專利名稱：：一種有特異靶向并具抗血吸蟲作用的蟲體膜結合短肽zl-4及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物藥品或生物試劑領域，具體涉及一種有特異靶向性并具抗血吸蟲作用的蟲體膜結合短肽ZL-4及其應用。
背景技術：
：長期以來，對腫瘤和病原治療的藥物使用，一直存在一個共同的缺陷藥物在體內使用，分布廣，代謝快，到達耙標部位濃度低，這不僅使藥物的生物利用度很低，而且更重要的是用低劑量藥物不能奏效，用高劑量藥物則會導致對全身的毒性作用，因此，人們早就提出——實現藥物靶向治療思路，即研發對腫瘤或病原有特異結合的分子作為靶向分子，用該分子與藥物偶聯后在人體使用，預期不僅可顯著提高藥物的生物利用度，更重要的是使藥物高濃度集中于耙標部位發揮其藥效作用，減低了藥物對機體全身的毒副反應。因此，前期靶向分子的獲取是十分重要的。目前，用于治療疾病的多肽生物分子很多，如治療糖尿病的胰島素、抗病原微生物的抗菌肽和抗腫瘤藥物的耙向多肽等。前二者已實現合成制備并被廣泛應用于臨床，后者尚屬起步階段，主要利用商品化的噬菌體肽庫來篩選獲得。血吸蟲病是世界70個國家有流行分布的主要熱帶病，在我國流行的日本血吸蟲病屬人畜共患蟲種，防治難度大，因此，盡管經歷50多年防治并取得很大成績，但它仍然在廣闊的湖洲地區流行傳播。其原因預防人畜感染血吸蟲的疫苗尚未問世；抗蟲藥物(吡喹酮和青篙素類)不能解決重復感染問題，而且抗成蟲的藥物療效在下降，抗早期童蟲(感染后1-7d內)藥物尚未發現。因此，繼續探索抗蟲新藥和提高抗蟲效果的方法是當前血防研究的重要課題之一。目前，研究報道比較多的是采用噬菌體隨機多肽庫，以抗體作為探針，來篩選獲得血吸蟲抗原模擬表位用于血吸蟲病疫苗或診斷試劑的研究[舒新華、易新元、曾憲芳等；日本血吸蟲病患者血清對噬菌體隨機7肽庫的免疫篩選；細胞與分子免疫學雜志；2000.16(2):109-112.0uyangL，YiX,ZengX等.Partialprotectioninducedbyphagelibrary-selectedpeptidesmimickingepitopesofSchistosomajaponicura[J].ChinMedJ(Engl),2003，116(1):138-141.ArnonR，TarrabK-HazdaiR，StewardM,etal.AmimotopepeptidebasedvaccineagainstSchistosomamansoni:synthesisandcharacterization.Immunology,2000,101(4):555-562.王欣之,傅志強,黃劭鵬,等.噬菌體展示日本血吸蟲Sjl4單抗的模擬抗原表位及其免疫保護性研究.生物工程學報，2006，22(1):119-124.]，亦有在疫苗研究方面提出免疫靶向概念，但該耙向分子則為特異性的抗體或單鏈抗體[何卓，汪世平，周帥鋒等.抗日本血吸蟲生殖功能分子SIEA2628kDa單鏈抗體與EGFP的融合表達及靶向性研究，中國人獸共患病學報2008,24(8):704-709]。近年也有學者發現有特異性破壞血吸蟲RNA和DNA的垂頭狀核酶基因并證明具有抗血吸蟲作用，但當它單獨在體內使用時不能直接到達蟲體。如能找到理想的特異靶向分子與之偶聯，不僅可解決特異結合到蟲體發揮效應，還有可能達到提高抗蟲效果和減少毒副作用的目的。研究具有特異性靶向性作用的分子包括特異性抗體分子(雙鏈或單鏈)、配體分子和模擬配體的多肽分子或與離子通道結合的多肽分子。前二者(抗體和配體)具有抗原性，在異種生物體內應用具有抗原性，產生免疫反應所表現的副作用，顯然在體內使用不安全，而后者為多肽分子具有使用安全的特點。
發明內容本發明目的一是篩選獲得既具抗蟲作用(含影響蟲體生長發育)又可靶向抗蟲藥物功能的多肽生物分子，以期實現提高抗蟲效果、提高藥物在體內的生物利用度和減少其所致毒副反應；二是篩選獲得能與血吸蟲蟲體產生特異性結合的分子，不僅可用來研究抗蟲藥物-多肽靶向制劑，而且也可用作研究制備特異性基因核酶-多肽靶向系統，用于人、畜血吸蟲病治療。還有可能作為一種試劑或探針用于研究血吸蟲膜的生理特性(如離子通道)，亦有可能將該分4子與放射性元素偶聯用來研究血吸蟲在宿主體內生長發育與移行的生物學規律。一種有特異耙向性并具抗血吸蟲作用的蟲體膜結合短肽ZL-4分子，其氨基酸序列從N—C端依次為酪氨酸Tyr-絲氨酸Ser-甘氨酸Gly-亮氨酸Leu-谷氨酰胺Gin-天冬氨酸Asn-絲氨酸Gin=絲氨酸Ser-亮氨酸Leu-精氨酸Arg-亮氨酸Leu-精氨酸Arg。編碼短肽ZL-4的DNA序列從5，一3，端依次為GATCGTTATTCTGAGATTCGGACTTCTTCGACGTTG。所述的短肽ZL-4分子可能有如下幾方面用途(1)生產制備該多肽分子用作抗血吸蟲的制劑。(2)生產制備該多肽分子用作與血吸蟲體膜發生特異結合的靶向分子。根據現行對多肽分子生產或制備的成熟技術，本研究發明認為，對該短肽ZL-4批量生產的技術有三種方法一是根據該分子氨基酸序列可采用多肽合成技術生產；二是根據該分子編碼的核苷酸序列可采用DNA合成與重組技術獲得表達產物；三是利用該分子的噬菌體克隆，感染細菌進行大量擴增獲得。本發明獲得ZL-4多肽分子的篩選方法用商品化噬菌體隨機12肽庫對日本血吸蟲脫尾活蟲體進行差異淘選即按常規法從血吸蟲感染性釘螺釋放并收集尾蚴，無菌洗滌，分成兩份一份用于逆向吸附肽庫；另一份用6號針頭注射器反復抽吸法制備機械脫尾童蟲，用于淘選肽庫。淘選方法首先取5.7X101。pfu噬菌體和500±20尾蚴加入15ml試管中置37'C下輕搖150rain,離心收集不與尾呦結合的噬菌體上清，加入500±20脫尾童蟲，在37'C條件下輕搖150min。然后，用TBS-T離心洗滌10次，以棄除不結合噬菌體，進而用PEG/NaCl沉淀收集結合的噬菌體，取2ul感染大腸桿菌進行豐度測定。經過三輪逆向吸附和淘選后，隨機挑選15個陽性噬菌體克隆進行DNA測序，根據領!l序與分析結果獲得3個氨基酸序列不同的多肽分子。為證明此3個分子的對血吸蟲特異性結合能力及對血吸蟲生長發育的影響，采用免疫組化法、感染小鼠體內靶向性檢測以及體內外抗蟲實驗等方法鑒定，結果證明ZL-4分子不僅能與血吸蟲各期蟲體膜發生特異結合，而且有明顯抗蟲作用。這在國內外寄生性蠕蟲5開究領域尚屬首次發現與證實。'用噬菌體12肽庫從血吸蟲脫尾活童蟲表膜篩選出三個不同序列的肽段，分別為ZL-6、ZL-4和ZL-1多肽分子。其中ZL-4多肽對血吸蟲結合率高。用酶免疫免疫組化定位結果顯示ZL-4可與日本血吸蟲脫尾童蟲和成蟲的頭部和體部及切片蟲體膜上發生特異性陽性結合反應；用ZL-4在體內外作三批抗血吸蟲實驗，均證明對血吸蟲生存和生長發育有顯著影響。將ZL-4多J5太分子與數據庫中已知蛋白質的氨基酸序列進行同源性分析，結果發現在人源性(homos鄰iens)、血吸蟲源性(schistosoma),兔源性(rat)、鼠源性(mouse)現有的蛋白質/多肽庫中沒有與本實驗所得短肽序列完全一致或者是有良好同源性的蛋白質分子。這說明該分子不屬于血吸蟲與宿主的蛋白來源，根據其特異結合與抗蟲作用，我們認為有兩種可能機制(1)為血吸蟲膜受體結合的模擬配體分子，(2)為血吸蟲膜上離子通道抑制分子。根據該ZL-4多肽分子的特點和作用功能，只要公開其氨基,列與其所編碼的核苷酸序列，均易于生產制備出，并可作為一種試劑或藥物有進一步研究和開發應用的前景。1.根據己有文獻和專利查閱，尚未發現與本研究發明的ZL-4多肽分子在氨基酸序列與其編碼的核苷酸序列方面相同的分子對日本血吸蟲具有特異性結合的靶向性和抗蟲作用。2.多肽分子的特性ZL-4多肽分子屬于12肽分子，易于批量生產，且不具抗原性，故在人和動物體內使用安全。研究具有特異性靶向性作用的分子包括特異性抗體分子(雙鏈或單鏈)、配體分子和模擬配體的多肽分子或與離子通道結合的多肽分子。前二者(抗體和配體)具有抗原性，顯然在體內使用不安全，而后者為多肽分子具有使用安全特點。3.抗蟲作用的意義迄今為止，在我國用于抗血吸蟲成蟲藥物主要是吡喹酮，抗7-21d童蟲藥主要是青篙素類，尚缺作用于7天以內蟲體的藥物。本研究發明的ZL-4分子抗蟲作用主要對早期童蟲，因此有直接應用價值，但對其效果還有待于通過與其它藥物聯合或分子偶聯用來進一步提高效果。4.根據篩選到的ZL-4多肽分子的特性研究，認為這是一種與血吸蟲可發生特異性結合較好的靶向分子，因此，一是可能利用ZL-4分子靶向特性和抗蟲作用功能，從而實現與各種抗血吸蟲藥物連用或偶聯，建立靶向治療血吸蟲感染/病的制劑或系統；二是可能利用ZL-4分子靶向性特性與有關抗血吸蟲基因核酶偶聯建立基因靶向抗血吸蟲制劑或系統。此外，還有可能作為一種試劑或探針用于研究血吸蟲膜的生理特性(如離子通道)，亦有可能將該分子與放射性元素偶聯用來研究血吸蟲在宿主體內生長發育與移行的生物學規律。圖1為ZL-4分子與血吸蟲早期童蟲膜特異結合免疫組化圖；A為ZL-0(M13KE)反應的陰性結果；B為ZL-4反應的陽性結果。圖2為ZL-4分子與血吸蟲成蟲膜特異結合免疫組化C和Dl切片為ZL-4反應后在蟲體膜上出現陽性結果；D2為HE染色的蟲體切片。圖3為ZL-4分子對血吸蟲呈靶向結合圖注1和3為ZL-0((M13啦)與之反應的陰性結果;2、4、6和8為ZL-4對肝組織內蟲體切片作免疫組化在蟲體膜上可見棕黃色顆粒的陽性反應結果，在肝組織內的陽性反應主要在蟲體周圍附近；5和7為HE染色結果，可見免疫組化陽性反應部位為紅細胞成分。整個切片來源于血吸蟲感染鼠肝組織切片，其內可見血吸蟲肝氣童蟲蟲體。具體實施例方式以下實施方式旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。根據本研究發明提供的ZL-4多肽分子氨基,列，就可采用多肽合成技術進行合成生產，根據本研究發明提供編碼ZL-4多肽分子的核苷酸序列可采用基因合成及重組技術生產出。實施例l:短肽ZL-4分子的篩選用商品化噬菌體隨機12肽庫對日本血吸蟲脫尾活蟲體進行差異淘選即按常規法從血吸蟲陽性釘螺釋放并收集尾呦，無菌洗滌，分成兩份一份用于逆向吸附肽庫；另一份用6號針頭注射器反復抽吸法制備機械脫尾童蟲，用于淘選肽庫。淘選方法首先取5.7xl0115pftl噬菌體和500±20尾呦加入15ml試管中置37。C下輕搖150min，離心收集不與尾蚴結合的噬菌體上清，然后，用TBS-T離心洗滌10次，以棄除不結合噬菌體，進而用PEG/NaCl沉淀收集結合的噬菌體，取2nl感染大腸桿菌進行豐度測定。經過三輪逆向吸附和淘選后，隨機挑選15個陽性噬菌體克隆進行DNA測序，根據測序與分析結果獲得3個氮基酸序列不同的多肽分子。為證明此3個分子的對血吸蟲特異性結合能力及對血吸蟲生長發育的影響，采用免疫組化法、感染小鼠體內靶向性檢測以及體內外抗蟲實驗等方法鑒定，結果證明ZL-4分子不僅能與血吸蟲各期蟲體膜發生特異結合，而且有明顯抗蟲作用。這在國內外寄生性蠕蟲研究領域尚屬首次發現與證實。本研究發明的對日本血吸蟲具有靶向性和拮抗性的蟲體膜結合短肽根據兩名主要發現者姓氏拼音第一個字母和噬菌體克隆編號將其命名為ZL-4多肽分子。該多肽分子片段的氨基酸序列與其DNA片段序列ZL-4分子的氨基酸序列從N—C端依次為YSGLQDSSLRLR(翻譯為:酪氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-精氨酸);編碼該多肽分子的核苷酸序列從5'一3'端依次為:GATCGTTATTCTGAGATTCGGACTTCTTCGACGTTG。登錄NCBI/BLAST網站(http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)，將ZL-4多肽分子與數據庫中已知蛋白質的氨基酸序列進行同源性分析，結果發現在人源性(homosapiens)、血吸蟲源性(schistosomal兔源性(rat)、鼠源性(mouse)現有的蛋白質/多肽庫中沒有與本實驗所得短肽序列完全一致或者是有良好同源性的蛋白質分子。這說明該分子不屬于血吸蟲與宿主的蛋白來源，根據其特異結合與抗蟲作用，我們認為有兩種可能機制O)為血吸蟲膜受體結合的模擬配體分子，(2)為血吸蟲膜上離子通道抑制分子實施例2:短肽ZL-4的特異性結合和抗蟲作用8一、證明ZL-4與血吸蟲發生特異性結合的靶向作用方法采用了如下幾種。1.ZL-4分子與血吸蟲脫尾活童蟲特異性結合能力檢測實驗比較證明了ZL-6、ZL-4和ZL-1分子噬菌體克隆和M13KE(噬菌體標準對照物)與血吸蟲脫尾活童蟲特異性結合能力方法取日本血吸蟲尾蚴，機械脫尾處理，計數蟲體，分為l、2、3、4管(每管約500條脫尾童蟲)，分別定量加入ZL-6、ZL-4、ZL-1和M13KE的噬菌體，37。C輕搖作用2小時后，離心棄上清，收集與蟲體用TBS-T離心洗滌10次，以棄除不結合噬菌體，進而用PEG/NaCl沉淀收集結合的噬菌體，取2ul感染大腸桿菌進行豐度測定。經計算各管蟲體與加入相應噬菌體結合率，其中顯示ZL-4多肽對血吸蟲脫位童蟲的結合率高于其它分子的1000倍-1000萬倍(結果見表l)。2.體外蟲體免疫組化定位實驗目的是為充分證明ZL-4分子與血吸蟲童蟲和成蟲特異性結合特性方法取500±20條活童蟲和500±20條活尾蚴混合后，平均分為1、2、3管，分別在1管加入1016pfo含ZL-4分子的目標噬菌體、在2管加入不含ZL-4分子的噬菌體作陰性對照、在3管近加PBS作空白對照，然后置37。C輕搖150min，離心洗滌3次棄上清，4%PFA固定10min，TOST洗滌3次，緩慢懸浮蟲體，每管蟲體涂片兩張，吹干；滴加100^1TBST1:5000稀釋的HRP-鼠抗M13抗體于4"C孵育過夜，洗滌后，加DAB顯色20min,觀察結果，各管取一片蟲體用蘇木素染色，自來水洗10min，干后封片，鏡下觀察結果(圖l的部分)顯示，ZL-4與尾蚴培育的呈陰性反應，而與脫尾童蟲培育的則可見蟲體頭部和體部呈非常強的陽性反應(深棕黃色表現)。取血吸蟲感染小鼠后第10d獲得肝門期童蟲及感染后第24d獲得成蟲，經固定，石蠟包埋，切片鋪片，用同樣方法作免疫組化檢測，結果(圖2)顯示，與ZL-4分子培育的蟲體及切片組織，可見蟲體頭部和體部及切片蟲體膜上發生特異性陽性結合反應。3.動物體內靶向試驗其目的證明ZL-4分子在血吸蟲感染小鼠體內和未感染小鼠體內分布差異。劍門假設如果ZL-4分子對體內血吸蟲有靶向結合作用，那么注射該分子后就會隨血吸蟲感染移行部位(臟器)分布量比無血吸蟲感染小鼠相應臟器的多，與此同時，體內血吸蟲也會被ZL-4分子結合而消耗，從而使游離分子減少。為此，本實驗設計取6周齡昆明鼠感染血吸蟲尾蚴30±2鳳鼠，設不感染血吸蟲的小鼠平行作空白對照組。在感染后第3d，經尾靜脈(包括未感染小鼠)分別注射10^pfo含Z14分子的目標噬菌體。注后15miin麻醉剖殺小鼠，經心臟灌注100mlD-Hank's液體，以沖洗出小鼠體內游離噬菌體。然后，分別取出鼠肝和鼠肺，剪碎加入酸性溶液洗脫并收集與組織結合的噬菌體，測定豐度。數據利用SPSS11.5軟件進行T檢驗，顯著性7K平設定為i70.05。用同樣的方法收集血吸蟲感染后第10d鼠及平行未感染對照鼠的肝內和肺內結合噬菌體，并進行統計學分析。結果顯示ZL-4分子在感染的鼠肺和鼠肝組織中，雖血吸蟲移行到達而增加，而在未感染鼠肝、肺組織中分布量很少，二者二者統計學差異，P=0.000(肺)和P〈0.006(肝)；取感染鼠肝作組織切片，經免疫組化染色結果(圖3)表明，ZL-4肝組織內蟲體切片的蟲體膜上可見棕黃色顆粒的陽性反應，并蟲體周圍附近肝組織呈陽性反應。二、證明ZL-4抗血吸蟲作用的實驗方法包括體外和體內兩方面。L體外三次殺傷實驗在無菌條件下，釋放尾蚴，制備脫尾童蟲，調整童蟲密度約為1000條/ml，取100yl(約含100±5條蟲體)置入含100)4含10UI青霉素，10ug鏈霉素及3d小牛血清1640培基的96孔培養板中。實驗設4個組:M13KE(l(fpfu)陰性對照組、TBS(10空白對照組、東方田鼠血清陽性對照組w和10"pfu含ZL-4分子的噬菌體克隆組。3孔/組,分別按設計加入含相應成分的1640溶液，置37°C，含5%0)2飽和濕度培養箱培養72小時。每24小時觀察一次，0.4%美藍染色后在倒置顯微鏡下分別計算活蟲體數和死亡蟲體數。實驗重復3次。結果(表2)顯示，ZL-4分子在24小時內對脫尾童蟲的校正殺傷率為76%。其殺傷能力強于東方田鼠血清(公認具有天然抗血吸蟲作用的動物血清)。2.體內三批小鼠抗血吸蟲實驗每批實驗均取昆明小鼠作血吸蟲感染30±2尾呦/鼠后，隨機分為4個組，10只鼠/組。感染后第l-7d經尾靜脈分別注射ZL4(l(Ppfo)的為實驗組，注射M13KE(10"pfU)的為陰性對照組和注射TBS(100pl)的為空白對照組。陽性對照組為Sj感染后第36d用吡喹酮G00mg/kg)灌胃的治療組。感染后50d小鼠用乙醚麻醉，按常規法解剖小鼠灌注沖蟲，收集并計算每組蟲體均數。灌注后，取下鼠肝作蟲卵計數。蟲卵計算方法每鼠取1克肝組織勻漿，加5ml4%NaOH置37'C消化16小時，混懸消化組織準確吸取200W在光鏡下計數蟲卵，重復三次，得出每克肝組織蟲卵數(LEPG)。為評價蟲體發育程度，對各組收獲的每條蟲體用1/萬天平稱重，以平均體重/對蟲體來作評價指標，計算蟲體平均重量減少率。減蟲率、肝卵減少率和蟲體重量減少率計算均按下列公式數據用平均數±標準差表示，分別進行T檢驗，檢測顯著性差異為尸<0.05。三批實驗的平均結果(表3)顯示，ZL-4分子對體內感染的血吸蟲早期蟲體均具有一定的抗蟲作用(表現為減蟲、減卵和蟲體發育小)。表l.日本血吸蟲脫尾童蟲與3種噬菌體克隆特異性結合率樣品編號加入噬菌體量洗脫噬菌體量結合率ZL63.60X10165.70X10"0.0016%ZL43.20X10164.80X10"1.5%ZL12.80X10167.00X101'0.0025%M13KE3.20X10160.20X1080.00000063%表2.ZL-4陽性克隆在體外殺血吸蟲童蟲效果組別觀察蟲數不同時間點蟲，亡率(、)24hrs48hrs72hrs各時間點校正死亡率PBS30421.7154.2874.01一；一；_東方田鼠血清30069.0097.33IO(T47;43;26ZL-4克隆30397.69IO(TIO(T78;46;26M13KE29720.5458.9279.120;4;511表3.ZL-4克隆對小鼠體內血吸蟲生存與發育的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2和表3中數據位三次實驗的平均數。序列表〈110>中南大學<120>—種有特異靶向并具抗血吸蟲作用的蟲體膜結合短肽ZL-4及其應用〈130>無〈160〉2〈170>Patentlnversion3.3〈210>1〈211>12<212>PRT〈213〉噬菌體〈400〉1TyrSerGlyLeuGinAspSerSerLeuArgLeuArg1510〈210>2<211>36〈212>DNA〈213〉噬菌體〈2gatcgttattctgagattcggacttcttcgacgttg3權利要求1、一種有特異靶向并具抗血吸蟲作用的蟲體膜結合短肽ZL-4，其特征在于，該短肽的氨基酸序列從N→C端依次為Tyr-Ser-Gly-Leu-Gln-Asn-Gln-Ser-Leu-Arg-Leu-Arg。2、根據權利要求1所述的短肽ZL-4，其特征在于，編碼短肽ZL-4的DNA序列從5'—3'端依次為GATCGTTATTCTGAGATTCGGACTTCTTCGACGTTG。3、權利要求l所述的短肽ZL-4的應用，其特征在于，所述的短肽ZL-4用于制備抗血吸蟲的制劑。4、權利要求2所述的短肽ZL-4的應用，其特征在于，所述的短肽ZL-4用于制備與血吸蟲體膜發生特異結合的靶向分子。全文摘要本發明提供了一種有特異靶向性并具抗血吸蟲作用的活蟲體膜結合短肽及其應用。研究采用噬菌體12肽庫從血吸蟲脫尾活童蟲表膜上篩選出的肽段ZL-4，通過多技術鑒定反復證明該ZL-4多肽分子對血吸蟲活童蟲和或活成蟲的膜結合率高；用酶免疫組化定位結果顯示ZL-4多肽分子可與日本血吸蟲脫尾童蟲和成蟲的頭部和體部與其切片的蟲體膜上發生特異性結合反應；用ZL-4在體內外作三批抗血吸蟲實驗，均證明對血吸蟲生存和生長發育有明顯抑制影響。由此說明，該多肽分子對血吸蟲具有靶向性和抗蟲性功能，將在血吸蟲病防治研究與應用方面具有潛在的實用價值。文檔編號C12N15/12GK101591378SQ200910043720公開日2009年12月2日申請日期2009年6月19日優先權日2009年6月19日發明者彥劉,曾慶仁,琦魏申請人:中南大學