專利名稱：氨甲酰磷酸合成酶1的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種氨甲酰磷酸合成酶1用作檢測肝癌的蛋白質分子標記的應用。
背景技術：
肝癌是一種嚴重危害人類的疾病。西方發達國家肝癌的發病率較低，國際上對肝癌的基礎研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發國家，發病率和死亡率呈現上升趨勢，且發病年齡構成年輕化，每年用于肝癌治療的醫療支出大為增加，肝癌成了嚴重危害我國人民生命財產安全的頭號敵人，并且是影響社會經濟發展的一個重要因素，加大力度進行我國肝癌的基礎研究具有戰略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關基因是目前肝癌基礎研究中的前沿課題。
到目前為止，已有不下20種的基因異常表達被確定與肝癌的發生發展有關，但已確定的肝癌相關基因在肝癌中的異常表達率并不高，肝癌的發病機制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統的肝癌手術加化療以及近年來配合使用的多種基因治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關基因尤其是肝癌高表達基因對于探討肝癌的發病機制具有重要意義。
因此，為治療和診斷目的研究和開發在肝癌中差異表達的基因和/或蛋白具有重要意義，本領域迫切需要新的在肝癌中差異表達的基因和/或蛋白。
氨甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl-phosphate synthetase 1，CPS1)，又稱Carbamoylphosphate synthase[ammonia]，mitochondrial[Precursor]。它的Genebank登錄號為gi|21361331|，NCBI的登錄號為NP_001866.2，Swissprot登錄號為P31327。氨甲酰磷酸合成酶1是肝中基本的起始并催化尿素循環的代謝酶，它由2號染色體上一段大于120kb的基因編碼，含有38個外顯子和37個內含子。人類的氨甲酰磷酸合成酶1基因有多種單核苷酸多態現象(Characterization of genomic structure and polymorphisms in the humancarbamyl phosphate synthetase I gene，Gene 31151-57，2003)。
氨甲酰磷酸合成酶1是一種包含多個結構域，由1500個殘基組成的肝線粒體基質蛋白，它可以被N-乙酰-L-谷氨酸變構激活，從而以三步反應合成氨甲酰磷酸。研究表明，氨甲酰磷酸合成酶1缺陷會導致一種常染色體隱性遺傳的尿素循環紊亂病，可以引起血氨升高，威脅生命(J.Mol.Biol.349127-141，2005)。現有的報導說明氨甲酰磷酸合成酶1缺陷病人的該基因發生了不同的錯義突變，但是還沒有研究能解釋發病的潛在性(Understanding Carbamoyl Phosphate Synthetase DeficiencyImpact of Clinical Mutations onEnzyme Functionality，J.Mol.Biol.(2005)349，127-141)。
但是到目前為止，現有技術中未見有關于氨甲酰磷酸合成酶1與肝細胞癌的相關性的報道。

發明內容
通過篩選在肝細胞癌癌組織以及肝細胞癌癌旁組織中差異表達的蛋白質，本申請的發明人找到了一種在肝細胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達的蛋白質(在癌組織中下調表達)，經質譜鑒定為氨甲酰磷酸合成酶1。進一步的免疫印跡實驗證實，氨甲酰磷酸合成酶1的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中下調表達)。
基于氨甲酰磷酸合成酶1與肝細胞癌的這種相關性，以該蛋白作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用于檢測肝癌。
因此，本發明的首要目的即在于提供一種氨甲酰磷酸合成酶1用作檢測肝癌的蛋白質分子標記的應用。
本發明的另一個目的在于提供一種抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測肝癌的制劑的應用。
本發明的再一個目的還在于提供一種抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測肝癌的試劑盒的應用。
本發明的又一個目的在于提供一種體外檢測肝細胞組織中氨甲酰磷酸合成酶1的表達是否異常的方法，該方法包括以下步驟A、用特異性抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體檢測待測肝細胞中氨甲酰磷酸合成酶1的數量；B、將步驟A測得的氨甲酰磷酸合成酶1的數量與正常肝組織中的氨甲酰磷酸合成酶1的數量進行比較，如測得的蛋白數量低于正常值，則表示被檢測肝組織中氨甲酰磷酸合成酶1的表達異常。
到目前為止，還沒有氨甲酰磷酸合成酶1與肝細胞癌的相關性的報道，因此，本發明的這一發現將為肝細胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖1為氨甲酰磷酸合成酶1在癌組織和癌旁組織的2-DE圖譜中的量變示意圖，顯示了蛋白質點SSP 6901(經質譜鑒定的氨甲酰磷酸合成酶1)在肝細胞癌患者的癌組織中的表達相比在癌旁組織中的表達明顯下調。
圖2為氨甲酰磷酸合成酶1的單向凝膠電泳后的免疫印跡分析結果示意圖。
圖3為氨甲酰磷酸合成酶1的雙向凝膠電泳后的免疫印跡分析結果示意圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本申請的發明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備的肝細胞癌的癌組織與癌旁組織蛋白質樣品，以雙向凝膠電泳(2-DE)技術篩選在癌組織與癌旁組織中差異表達的蛋白質點并質譜鑒定，結果發現氨甲酰磷酸合成酶1在肝細胞癌癌組織中下調表達。免疫印跡實驗進一步證實氨甲酰磷酸合成酶1的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達。
因此，以氨甲酰磷酸合成酶1作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用于檢測肝癌，也即氨甲酰磷酸合成酶1可以用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
實施例1、肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質樣品的制備本實施例中所使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)均購自Sigma公司。
本實施例以非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣品，具體如下手術切除的新鮮組織塊迅速置于冰上，快速切成幾個肉眼可見、無壞死區域的小塊。用預冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培養基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲異噁唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/mL，兩性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗滌組織小塊數次后，在液氮中快速研磨成細胞沉淀，細胞沉淀分別溶于適量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超聲細胞破碎儀(Soniprep 150，英國，MSE)冰浴間歇超聲2min，15000r/min、4℃離心1h。取上清，以改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產品說明書)進行總蛋白質定量，制備好的肝細胞癌癌組織及相應癌旁組織的蛋白質樣品分裝，-80℃保存備用。
以上述方法制備16對肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質樣品。16例肝細胞癌標本均來自東方肝膽外科醫院，由2個病理科醫生明確為肝細胞癌。均為男性，平均年齡49.4歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，16例(100％)屬臨床分級(TNM分級)III級。其中，甲胎蛋白(AFP)高于25μg/L的15例(93.75％)；14例腫瘤大于5cm。16例肝細胞癌標本的病理資料詳見以下表1。
表1、16例肝細胞癌標本的病理資料

本實施例所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細胞癌患者的成對樣品，所有16例肝細胞癌病例有極相似的病例診斷指標均為男性，平均年齡49.4歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，16例(100％)屬TNM分級III級。其中，AFP高于25μg/L的15例(93.75％)；14例腫瘤大于5cm。這種取樣方法有利于降低個體間差別對實驗分析工作的影響。
實施例2、差異表達蛋白的篩選本實施例中使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺等購自Fluka公司。
過硫酸胺(AP)、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest軟件等為Bio-Rad產品。
Bruker Reflex III MALDI-TOF質譜，購自Karlsruhe公司(德國)。
非線性固相pH梯度預制膠條(IPG干膠條，pH3-10NL，130×3×0.5mm)、IPG緩沖液、IPGphore等電聚焦系統(Amersham Pharmacia Biotech)、Amersham Pharmacia EttanDalt II systems等為Amersham Bioscience公司產品。
取實施例1得到的16對肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣品中的前10對(表1中f31、f32、f33、f39、3 27、3 28、4 15、4 18、4 22和3 17)，采用雙向凝膠電泳法對其中的差異表達蛋白進行篩選，雙向凝膠電泳主要按Sanchez等人的改進方法(Sanchez，J.C.et al.Electrophoresis 1997，18，324-327)進行，具體如下首先采用分析型雙向凝膠電泳將60μg蛋白質樣品與重泡漲液(8mol/L尿素、2％CHAPS、0.5％IPG緩沖液、18mmol/L DTT和痕量溴酚藍)混合，總體積250μl，使用130×3×0.5mm pH3-10NL膠條，在IPGphore等電聚焦系統上進行一向分離，總電壓小時約為80000Vhrs。等電聚焦后膠條依次在平衡液I(6M尿素、30％甘油、2％SDS、1％DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％IAA代替)中平衡，每次15min。膠條轉移至十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，膠濃度12％)上緣，電泳條件為15mA/膠30min，然后30mA/膠保持至溴酚藍離膠下緣0.5cm。
然后，采用銀染使膠條生成圖像，并以GS-710圖像掃描儀(Bio-Rad)透射模式掃描膠圖像，分辨率為84.7μm/pixel。點的檢測和匹配用PDQuest軟件分析。蛋白質點的等電點pI和分子量Mr以2-DE標準蛋白質(Bio-Rad)的作為Marker，輸入軟件用于分析其它蛋白的pI和Mr。
本實施例以非酶解樣品制備法中制備的10對肝細胞癌患者的癌組織與相應癌旁組織蛋白質樣品，共得到2-DE圖譜40余幅，其中5對樣品重復3次PDQuest軟件進行了癌組織與癌旁組織的蛋白質差別表達譜分析，分析結果見以下表2。
表2、PDQuest軟件分析結果(部分)

注在T中更多＝在肝癌組織中表達上調的蛋白質點；在N中更多＝在肝癌組織中表達下調的蛋白質點；僅在T中＝僅在肝癌組織中檢測到的蛋白質點；僅在N中＝僅在非肝癌組織中檢測到的蛋白質點；T-T＝腫瘤之間的相關系數；N-N＝成對的非腫瘤之間相關系數；T-N＝腫瘤組織和成對的非腫瘤組織之間的相關系數。
在pH3-10膠條上，銀染條件下兩類組織樣品均顯示約1200個銀染點。癌組織間銀染點匹配率為0.75～0.86，癌組織與癌旁組織間銀染點匹配率為0.60～0.76，一定程度上說明兩類組織樣品取樣方法的科學性。
圖譜分析之后，本實施例又采用制備型雙向凝膠電泳，上樣量為1.5mg，總Vhrs約為90000，采用可與質譜兼容的考瑪斯亮藍法檢測，其它與分析型雙向凝膠電泳方法相同。
接下來的膠內酶解與質譜鑒定過程如下蛋白質點由質譜兼容的考瑪斯亮藍染色的制備型電泳凝膠上手工切取，在100mM NH4HCO3、30％乙腈中脫色，真空冷凍干燥，5μl50mmol/L NH4HCO3(pH8.3，蛋白質∶胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入20μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解過夜。抽提蛋白(60％乙腈、0.1％三氟乙酸)，真空冷凍干燥。用Bruker Reflex III MALDI-TOF質譜鑒定酶解好的樣品，MASCOT搜索工具(http//www.matrix science.com；Matrix Science，London，UK)進行數據庫搜索。
應用雙向凝膠電泳技術、膠內酶解技術、質譜技術，本實施例鑒別出了116個差別點，對應102種差別表達的蛋白質。其中，肝細胞癌癌組織中高表達或僅在其中表達的為61個差別點，對應54種蛋白質；肝細胞癌癌旁組織中高表達或僅在其中表達的為55個差別點，對應48種蛋白質。
在差異表達譜中，點SSP6901(圖1)在癌組織中表達明顯下調，經切點、膠內酶解，點SSP6901用MALDI-TOF質譜鑒定和數據庫搜索得12個非重復肽段與氨甲酰磷酸合成酶1相符并滿足MASCOT打分條件(單一同位素峰的搜庫標準MASCOT得分大于63，p＜0.05)得分71，p＝0.001514；氨基酸覆蓋率為10％，具體結果詳見以下表3表3、氨甲酰磷酸合成酶1質譜鑒定結果

并且，根據PDQuest軟件對已有2-DE圖譜的分析，通過比較點SSP6901在不同肝細胞癌患者的癌組織與癌旁組織的2-DE圖譜中的表達情況，發現點SSP6901在以下9例不同病例中的都是在癌組織中低表達(表4)。
表4、點SSP6901在癌組織中的下調表達在9例不同病例中的重復情況

因而，2-DE圖譜分析顯示點SSP6901在癌組織中的下調表達在不同肝細胞癌患者的癌組織與癌旁組織的2-DE圖譜中得到良好的重復(90％)
實施例3、氨甲酰磷酸合成酶1差異表達的免疫印跡驗證為確認氨甲酰磷酸合成酶1的差異表達，取10位肝細胞癌患者的癌組織及相應癌旁組織蛋白質樣品(表1中3 17、3 27、4 2、4 5、4 8、4 9、4 15、4 18、4 22和4 24)，用購買的抗氨甲酰磷酸合成酶1抗體進行免疫印跡分析，具體過程簡述如下每個樣品取20μg蛋白質樣品用12％SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜(購自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用兔抗人氨甲酰磷酸合成酶1多克隆抗體(購自Abcam公司，1∶2000)，4℃孵育過夜，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化鈉8g，Tween 20ml，用HCl調節pH到7.6)洗滌三次，每次5分鐘，二抗為抗兔抗體(購自Santa Cruz公司，1∶10000)，室溫孵育1小時，再用TBST洗滌三次，每次10分鐘，最后用ECL plus試劑(Amersham Biosciences)反應5分鐘后，以X-光片曝光檢測，檢測結果如圖2所示。
圖2的免疫印跡結果顯示，10對癌組織與癌旁組織中均呈現這樣的現象癌組織中氨甲酰磷酸合成酶1的雜交條帶的濃度都明顯低于相應的癌旁組織，可見氨甲酰磷酸合成酶1在肝細胞癌的癌組織中存在低表達，該結果與雙向凝膠電泳結果一致。
同時取一對組織樣品(3 17)，用購買的抗氨甲酰磷酸合成酶1抗體進行免疫印跡分析，具體過程簡述如下每個樣品取60μg蛋白質樣品用雙向凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜(購自AmershamBiosciences公司)上，一抗使用兔抗人氨甲酰磷酸合成酶1多克隆抗體(購自Abcam公司，1∶2000)，4℃孵育過夜，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化鈉8g，Tween 20ml，用HCl調節pH到7.6)洗滌三次，每次5分鐘，二抗為抗兔抗體(購自Santa Cruz公司，1∶10000)，室溫孵育1小時，再用TBST洗滌三次，每次10分鐘，最后用ECL plus試劑(Amersham Biosciences)反應5分鐘后，以X-光片曝光檢測，檢測結果如圖3所示。
其中，病例3 17癌組織與3 17癌旁組織樣品進行了雙向凝膠電泳的免疫印跡分析，發現氨甲酰磷酸合成酶1的不同的翻譯后修飾形式在癌組織中也有下調表達(圖3)，并且這一結果與雙向凝膠電泳銀染圖譜是相互吻合的(圖1)，進一步提示氨甲酰磷酸合成酶1不同的翻譯后修飾形式也是重要的變化指標。
綜上所述，氨甲酰磷酸合成酶1在肝細胞癌的癌組織及癌旁組織中存在差異表達，顯然與肝細胞癌的發生發展有著密切的相關性，因此，以氨甲酰磷酸合成酶1作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用于檢測肝細胞癌。相應的，特異性抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體，包括各種抗氨甲酰磷酸合成酶1的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測氨甲酰磷酸合成酶1的表達量，因而可以用于檢測肝癌，或者用于制備檢測肝癌的制劑或試劑盒等，這對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。
雖然有關氨甲酰磷酸合成酶1動態的生物學功能及腫瘤相關機制還有待進一步研究，但是將其作為檢測肝癌的標記物卻是肯定的。氨甲酰磷酸合成酶1可作為肝細胞癌的潛在標志，而其在胞內的生物學功能提示氨甲酰磷酸合成酶1可能作為肝癌的預后分子標記和臨床治療的靶分子。
權利要求
1.一種氨甲酰磷酸合成酶1的應用，其特征在于，用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述用作檢測肝癌的蛋白質分子標記是檢測該蛋白在肝細胞組織中的表達量。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測該蛋白在肝細胞組織中的表達量是檢測該蛋白在肝細胞組織中是否存在下調表達。
4.一種抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體的應用，其特征在于，用于制備檢測肝癌的制劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體的應用，其特征在于，用于制備檢測肝癌的試劑盒。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.一種體外檢測肝細胞組織中氨甲酰磷酸合成酶1的表達是否異常的方法，其特征在于包括以下步驟A、用特異性抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體檢測待測肝細胞中氨甲酰磷酸合成酶1的數量；B、將步驟A測得的氨甲酰磷酸合成酶1的數量與正常肝組織中的氨甲酰磷酸合成酶1的數量進行比較，如測得的蛋白數量低于正常值，則表示被檢測肝組織中氨甲酰磷酸合成酶1的表達異常。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述抗氨甲酰磷酸合成酶1的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發明通過篩選在肝細胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達的蛋白，找到了一種在肝細胞癌的癌組織中低表達的蛋白，免疫印跡實驗進一步證實了氨甲酰磷酸合成酶1的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達，同時雙向凝膠電泳的免疫印跡進一步證實氨甲酰磷酸合成酶1的不同的翻譯后修飾形式在癌組織中也有差異表達。鑒于氨甲酰磷酸合成酶1與肝細胞癌的這種相關性，該蛋白可以用作檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記。
文檔編號G01N33/577GK1920052SQ20051002915
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月26日 優先權日2005年8月26日
發明者曾嶸, 李辰, 周曉, 袁新雨 申請人:中國科學院上海生命科學研究院