一種硫辛酸修飾的納米多肽載體及其制備方法和應用
【技術領域】：
[0001 ]本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種硫辛酸修飾的納米多肽載體及其制備方 法和應用。
【背景技術】：
[0002] 乳腺癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，目前臨床對其治療仍以手術為主，同時 配合放射治療、化療藥物治療(簡稱化療)進行綜合治療，其中化療在乳腺癌治療中起著關 鍵作用，但臨床應用中乳腺癌細胞多存在多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)現象， 從而導致化療的失敗。因此，逆轉乳腺癌耐藥成為關鍵技術。納米技術的引入，不僅實現了 腫瘤的靶向性治療、降低了毒副作用，而且有效的實現了耐藥乳腺癌細胞的逆轉。因此，制 備一種能靶向性治療乳腺癌耐藥的納米遞藥系統具有非常重要的意義。
[0003] 納米藥物輸送系統是于20世紀60年代開始發展的一種新型給藥系統。納米粒子也 叫超微顆粒，最常見的是固體膠體粒子制成的高分子材料，范圍的大小從1到ΙΟΟΟηπι(Ιμπι)， 有時也認為粒子在1至200納米范圍內。納米材料顆粒與多數大蛋白（也為納米級）大小相 仿，在體內不易作為異物受到排斥，加之可對納米材料進一步生物兼容性官能團化，更易滿 足藥物載體在組織、血液、免疫等生物兼容性方面的要求。
[0004] 膠束(micelles)亦稱膠團，是過量的表面活性劑在水中自組裝形成的膠體溶液， 表面活性劑分子締合形成膠束時的最低濃度稱為臨界膠束濃度(CMC)。文獻中常將膠束形 成的過程稱為"自組裝"。納米膠束是由具有親水基團和疏水基團的兩親嵌段共聚物在水中 自組裝形成的納米級大小的核一殼型膠束。
[0005] 由于腫瘤治療的難度和復雜性，化療藥物和基因藥物的協同傳遞系統成為近年來 腫瘤治療研究的熱點。共遞送系統能提尚轉染效率，提尚藥物療效的協同效應，從而提尚腫 瘤治療的療效。化療藥物和基因藥物的運輸的挑戰之一是這些共同遞送系統的設計和開 發。有效的輸送系統可以跨越各種障礙，藥物遞送到體內細胞內而產生抗腫瘤作用。因此， 這些傳遞系統必須具有多種功能，而且必須長期穩定、專一，并且能夠提高內涵體逃逸。
[0006] 多肽類載體主要是指各種細胞穿透肽。其在基因治療方面因其高效傳遞基因物質 的能力及低毒性，容易制備而在過去20多年中成為研究熱點。研究發現，多肽類載體中的精 氨酸因其表面富集的正電荷可有效地吸附帶負電荷的基因物質而形成粒徑小，結構穩定的 載體/基因復合物（Farkhani，S.M.，Valizadeh，A.，Karami，H.，Mohammadi，S.，Sohrabi， N.,&Badrzadeh,F.Cell penetrating peptides: efficient vectors for delivery of nanoparticles ,nanocarriers , therapeutic and diagnostic molecules . Peptides , 2014,57:78-94.)〇
[0007] 納米膠束通過細胞內吞作用進入細胞后被內吞體吞噬，進而與溶酶體融合，基因 藥物在進入溶酶體后容易被溶酶體中的酶降解，因此，基因物質只有在內涵體和溶酶體中 逃逸出來才能發揮作用。研究報道，組氨酸具有"質子海綿效應"而具有內吞體逃逸的能力。 本研究采用精氨酸與組氨酸相連的序列連接方式以達到高效轉染、有效逃逸內涵體的目 的。
[0008] 硫辛酸是一種具有分子內五元環二硫鍵結構，末端羧基的兩親性物質，與細胞膜 具有脂質雙分子層具有較好的親和力，具有較好的包載化療藥物的作用，且二硫鍵可在細 胞還原性條件下裂解，為藥物在腫瘤部位的有效釋放提供條件。
[0009] 專利號為CN201210305540.1，公開號為CN102920649A的中國發明專利"載藥納米 膠束及其制備方法和應用"公開了一種載藥納米膠束，其中的納米遞送載體是由兩親性三 嵌段共聚物形成的具有三層結構的復合體，其中，所述兩親性三嵌段共聚物為包含聚乙二 醇衍生物、聚賴氨酸和聚亮氨酸的線性高分子化合物，所述聚賴氨酸的一端通過酰胺鍵與 所述聚乙二醇衍生物相連，另一端通過肽鍵與所述聚亮氨酸相連;所述聚亮氨酸構成所述 復合體的內層，所述聚賴氨酸構成所述復合體的中間層，所述聚乙二醇衍生物構成所述復 合體的外層;所述Bcl_2siRNA分散在中間層的所述聚賴氨酸中；藥物一多烯紫杉醇分散在 內層的所述聚亮氨酸層中。
[0010] 專利申請號為CN201410053888.5,公開號為CN104840968A的中國發明專利申請 "甲基聚乙二醇誦-b-聚D，L-乳酸誦-漏嵌段共聚物載多烯紫杉醇納米膠束制劑"公開了 一種利用兩親性嵌段共聚物甲基聚乙二醇 2_-13-聚D，L-乳酸納米遞送載體。
[0011]目前尚無一種硫辛酸修飾的多肽，并且能夠靶向性治療乳腺癌耐藥的納米遞送載 體。

【發明內容】
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[0012] 本發明的目的在于提供一種可生物降解的，內部空腔包裹化療藥物，外部包載基 因的基因轉染效率高的多肽類納米載體。本發明的另一個目的是提供該納米多肽載體的制 備方法;本發明的第三目的是提供該多肽載體在共載化療藥與基因治療藥物中的應用。
[0013] 本發明所要解決的主要技術問題是:如何提高多肽納米載體引導基因片段進入細 胞的能力，以及如何提高多肽納米載體共載化療藥與基因的能力，同時保證材料具有生物 可降解特性。
[0014] 本發明設計了 一種硫辛酸修飾的多肽類納米載體，由精氨酸、組氨酸、硫辛酸和半 胱氨酸組成的多肽，精氨酸帶正電荷可與帶負電的基因片段結合并具有穿膜作用，組氨酸 因其質子海綿效應而促進基因片段內涵體逃逸，硫辛酸部分可以增加載體與細胞膜的親和 力并可包載化療藥物達到共載，及其自身二硫鍵的交聯而增加載藥及轉染能力，并可在生 物還原性條件下裂解而實現釋藥的目的。
[0015] 本發明的第一個方面，是提供了一種硫辛酸修飾的多肽，所述多肽的氨基酸序列 如下所示：
[0016] HHHRRRRRR(SEQ ID N0:1);氨基酸之間以肽鍵相連，多肽可簡寫為H3R6,縮寫為HR。
[0017] 所述的硫辛酸修飾，是指硫辛酸羧基與組氨酸的氨基以酰胺鍵連接。
[0018] 本發明所述的硫辛酸修飾的多肽可以簡寫為:LA-H3R6，可簡寫為LAHR，其中LA為硫 辛酸，Η為組氨酸，R為精氨酸，LA-H 3R6縮寫為LAHR。
[0019] 進一步地，本發明提供了一種硫辛酸修飾的多肽類可降解納米載體，所述的納米 載體為上述硫辛酸修飾的多肽的聚合物，所述的聚合物的化學結構式如式(I)所示：
[0021 ]所述的硫辛酸修飾的多肽通過半胱氨酸經二硫鍵交聯形成聚合物。
[0022]本發明的Η組氨酸，R精氨酸組成9肽，氨基酸之間以肽鍵連接，英文縮寫為HR;在12 肽的N端，硫辛酸與氨基以酰胺鍵連接，硫辛酸修飾的多肽英文縮寫為LAHR;硫辛酸的巰基 經半胱氨酸氧化交聯形成聚合物，聚合物的英文縮寫為LAHRss。
[0023] 本發明所述的一種硫辛酸修飾的多肽類納米載體，聚合物的分子量優選為3000-30000Da，該分子量之外的聚合物不適宜，會降低基因載體的轉染效率；最優為15000-30000Da〇
[0024] 本發明的第二個方面，是提供了上述的硫辛酸修飾的多肽類可降解納米載體的制 備方法，所述的制備方法包括如下步驟：
[0025] (A)硫辛酸修飾的多肽和合成:合成LA_H3R6;
[0026] (B)硫辛酸修飾的多肽類可降解納米載體的制備:將步驟(A)合成的硫辛酸修飾的 多肽溶于甲醇，加入半胱氨酸鹽酸鹽，使半胱氨酸的比列在5%_20%之間，調節溶液的pH為 7,避光攪拌反映12小時。
[0027] 在本發明的一個優選實施例中，步驟(B)具體為:取硫辛酸修飾的多肽LAHR與半胱 氨酸溶解于甲醇中，使得半胱氨酸的比例在10%之間，加入氫氧化鈉溶液將pH調節至7.0， 攪拌反應12小時，反應溫度為室溫。
[0028] 步驟⑶反應后的溶液，用N2吹干。用腳欠干后的樣品在-20 °C保持。
[0029] 步驟(B)反應后的溶液移入截留分子量為1000的透析袋中，透析液為蒸餾水，透析 12小時。
[0030] 為維持納米載體材料較高的活性，將透析后的溶液冷凍干燥，并保存于-20 °C，納 米材料在復溶后可在4°C長期保存。
[0031] 本發明的第三個方面，是提供了上述的硫辛酸修飾的多肽納米載體共載基因與化 療藥物的耐藥乳腺癌中的應用。
[0032] 所述的應用，是指納米載體中的精氨酸帶正電可以與帶負電的基因進行結合。
[0033] 所述的應用，是指納米載體中的硫辛酸的脂溶性可以包載脂溶性的化療藥物。