，或操作繁瑣（Liu,Y. -Q.，Zhang,M.，Yin,B. -C.andYe,B. -C. (2012)Attomolar ultrasensitivemicroRNAdetectionbyDNA-scaffoldedsilver-nanoclusterprobe basedonisothermalamplification.Anal.Chem.，84, 5165-5169.)。而隨著Yeh報道 了雜交介導的富G序列對AgNCs/DNA的熒光增強效應，使建立基于1ight-up信號的核 酸檢測平臺成為可能（Yeh,H.C.，Sharma,J.，Han,J.J.，Martinez,J.S.andWerner,J. H. (2010)ADNA-silvernanoclusterprobethatfluorescesuponhybridization.Nano Lett.，10, 3106-3110.)。但是，單純的雜交檢測雖然簡便，卻也很難確保較好的特異性。因 而，為進一步提高檢測特異性，簡化操作步驟，我們首次將基于AgNCs/DNA的富G序列熒光 增強效應與結構轉換誘發SDA擴增技術結合，并研究二者的相互作用，以期實現可調控、簡 便及高特異檢測。

【發明內容】

[0005] 為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種基于AgNCs/HpDNA探針 的miRNASDA檢測法，具體是一種基于發夾型DNA模板合成銀納米團簇（AgNCs/HpDNA)探針 結合SDA反應對miRNA進行檢測的方法，即針對前期篩選得到的miRNA標志物miR-16-5p， 設計并構建AgNCs/HpDNA探針，驗證該探針的富G序列熒光增強性能，在此基礎上，對該 miRNA標志物進行單個檢測，及單個堿基錯配檢測。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0007] 第一方面，本發明提供一種HpDNA，序列如SEQIDN0 :1所示。
[0008] 第二方面，本發明提供一種所述HpDNA的AgNCs/HpDNA，所述AgNCs/HpDNA是通過 如下方法制備：
[0009] 將AgN03溶液、NaBH4溶液加入HpDNA中，震蕩，靜置，即得AgNCs/HpDNA。
[0010] 優選地，HpDNA、AgN03、NaBH4的終摩爾濃度之比為1:25:25 ;所述震蕩為劇烈震蕩， 劇烈震蕩的時間為45s-lmin;所述靜置具體指于暗環境中室溫放置18h。
[0011] 第三方面，本發明提供一種所述的AgNCs/HpDNA在檢測胃癌血漿miRNA標志物 miR-16-5p中的應用，所述miR-16-5p的序列如SEQIDN0 :2所示。
[0012] 第四方面，本發明提供一種基于所述AgNCs/HpDNA的胃癌血漿miRNA標志物 miR-16-5pSDA檢測方法，所述檢測方法包括：以所述AgNCs/HpDNAs為分子探針，在含富G 序列垂懸端的引物作用下進行SDA反應，借助富G序列雜交熒光增強效應，實現miR-16-5p 檢測，所述引物序列如SEQIDNO:3所示。
[0013] 優選地，所述SDA反應的總體積為50μL，其中，
[0014]
[0015] 余量為無酶水。
[0016] 優選地，所述緩沖液lXNb2. 1 包括 50mMNaAc、10mMTris-HAc、10mMMg(Ac)jP 100μg/mLBSA，緩沖液pH7· 9 (25°C)。
[0017] 優選地，所述SDA反應的反應條件為55°C環境中孵育55min，熒光檢測的激發波長 為 580nm。
[0018] 第五方面，本發明提供一種所述的檢測方法在單個堿基錯配核酸序列檢測中的應 用。
[0019] 本發明所采用的技術方案是：
[0020] 如圖1所示，用于合成AgNCs的發夾型探針（RED16(7s)C)含三個區，分別為頸區 HpS、環區HpL和3'垂懸區HpRO。其中，特別設計的垂懸區富含C序列用于合成AgNCs，且 HpR0(5' -CCCTTAATCCCC-3'）在雜交作用下與互補鏈中的富G垂懸序列靠近而得到紅色熒 光增強信號。用于miR-16-5p檢測的探針為RED16(7s)C，其序列如SEQIDN0:1所示。
[0021] 而待測miRNA序列分別與5'端頸部HpS部分序列及環區HpL互補，對應序列區域 分別為MSc和MLc，該設計有利于更好地打開發夾結構，相應的靶miRNA為miR-16-5p，其序 列如SEQIDN0 :2所示。
[0022] 引物序列也由兩個區域組成，分別為頸區互補區（PRSc，5'-TA-3'）和富G序列垂 懸區（P0:5' -GGGTGGGGTGGGGTGGGG-3'），相應HpDNA的引物為Pri2,其序列如SEQIDN0 : 3所示。
[0023] miRNA的檢測機制如下。首先，在發夾型探針上生成AgNCs，AgNCs/RED16 (7s)C探 針在580nm波長激發下無熒光發射或較弱。在有靶miRNA時，其通過與AgNCs/HpDNA雜交， 而打開發夾結構。隨后，引物雜交至發夾探針頸部3'端，在聚合酶和dNTP的共同作用下， 引導聚合酶鏈反應，延伸得到HpDNA的互補鏈HpDNAc(RED16 (7s)G，其序列如SEQIDN0 : 4所示），從而使雜交雙鏈AgNCs/HpDNA-HpDNAc中富G垂懸互補序列與AgNCs靠近，并得到 位于該波長處的探針的熒光增強信號。同時，先前與HpDNA結合的靶miRNA序列被取代并 釋放，進入下一個循環反應。相反，在沒有靶miRNA時，HpDNA保持閉合狀態，引物無法結合， 進而也無法擴增生成HpDNAc，最終，無法獲得該波長處的熒光增強信號。
[0024] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0025] 第一，基于AgNCs/HpDNA探針及其富G序列熒光增強效應，可實現miRNA的高特異 性檢測。相比SYBRGreen隨意插入雙鏈核酸，及MB只要發夾探針打開即可產生熒光信號 響應的機制，本發明所用探針僅在形成帶富G垂懸序列的互補序列并與之雜交后，才會生 成熒光增強信號，發夾探針打開及任何中間體雜交雙鏈均不會產生該信號，因而具有高特 異性。
[0026] 第二，發夾型DNA既作為SDA反應的模板，又作為AgNCs的生成模板，縮短了反應 時間并節省了反應材料。通過將AgN(V^NaBHj$照一定比例與發夾型DNA混合，S卩可制備 得到AgNCs/HpDNA探針。盡管該探針需要靜置18h以使AgNCs充分老化，但其可以一次性 大量制備并長期儲存，且靜置時間也可縮短至4h。在此基礎上，SDA反應時間僅一步完成， 時長55min，也可進一步縮短至30min。
【附圖說明】
[0027] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0028] 圖1為檢測原理不意圖；
[0029] 其中，①HpDNA模板上生成AgNCs;②靶miRNA雜交互補于HpDNA的5'頸區和環 區；③HpDNA打開；④富G垂懸引物結合于HpDNA3'頸區；⑤在聚合酶作用下延伸形成富G 垂懸互補鏈HpDNAc;⑥祀miRNA釋放，進入下一循環SDA反應；
[0030] 圖2為富G序列雜交熒光增強效應驗證；其中，
[0031] A :AgNCs/RED 16 (7s) C探針及其雜交產物熒光發射譜；
[0032]