地克珠利的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及谷物食品中獸藥殘留檢測技術領域，特別是涉及地克珠利的免疫膠體 金檢測卡及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 地克珠利（Diclazuril)屬三嗪苯乙腈化合物，為類白色或淡黃色粉末，在二甲基 甲酰胺中略溶，在四氫呋喃中微溶，在水、乙醇中幾乎不溶。地克珠利是一種高效、低毒的廣 譜驅球蟲藥，對雞、火雞、鴨、鵝、孔雀、鵪鶉、兔等各種球蟲具有良好的防治效果，每噸飼料 添加 lg，能有效地控制球蟲病的爆發。雞球蟲是養禽業的常見寄生蟲，給養雞業造成嚴重經 濟損失。目前預防雞球蟲病的主要手段是實用抗球蟲藥進行化學防治和疫苗接種，長期藥 物預防一直是雞球蟲病防治的有效手段，其用藥量大，約占各種藥物添加劑總量的1/4。地 克珠利是主要使用的抗球蟲藥物之一，國內實用也較為混亂。
[0003] 隨著藥物在食品動物中的廣泛應用，其殘留問題已引起了廣泛的關注。藥物殘留 不僅因其毒副作用對人造成直接危害，更嚴重的問題是食品動物中殘留低濃度的藥物容易 又到人類致病菌產生耐藥性，從而不利于藥物在人醫臨床的應用。因為開展地克珠利的殘 留研究十分必要。
[0004] 現有技術對于地克珠利的檢測主要是高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術的 缺陷明顯：設備昂貴、操作復雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定 方法是極其必要的。本發明的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本 低廉的定性檢測方法。

【發明內容】

[0005] 針對以上情況，本發明的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種地克 珠利的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出地克珠利的問 題。
[0006] 本發明的地克珠利膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金 結合墊、包被了地克珠利-BSA和羊抗鼠 IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和 塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一 端粘附吸水墊。
[0007] 本發明的地克珠利膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現： (1) 膠體金溶液制備：取1 L三角燒瓶1個，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸 (HAuC14*3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況 下加入1%檸檬酸三鈉（Na3C6H 507 · 2H20)溶液5-7 mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變 為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； (2) 抗體的預處理：將要標記的地克珠利抗體在1000 r/min, 4°C條件下，離心20 min,取上清，用 0.01 mol/L PBS稀釋成 1 mg/mL;或者用 0.01 mol/L PBS稀釋成 1 mg/ml， 過0. 22 Mm濾膜； ⑶膠體金標記物的制備：取步驟⑴中的膠體金溶液40 mL，用0. 25 mol/L K2C03調 節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌，逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白 的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min;金標抗體溶液常 溫低速（1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至1 mL,制備 成地克珠利單克隆抗體膠體金標記物； (4) 膠體金膜的制備：將步驟（3)地克珠利蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用 劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h， 制成含地克珠利蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜； (5) 包被膜制備：將羊抗鼠 IgG抗體、地克珠利蛋白質偶聯物稀釋成1 mg/mL，用劃膜儀 依次以1 ML/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然 晾干或者37 °C烘干； (6) 樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60% 的條件下，室溫自然晾干； (7) 檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組 裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
[0008] 所述步驟（5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方； 所述步驟（6)中的樣品墊處理液是由1 g小牛血清蛋白（BSA)和0. 8 g氯化鈉（NaCl), 用含有 0· 5%TRIT0N-100 的 0· 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ; 本發明可有效用于測定地克珠利，方法簡單，方便、快捷，結果準確。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發明地克珠利的免疫膠體金檢測卡的結構圖：圖中1.加樣孔 2.檢測 線3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。
[0010] 圖2為本發明地克珠利的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣 品墊8.膠體金結合墊9. PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1 圖1、圖2所示的實施例：圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金 結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素 膜上包被了地克珠利-BSA和羊抗鼠 IgG ;11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。
[0012] 在PVC膠板9的一端上（樣品端）粘附樣品墊7、結合墊8,樣品墊7和結合墊8 為并排結構。
[0013] 在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設置有羊抗鼠 IgG質控線3和地克珠利-BSA檢測線2。
[0014] 在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結合墊8略交 叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，制 成檢測卡，在檢測卡外殼6的上蓋上設有加樣孔1和檢測孔4,樣品墊7正對加樣孔1，硝酸 纖維素膜10正對檢測孔4。
[0015] 實施例2 地克珠利膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現： 膠體金溶液制備：取1 L三角燒瓶1個，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸 (HAuC14*3H20) 5 m