專利名稱:帶正電高分子膠束與其形成方法
技術領域：
本發明涉及一種帶正電高分子膠束與其形成方法，本發明還涉及一種帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，本發明又涉及一種帶正電高分子膠束基因載體的形成方法。
背景技術：
光動力治療法(photodynamic therapy)是一種新興的癌癥治療方式，其治療方法是將感光藥物(photosensitizer)注射至體內，讓藥劑附著在腫瘤細胞累積的血液蛋白中，使蛋白質將感光藥物輸送至腫瘤中，再以激光光源或其它光源激發細胞內的感光藥物，使感光藥物受光子的激發而產生光化學作用，當感光藥物由激態回復到基態的過程中，所釋放能量可與細胞內的氧分子結合，將血液中的氧分子由3O2激發成1O2狀態，形成單相氧分子或自由基，并破壞細胞內微細結構，如細胞膜、線粒體或核膜等，進而對細胞本體或細胞的重要結構造成傷害，進而使細胞死亡。但此類藥物常為疏水性，所以難以被人體所吸收。
為解決上述問題，近期已發展出許多種藥物載體將藥物輸送治身體中，其一為膠束藥物載體，但此膠束藥物載體將藥物輸送至細胞中的比例依然有待改善。
因此，業界亟需提出一種膠束藥物載體，以提高藥物輸送至細胞的比例。

發明內容有鑒于此，本發明的目的之一就是提供一種帶正電高分子膠束與其形成方法以及帶正電高分子膠束藥物與基因載體的形成方法。
為達上述目的，本發明提供一種帶正電高分子膠束的形成方法，包括將多個兩性高分子聚合物聚集形成高分子膠束；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在高分子膠束外層上，以形成帶正電高分子膠束。
為達上述目的，本發明還提供一種帶正電高分子膠束，包括高分子膠束，該高分子膠束是由多個兩性高分子聚合物所聚集而成；以及正電性修飾劑，該正電性修飾劑化學接枝于高分子膠束上，以形成帶正電高分子膠束。
為達上述目的，本發明又提供一種帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，包括混合多個兩性高分子聚合物與藥物，使這些兩性高分子聚合物聚集，以形成包覆藥物的高分子膠束藥物載體；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在高分子膠束藥物載體外層上，以形成帶正電高分子膠束藥物載體。
為達上述目的，本發明另提供一種帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，包括混合多個兩性高分子聚合物與基因，使這些兩性高分子聚合物聚集，以形成包覆基因的高分子膠束基因載體；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在高分子膠束基因載體外層上，以形成帶正電高分子膠束基因載體。
本發明是以化學修飾方法制備帶正電性的高分子膠束作為光動力治療藥物傳輸系統，由于細胞膜是帶負電性，因此會吸引帶正電性的高分子膠束，以增加膠束被細胞胞吞作用，進而提高藥劑累積于細胞的量，且能達50％以上的細胞致死量。
圖1A-圖1C為一系列示意圖，用以說明本發明形成帶正電高分子膠束的形成方法。
圖2A-圖2B為比較實施例1的熒光顯微鏡圖。
圖3A-圖3B為本發明實施例1的熒光顯微鏡圖。
圖4為比較實施例1與本發明實施例3-5的光動力效果圖。
具體實施方式帶正電高分子膠束與其形成方法為使本發明更容易地被了解，故先說明膠束(micelle)的形成機制兩性(amphiphilic)高分子是一種表面活性劑，當水中兩性高分子濃度很低時，兩性高分子會吸附在空氣和水的界面，通過親水端與水水合，以降低表面張力，此時溶液中的兩性高分子幾乎是以單體存在；當兩性高分子濃度提高至界面吸附飽和量時，未能吸附在界面的兩性高分子會以親水端朝外、疏水端朝內的方式自組裝(self assembly)成膠束，如圖1B所示，此時兩性高分子的濃度即為臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)。
一般而言，實際中如果想形成膠束，則需要參考每個表面活性劑、水相與油相的三相圖的膠束形成區的位置，再根據此區所示的濃度來配置溶液而形成膠束，且膠束區的位置隨所使用的表面活性劑材料、水相材料、油相材料與溫度等因素而改變，故下列實施內容的兩性高分子所使用的量請參考其三相圖來決定。
本發明的帶正電高分子膠束30的形成方法如圖1A-圖1C所示，將于如下作詳細說明請參閱圖1A與圖1B，首先將多個兩性高分子聚合物10與油相、水相混合，并使兩性高分子聚合物10的濃度高于臨界膠束濃度，以使多個兩性高分子聚合物10自組裝形成高分子膠束20。其中兩性高分子聚合物10為生物相容性兩性高分子材料，以適用于人體中，如聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚己內酯(polycaprolactone，PCL)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolicacid，PGA)、聚乳酸/羥基乙酸(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)等。
接下來利用化學修飾方式在膠束的外層將正電性修飾劑R接枝在高分子膠束20外層上，如圖1C所示，以形成帶正電高分子膠束30，而所使用的正電性修飾劑R必須在接枝后使高分子膠束30帶正電，以達本發明的目的，其中正電性修飾劑R包括正電性分子或正電性目標配基(targeting ligand)，如胺類化合物(amines)，而胺類化合物包括單胺類化合物或二胺類化合物(diamines)或多胺類化合物(polyamine)，其中單胺類化合物包括乙胺(ethylamine)、丙胺(propylamine)、丁胺(butylamine)、戊胺(pentylamine)、己胺(hexylamine)、庚胺(heptylamine)、辛胺(octylamine)、壬胺(nonylamine)、癸胺(decylamine)、十一胺(undecylamine)、十二胺(dodecylamine)等，而二胺類化合物(diamines)包括乙二胺(diaminoethane)、丙二胺(diaminopropane)、丁二胺(diaminobutane)、戊二胺(diaminopentane)、己二胺(diaminohexane)、庚二胺(diaminoheptane)、辛二胺(diaminooctane)、壬二胺(diaminononane)、癸二胺(diaminodecane)、十一烷二胺(diaminoundecane)、十二烷二胺(diaminododecane)或2’-亞乙二氧基二乙胺(2’-(ethylenedioxy)diethylamine)；多胺類化合物包括聚氮丙啶(polyethylenimine)、肽、多熔素(polylysine)、聚精氨酸(polyarginine)等，而正電性目標配基包括細胞膜、細胞核膜等。
此外，尚可將藥物或基因置于上述的帶正電高分子膠束30中，以形成帶正電高分子膠束藥物載體或帶正電高分子膠束基因載體；其中藥物可為感光藥物(photosensitizer)，如原卟啉IX(Protoporphyrin IX)(血卟啉衍生物(Hematoporphyrinderivatives)，5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid))等。其形成方式將于以下敘述。
帶正電高分子膠束藥物或基因載體的形成方法首先將藥物或基因溶于油相中，再與多個兩性高分子聚合物和水相混合，以使兩性高分子聚合物聚集，形成包覆藥物的高分子膠束藥物載體或包覆該基因的高分子膠束基因載體；接著再以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在高分子膠束藥物載體或高分子膠束基因載體外層上，以形成帶正電高分子膠束藥物載體或帶正電高分子膠束基因載體，使藥物或基因更容易進入細胞或特定目標中。
上述利用化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在高分子膠束藥物載體或高分子膠束基因載體外層上的方式包括下列幾種方式將0.25當量、0.5當量、0.75當量、1當量、2.0當量正電性修飾劑與膠束外層的羧基、胺基、醛基或羥基在有機溶劑中直接進行接枝反應72h，其中有機溶劑包括DMF(二甲基甲酰胺)、H2O，以形成帶正電高分子膠束藥物載體或帶正電高分子膠束基因載體。或是先使膠束與0.25當量、0.5當量、0.75當量、1當量、2當量交聯劑在有機溶劑下進行反應24h，以使膠束表面官能化，其中該有機溶劑包括DMF，而催化劑包括1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)，交聯劑2，2’-亞乙二氧基二乙胺(2，2’-(ethylenedioxy)diethylamine)，接著再加入0.25當量、0.5當量、0.75當量、1當量、2.0當量帶正電修飾劑與官能化的膠束反應72h，以形成帶正電高分子膠束藥物載體或帶正電高分子膠束基因載體。
以上所述的兩性高分子聚合物、正電性修飾劑等與帶正電高分子膠束的形成方法所述相同，故不再贅述。
再者，膠束的尺寸并無特定限制，視所承載的藥物與基因而定，但一般為30-500nm。
為使本發明的上述和其他目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，并配合所附圖式，作詳細說明如下實施例1制備PCL-b-PAA將聚丙烯酸-b-聚己內酯(poly acrylic acid-b-polycaprolactone，PCL104-b-PAA41)溶解在2mg/mL四氫呋喃(THF)中，再以每小時30ml的速率加入等體積的水，攪拌18小時后透析3天，再以移除THF。
接下來再將透析完的膠束溶液加入催化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺，反應1小時后再加入交聯劑2’-亞乙二氧基二乙胺，反應3天，以得到PCL-b-PAA膠束。
實施例2制備PCL-b-PAA/PpIX將20∶1的聚丙烯酸-b-聚己內酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)與感光藥物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氫呋喃(THF)中，再以每小時30ml的速率加入等體積的水，攪拌18小時后透析3天，再以移除THF。
接下來再將透析完的膠束溶液加入催化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺，反應1小時后再加入交聯劑2’-亞乙二氧基二乙胺，反應3天，以得到PCL-b-PAA/PpIX膠束。
實施例3制備C4H7(NH2)2-PCL-b-PAA/PpIX將20∶1的聚丙烯酸-b-聚己內酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)與感光藥物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氫呋喃(THF)中，再以每小時30ml的速率加入等體積的水，攪拌18小時后透析3天，再以移除THF。
接下來再將透析完的膠束溶液加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺，反應1小時后再加入2’-亞乙二氧基二乙胺，反應3天，以得到帶正電的C4H7(NH2)2-PAA-b-PCL/PpIX膠束。
實施例4制備PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX將20∶1的聚丙烯酸-b-聚己內酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)與感光藥物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氫呋喃(THF)中，再以每小時30ml的速率加入等體積的水，攪拌18小時后透析3天，再以移除THF。
接下來再將透析完的膠束溶液加入催化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺，反應1小時后再加入交聯劑2’-亞乙二氧基二乙胺，反應3天后再透析三天，再將得到的產物用催化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺活化，1小時后再加入N-(4-氨丁基)氨基甲酸叔丁酯(N-(4-aminobutyl)carbamicacid t-butyl ester)反應72h，透析后再加入TFA反應30分鐘去保護，以得到帶正電的PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX膠束。
實施例5制備FITC標記的PCL-b-PAA-丁二胺/PpIX納米籠(FITC-Labeled PCL-b-PAA-Butyldiamine/PpIXNanocage)(PNF)將20∶1的聚丙烯酸-b-聚己內酯(poly acrylic acid-b-poly caprolactone，PCL104-b-PAA41)與感光藥物原卟啉IX(PpIX)溶解在2mg/mL四氫呋喃(THF)中，再以每小時30ml的速率加入等體積的水，攪拌18小時后透析3天，再以移除THF。
接下來再將透析完的膠束溶液加入催化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺，反應1小時后再加入交聯劑2’-亞乙二氧基二乙胺0.25摩爾(相較于COOH基)，反應3天后再透析三天，再將得到的產物用催化劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺活化，1小時后再加入N-(4-氨丁基)氨基甲酸叔丁酯反應72h，透析后再加入TFA30分鐘去保護，以得到帶正電的PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX膠束。將PCL-b-PAA-C4H8NH2/PpIX與異硫氰酸熒光素(fluorescein Isothiocyanate，FITC)在0.1M、pH9的磷酸緩沖溶液下反應72小時，透析三天后得到FITC-標記的PCL-b-PAA-丁二胺/PpIX納米籠(PNF50％)。
評估方法將膠束/感光藥物加入細胞培養皿中，利用熒光顯微鏡于不同的時間點觀察感光藥物于細胞內分布的情形(紅光)。
圖2A與圖2B為比較實施例1的熒光顯微鏡圖，由熒光顯微鏡觀察發現，將PAA-b-PCL膠束給予人類子宮頸癌細胞株HeLa細胞后，膠束累積在細胞間隙(cell junction)，無法進入細胞，可能是因為PAA帶負電，與細胞膜電位相互排斥，因此膠束不易貼近細胞表面，因此細胞不易產生胞吞作用(endocytosis)。
圖3A與圖3B為實施例1的熒光顯微鏡圖，由熒光顯微鏡觀察發現，帶正電膠束明顯進入細胞中，除了有聚集現象外，細胞質內也有熒光產生。
光動力效果的評估是用635nm波長的光照射，利用快速微量自動比色分析(MTT)探討感光藥物對癌細胞生長情形及毒性的影響。
圖4為實施例3-5與比較實施例1的光動力效果圖，橫軸的數字1、2、3分別代表照光劑量0J、0.33J、0.66J，縱軸代表細胞存活率(％)。結果發現實施例3與4的帶正電膠束在照光劑量為0.33J時，細胞的致死率就達到約就50％，且實施例3的效果最好，達到52％；而實施例5與比較實施例1的未帶正電膠束在照光劑量為0.66J下僅分別殺死了16％及8％的細胞。
因此本技術是以化學修飾方法制備帶正電性的高分子膠束作為光動力治療藥物傳輸系統，由于細胞膜是帶負電性，因此會吸引帶正電性的高分子膠束，以增加膠束被細胞胞吞作用(endocytosis)，進而提高藥劑累積于細胞的量，且能達50％以上的細胞致死量。
以上所述僅為本發明較佳實施例，然其并非用以限定本發明的范圍，任何熟悉本項技術的人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，可在此基礎上做進一步的改進和變化，因此本發明的保護范圍當以本申請的權利要求
書所界定的范圍為準。
附圖中符號的簡單說明如下10兩性高分子聚合物20高分子膠束30帶正電高分子膠束R正電性修飾劑
權利要求
1.一種帶正電高分子膠束的形成方法，包括將多個兩性高分子聚合物聚集形成高分子膠束；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在該高分子膠束外層上，以形成帶正電高分子膠束。
2.根據權利要求
1所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其特征在于，該兩性高分子聚合物為生物相容性兩性高分子材料。
3.根據權利要求
2所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其特征在于，該生物相容性兩性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己內酯、聚乳酸。
4.根據權利要求
1所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其其特征在于，該正電性修飾劑包括正電性分子或正電性目標配基。
5.根據權利要求
1所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其特征在于，該正電性修飾劑包括胺類化合物。
6.根據權利要求
5所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其特征在于，該胺類化合物包括單胺類化合物或二胺類化合物。
7.根據權利要求
6所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其特征在于，該單胺類化合物包括丁胺。
8.根據權利要求
6所述的帶正電高分子膠束的形成方法，其特征在于，該二胺類化合物包括丁二胺或2’-亞乙二氧基二乙胺。
9.一種帶正電高分子膠束，包括高分子膠束，該高分子膠束由多個兩性高分子聚合物所聚集而成；以及正電性修飾劑，該正電性修飾劑化學接枝于該高分子膠束上，以形成帶正電高分子膠束。
10.根據權利要求
9所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，該兩性高分子聚合物為生物相容性兩性高分子材料。
11.根據權利要求
10所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，該生物相容性兩性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己內酯、聚乳酸。
12.根據權利要求
9所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，該正電性修飾劑包括胺類化合物。
13.根據權利要求
12所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，該胺類化合物包括單胺類化合物或二胺類化合物。
14.根據權利要求
9所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，其還包括藥物或基因位于該帶正電高分子膠束中。
15.根據權利要求
14所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，該藥物為感光藥物。
16.根據權利要求
15所述的帶正電高分子膠束，其特征在于，該感光藥物包括原卟啉IX。
17.一種帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，包括混合多個兩性高分子聚合物與一藥物，使這些兩性高分子聚合物聚集，以形成包覆該藥物的高分子膠束藥物載體；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在該高分子膠束藥物載體外層上，以形成帶正電高分子膠束藥物載體。
18.根據權利要求
17所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該兩性高分子聚合物為生物相容性兩性高分子材料。
19.根據權利要求
18所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該生物相容性兩性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己內酯、聚乳酸。
20.根據權利要求
17所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該正電性修飾劑包括正電性分子或正電性目標配基。
21.根據權利要求
17所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該正電性修飾劑包括胺類化合物。
22.根據權利要求
21所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該胺類化合物包括單胺類化合物或二胺類化合物。
23.根據權利要求
22所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該單胺類化合物包括丁胺。
24.根據權利要求
22所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該二胺類化合物包括丁二胺或2’-亞乙二氧基二乙胺。
25.根據權利要求
17所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該藥物為感光藥物。
26.根據權利要求
25所述的帶正電高分子膠束藥物載體的形成方法，其特征在于，該感光藥物包括原卟啉IX。
27.一種帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，包括混合多個兩性高分子聚合物與一基因，使這些兩性高分子聚合物聚集，以形成包覆該基因的高分子膠束基因載體；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在該高分子膠束基因載體外層上，以形成帶正電高分子膠束基因載體。
28.根據權利要求
27所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該兩性高分子聚合物為生物相容性兩性高分子材料。
29.根據權利要求
28所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該生物相容性兩性高分子材料包括聚丙烯酸、聚乙二醇、聚己內酯、聚乳酸。
30.根據權利要求
27所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該正電性修飾劑包括正電性分子或正電性目標配基。
31.根據權利要求
27所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該正電性修飾劑包括胺類化合物。
32.根據權利要求
31所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該胺類化合物包括單胺類化合物或二胺類化合物。
33.根據權利要求
32所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該單胺類化合物包括丁胺。
34.根據權利要求
32所述的帶正電高分子膠束基因載體的形成方法，其特征在于，該二胺類化合物包括丁二胺或2’-亞乙二氧基二乙胺。
專利摘要
本發明涉及帶正電高分子膠束與其形成方法，以及帶正電高分子膠束藥物與基因載體的形成方法。一種帶正電高分子膠束的形成方法，包括將多個兩性高分子聚合物聚集形成高分子膠束；以及以化學修飾方式將正電性修飾劑接枝在高分子膠束外層上，以形成帶正電高分子膠束。本發明以化學修飾方法制備帶正電性的高分子膠束作為光動力治療藥物傳輸系統，以增加膠束被細胞胞吞作用，進而提高藥劑累積于細胞的量。
文檔編號A61K47/48GK1990046SQ200510136574
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日
發明者陳俊男, 謝銘鈞, 賴建勛, 賴秉杉 申請人:財團法人工業技術研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan