一種血液中稀有細胞蛋白組的檢測裝置的制造方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于血液檢測裝置，具體涉及一種血液中稀有細胞蛋白組的檢測裝 置。
【背景技術】
[0002] 各種非傳染性重大疾病（如腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等）在中國已經進入高增 長狀態，而人口老齡化和環境污染則進一步加劇了這種趨勢。很多重大疾病目前缺乏有效 的治療手段且治療成本高昂，在給個體健康造成了嚴重損害的同時還給家庭和社會造成了 沉重的經濟負擔。預防這些重大疾病的發生以及對其早期發現、早期干預是解決這一問題 的有效方法。所謂早期發現是指在患者尚未出現明顯癥狀或是在具有侵入性、對人體有損 傷的檢測方法發現之前就能夠發現重大疾病的蛛絲馬跡。血液是反映人體健康狀況的最好 窗口，因為血液流經人體所有器官，從各器官分泌或者脫落的物質都在血液里匯聚、循環， 最終到達人體其他部位或是通過尿液排到體外。這些分泌或脫落到血液中的物質就構成了 健康檢測或疾病檢測的標志物，包括分子類標志物（DNA、蛋白質、代謝物、microRNA等）以 及外泌體、細胞等。目前針對血液中游離的分子類標志物如DNA、蛋白質和代謝物檢測的研 究與臨床應用已經十分豐富，但對于血液中游離的從器官組織上脫落的稀有細胞的研究還 非常稀少，而這些異常出現在血液中的稀有細胞常常與疾病密切相關。
[0003] 血液中存在著一些從器官組織上脫落進入血液循環的稀有細胞，如循環腫 瘤細胞、循環內皮細胞、循環上皮細胞等。循環內皮細胞（circulating endothelial cells, CEC)是指外周血中游離的血管內皮細胞，它是血管受損的標志，其數量可反映 血管內皮受損的程度。Damani等報道了檢測循環內皮細胞可用于臨床預測急性心肌 梗死(Damani et al. , Characterization of Circulating Endothelial Cells in Acute Myocardial Infarction, Sci Transl Med 2012, vol. 4, 126ra33)。循環腫瘤細胞 (circulating tumor cells, CTC)是從腫瘤原位或轉移灶上脫落并進入血液的細胞。根據 經典的腫瘤轉移理論，腫瘤細胞血行轉移的大致步驟是原發灶腫瘤細胞的增殖，腫瘤細胞 自原發灶脫離，降解基質，侵襲穿越細胞外基質和血管基底膜并進入血管成為循環腫瘤細 胞。循環腫瘤細胞是轉移的直接來源，目前已有證據顯示檢測外周血中的循環腫瘤細胞數 目可用于實體瘤患者的預后以及預測化療的有效性，已進行的臨床試驗包括乳腺癌、前列 腺癌、結腸癌、腎細胞癌，黑色素瘤等。進一步研究顯示運用CTC負荷可作為潛在預測指標 來指導實體瘤患者的病程分期以及復發預測。需要注意的是，循環腫瘤細胞檢測一般針對 晚期癌癥患者進行，主要通過上皮標志物（主要實體瘤都是上皮來源的）進行捕獲。一般 認為只有腫瘤細胞才能突破基底膜，侵襲穿越血管壁進入血液，因此在腫瘤患者血液中檢 測到的上皮來源的細胞就是腫瘤細胞并進行計數，因此目前對于循環腫瘤細胞的計數并不 依賴與任何腫瘤特異性標志物或者基因突變檢測。
[0004] 然而，最新的研究表明在良性疾病患者，甚至健康人的血液中也能檢測到上皮 來源的細胞。比如胰腺囊性病變患者中約三分之一的血液中可檢出超過每毫升3個的 上皮細胞，通過對轉錄因子 I3DX-I (Pancreatic and duodenal homeobox protein-l，膜 島素促進因子-I)的染色推測這些上皮細胞可能來自胰腺（Rhim et al. ,Detection of Circulating Pancreas Epithelial Cells in Patients With Pancreatic Cystic Lesions, Gastroenterology 2014, vol. 146, p647_651)。一項針對良性結腸疾病患者的研 究（Pantel et al. , Circulating Epithelial Cells in Patients with Benign Colon Diseases, Clinical Chemisty, 2012, vol. 58, p936_940)發現一成以上患者血液中檢出上 皮細胞，但無法確認其器官來源。此外，約8%的慢性前列腺炎患者（活檢呈陰性，非前列 腺癌患者）血液中可檢測到良性的上皮細胞，且為PSA(Prostate Specific Antigen，前列 腺特異抗原）陽性（Murray et al·，Circulating Prostate Cells Found in Men with Benign Prostate Disease Are P504S Negative:Clinical Implications, Journal of Oncology, 2013, Article ID 165014)。最近的一項針對慢性阻塞性肺疾病（COPD)的研 究發現168例COB)患者有8例檢出血液中存在有上皮細胞，其中5例在之后的1-4年內 被CT檢出有肺結節，經手術切除后經病理診斷為IA期肺癌（4例腺癌，1例鱗狀細胞癌）， 而沒有檢出上皮細胞的其他160例患者通過每年一次的CT檢查隨訪五年沒有發現有肺結 節（Ilie et al. , "Sentinel'，Circulating Tumor Cells Allow Early Diagnosis of Lung Cancer in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease, PLOS ONE 2014, vol. 9, elll597)。以上這些研究反映了可以從患者良性疾病患者的血液中檢測到上 皮來源的細胞，在一些針對循環腫瘤細胞的研究中發現健康人對照組中也能在血液中檢出 少量的上皮細胞，但這些檢測到的上皮細胞均無法準確判定其器官來源。由于在檢出這些 上皮細胞的時候沒有任何臨床證據證明患者體內存在腫瘤，因此這些細胞很可能是由于其 所在器官損傷導致其脫落到血液中，這種損傷可能是炎癥或者是其他病變，甚至可能是極 微小的腫瘤病灶。
[0005] 由于癌癥是上皮組織的惡性腫瘤，占據了惡性腫瘤的絕大部分，因此對于影像學 方法（CT，PET-CT等）尚無法檢測到腫瘤的患者血液內游離的上皮細胞良性/惡性的鑒定， 以及其器官來源的鑒定對于癌癥早期檢測抑或是癌前病變的檢測非常重要。雖然可以通過 患者所患良性疾病的器官來推測，但這種推測并不可靠，而事實上很多患者同時患有不止 一種的良性疾病，目前沒有方法能夠較準確、便宜的鑒定血液中檢出的上皮細胞的器官來 源。因此，迫切需要一種方法能夠從血液中檢測循環上皮細胞并鑒定其器官來源，從而找到 已經發生病變的器官，為下一步臨床診斷提供依據。進一步的，如果一些上皮細胞能夠通過 病理學或基因測序被鑒定為腫瘤細胞，則可以提示這些細胞來源的器官存在腫瘤病灶，從 而能夠實現癌癥早期診斷。
[0006] 值得注意的是，從血液中分離上皮細胞的過程中常常會非特異性的引入包括白細 胞及其他稀有細胞在內的"雜質"細胞，比如癌癥患者血液中一種常見的稀有細胞是內皮 細胞（M. Kawaishi et al.，"Circulating Endothelial Cells in Non-small Cell Lung Cancer Patients Treated with Carboplatin and Paclitaxel"，Journal of Thoracic Oncology, 2009, vol 4, p208-213)，因此在鑒定上皮細胞的器官來源的同時必須排除其白 細胞與內皮細胞的可能性，通常可以通過白細胞標志物CD45、內皮細胞標志物CD14