專利名稱:一種血管緊張素i轉換酶抑制劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及血管緊張素I轉換酶抑制劑，一種血管緊張素I轉換酶抑制肽以及它的類似物，或者其鹽類中的一種所構成的ACE抑制劑。
背景技術：
高血壓是最常見的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是引起腦卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，嚴重威脅著人類的健康。因此，治療和預防高血壓對提高人類的健康水準，延長壽命有著重要的意義。
血管緊張素I轉換酶(ACE)在人體腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統中，對血壓調節起著重要的作用。ACE可以將血管緊張素I轉換為血管緊張素II，使周圍小動脈、血管平滑肌收縮，同時刺激醛固酮分泌，促進人體腎臟對Na+、K+的重吸收，引起鈉儲量和血容量的增加，使血壓升高；還可以使舒緩激肽失活，引起血壓升高。
綜上所述，ACE一方面產生使血壓上升的血管緊縮素II，另一方面，使具有血管舒張作用的舒緩激肽失活，這都造成了血壓的上升。所以，如果抑制了ACE的活性，就可以起到降壓的作用。
現有的作為治療高血壓的合成物卡普托利就是ACE的抑制劑，但它有很多副作用，所以源于食品蛋白中的ACE抑制肽因其無毒副作用，同時具有其它療效而被廣泛應用，市場前景極好。

發明內容本發明提供一種來源于食品的、高安全性的、廉價的、可產業化生產的血管緊張素I轉換酶ACE抑制劑及其應用。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種血管緊張素I轉換酶抑制劑，其具有序列表SEQ ID NO1中氨基酸序列。
其是從珠蛋白的胃蛋白酶水解液中經過一系列分離、純化獲得的活性單肽，高效毛細管電泳鑒定純度大于95％，基體輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-MS)和電噴霧串聯質譜(ESI-MS/MS)測定此活性肽的分子量為1554道爾頓，其氨基酸序列為Leu-Gly-Phe-Pro-Thr-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Pro-His-Phe(LGFPTTKTYFPHF)，它對ACE有很好的抑制作用；由氨基酸璇光度不同而定義為L型氨基酸和D型氨基酸所形成的不同構型的十三肽。
所述抑制劑為活性單肽，其活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物可用于制備治療和預防高血壓的藥物。
所述抑制劑活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物可按常規方法生成它們相應的鹽，其鹽可用于制備治療和預防高血壓的藥物。
上述肽及與單肽同源性80％以上的衍生物的鹽類可以用通常的方法生產。公認的與酸反應產生的鹽類，比如說鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸等無機酸；蟻酸，乙酸，丙酸，甘氨膽酸，蘋果酸，檸檬酸，酒石酸，琥珀酸等有機酸等形成的鹽類；公認的與金屬離子形成的鹽類，包括鈉鹽，鉀鹽，鈣鹽，銨鹽；以及氨基乙醇，三乙氨，二環乙氨等形成的胺類鹽等沒有特別的限制。
所述藥物的劑型可為單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物，及其鹽與充填劑所形成的各種形式的散劑，顆粒劑，片劑，膠囊，水溶液，懸浮液，乳化液，噴劑或粉劑等，通過口腔攝取或者是注射液的形式使用；使用量是沒有特別的限制，具體的要根據高血壓的程度，患者的年齡，體重，身體狀況和給與的方法等因素，適當地確定；藥物可制成各種制劑，其使用時可以采取經口腔或非經口腔的投入方法；非經口腔的投入可以采取皮下注射、靜脈注射、或肛腸投入等；注射液的制作可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、安定劑、防腐劑、懸浮劑或乳化劑等。
所述活性單肽，其活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物、或它們相應的鹽，可以添加到各種食品當中，制成抑制血壓的保健食品；食品的形態可以是清涼飲料，乳酸飲料，調味品，湯類，奶酪，火腿，點心等。
本發明具有如下優點1.廉價、可產業化生產。本發明原料來源廣泛，分離方法簡單，成本低。
2.應用效果好。本發明應用現代分子生物技術對珠蛋白進行酶解，對具有ACE抑制活性較強的部分進行分離純化，對純化得到的肽進行氨基酸序列分析；并研究了此肽在體內對ACE的抑制活性，其主要作用于腎素-血管緊縮素系統中的血管緊縮素I轉換酶(angiotensin I coverting enzyme，略稱為ACE)，抑制了它的活性，阻止了血管緊縮素I轉換成血管緊縮素II，結果表明此肽有很好的降血壓效果。本發明活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物、或它們相應的鹽中的任意一種成份均作為血管緊縮素I轉換酶抑制劑。從而可以降低動物血壓，或者抑制動物血壓的升高趨勢。
3.來源于動物食品、高安全性。可以將本發明活性肽及其衍生物、或它們的鹽類作為高血壓患者的長期治療藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。
圖1為珠蛋白酶解液用Sephadex G-25柱子洗脫時的洗脫曲線；圖2為珠蛋白酶解液在RP-HPLC上的洗脫曲線；圖3為靜脈注射不同劑量的抑制劑后高血壓大鼠的收縮壓變化隨時間變化曲線。
具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的闡述實施例1一種血管緊張素I轉換酶抑制劑，具有序列表SEQ ID NO1中氨基酸序列；其氨基酸序列為Leu-Gly-Phe-Pro-Thr-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Pro-His-Phe(LGFPTTKTYFPHF)；(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度13aa*類型肽*鏈型直鏈*拓撲結構線性(b)分子類型PRT(C)最初來源豬的血紅蛋白(porcine hemoglobin)的α-chain(34-46)。
其制備過程如按常規方法進行血紅素的分離新鮮豬血加0.8％的檸檬酸三鈉(防止血液凝集)，攪拌均勻后，3000r/min離心，取血球(沉淀部分)加等量的蒸餾水，攪拌30分鐘后，血球溶血，加5倍體積的含3％HCl的丙酮溶液，攪拌靜置后，過濾，取沉淀部分，噴霧干燥后即得珠蛋白粉末。(參考文獻周淡宜，徐水祥，周敏子.血紅素制備工藝的實驗研究.藥物生物技術.2002，9(2)103-104.)稱取珠蛋白粉末3g溶于100ml的磷酸緩沖液中，加入1％(酶與底物比)的胃蛋白酶，在37℃和pH2的條件下酶解12小時，反應結束后，在100℃下加熱10min，終止酶解，用NaOH溶液調節酶解液成中性；將酶解液經過截留率為10kDa分子量的膜超濾后，經真空濃縮儀濃縮至20ml，將20ml濃縮液通過Sephadex G-25凝膠過濾柱進行分離，每20分鐘接收一管，每管在波長為280nm下檢測吸光度，得到如圖1的洗脫曲線，由圖知，分離得到五個部分，將每一部分混合在一起冷凍干燥，然后對這五個部分分別進行對ACE抑制活性的測定，這五部分在相同的濃度下對ACE的抑制率五區最大，所以對5區在RP-HPLC上進行進一步的分離，在RP-HPLC上用Hypersil C18柱，流動相A液為0.1％TFA+0％乙腈的水溶液，用前超聲脫氣；流動相B液為0.1％TFA+100％乙腈的水溶液，檢測波長215nm，室溫，進樣體積20μl，采用梯度洗脫，按時間收集；洗脫梯度0-60minA液100％-50％線性降低，B液0％-50％線性升高；60-80minA液0％，B液100％。
如圖2所示，其中得到A組分有很好的ACE抑制活性，然后對A組分用基體輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-MS)和電噴霧串聯質譜(ESI-MS/MS)進行分析，測定此活性肽的分子量為1554道爾頓，其氨基酸序列為Leu-Gly-Phe-Pro-Thr-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Pro-His-Phe(LGFPTTKTYFPHF)，來源于豬的血紅蛋白的α-chain 34-46實施例2 動物實驗選擇自發性高血壓大鼠為實驗模型，大鼠飼養一周后，將其分組，每組八只，用50-200mg/kg劑量的純肽靜脈注射，采用尾部測壓的方法每隔30分鐘測量一次血壓，一直測到180分鐘。
如圖3所示，結果表明，用50mg/kg的劑量注射30分鐘后對照組大鼠的血壓保持172±5mm Hg，而治療組自發性高血壓大鼠的血壓從172±5mmHg降至150±6mm Hg明顯下降，下降了21.9±3.3mm Hg，最大抑制效果出現在60分鐘后，血壓降到最低(146±5.7mm Hg)。用50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的劑量用同樣的大鼠只數和同樣的方法進行實驗，結果表明隨著注射量的增加，血壓的降低呈劑量依賴關系(如圖所示)。由此可知此肽具有很好的降血壓效果。
緊張素ISEQUENCE LISTING<110>中國科學院大連化學物理研究所<120>一種血管緊張素I轉換酶抑制劑及其應用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13<212>PRT<213>豬的血紅蛋白(porcine hemoglobin)<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(13)<223>
<400>1Leu Gly Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe1 5 10
權利要求
1.一種血管緊張素I轉換酶抑制劑，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中氨基酸序列。
2.一種權利要求
1所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于權利要求
1所述抑制劑為活性單肽，其活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物用于制備治療和預防高血壓的藥物。
3.按照權利要求
2所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于所述抑制劑活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物可按常規方法生成它們相應的鹽，其鹽可用于制備治療和預防高血壓的藥物。
4.按照權利要求
3所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于所述鹽為活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物與酸反應產生的鹽，或它們與金屬離子形成的鹽，或與氨基乙醇、三乙或二環乙氨反應形成的胺類鹽。
5.按照權利要求
3所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于所述酸為鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、蟻酸、乙酸、丙酸、甘氨膽酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或琥珀酸；與金屬離子形成的鹽為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或銨鹽。
6.按照權利要求
2或3所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于所述藥物的劑型可為單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物及其鹽與充填劑所形成的各種形式的顆粒劑，片劑，膠囊，水溶液，懸浮液，乳化液，噴劑或粉劑。
7.按照權利要求
2或3所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于所述藥物可制成各種制劑，其使用時可以采取經口腔或非經口腔的投入方法；非經口腔的投入可以采取皮下注射、靜脈注射、或肛腸投入；注射液的制作可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、安定劑、防腐劑、懸浮劑或乳化劑。
8.一種權利要求
1所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于權利要求
1所述抑制劑為活性單肽，其活性單肽或與單肽同源性80％以上的衍生物、或它們相應的鹽，可以添加到各種食品當中，制成抑制血壓的保健食品。
9.按照權利要求
8所述血管緊張素I轉換酶抑制劑的應用，其特征在于食品的形態可以是液體的清涼飲料、乳酸飲料、調味品或湯類，也可以是固體的奶酪、火腿或點心。
專利摘要
本發明涉及血管緊張素I轉換酶抑制劑及其應用，其具有序列表SEQID NO1中氨基酸序列。本發明應用現代分子生物技術對珠蛋白進行酶解，對具有ACE抑制活性較強的部分進行分離純化，對純化得到的肽進行氨基酸序列分析，并研究了此肽在體內對ACE的抑制活性，結果表明此肽有很好的降血壓效果。因此，可以將此活性肽及其衍生物或者其鹽類作為高血壓患者的長期治療藥物，或者作為食品添加劑制成保健食品。
文檔編號A61K9/10GK1994464SQ200510136788
公開日2007年7月11日 申請日期2005年12月31日
發明者胡建恩, 杜昱光, 余奕珂, 白雪芳, 譚成玉, 王佳培 申請人:中國科學院大連化學物理研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan