一種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及菊花雜交育種與蛋白質組學領域，涉及菊花遠緣雜交后胚胎在不同發育時期利用熒光分光光度法進行體外檢測胚胎敗育過程中五種Caspase酶活性的方法，具體地說涉及一種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]菊花原產中國，是我國十大名花和世界四大切花之一，產量居首，在花卉生產中占有十分重要的地位。目前，國內菊花品種高達數千個，按栽培方式可以分為盆栽菊、地被菊、切花菊、造型菊四大類。地被菊多用于園林綠化，栽培管理較粗放，因此就需要有更高的適應性和抗性，但多數觀賞性狀優良的品種對栽培條件要求較高，生物和非生物抗性較差，嚴重限制了其應用的范圍和美化的效果，因此對菊花品種的改良一直是育種工作者研究的重點。目前，運用種間，甚至屬間雜交的辦法，將菊屬及其近緣種屬中的優良性狀導入栽培菊中是獲得菊花新性狀，提高菊花抗性的最有效途徑之一。
[0003]然而，已有研究表明，菊花遠緣雜交中經常遇到受精前和受精后障礙，導致菊花遠緣雜交結實率低，其中受精后障礙更為普遍，即人工雜交后能夠完成受精作用過程，但胚胎發育過程中遇到障礙，導致細胞降解、凋亡或死亡，胚胎發育停止，即胚胎敗育，最終引起雜交失敗。
[0004]目前對于菊花胚胎敗育的研究主要集中在形態結構、組織化學等方面，如胚胎敗育發生的時期和胚胎敗育的組織結構特征等，很少從細胞衰亡的深層次原因方面開展研究。從形態結構和組織變化方面能明顯觀察到胚胎細胞從正常到敗育是一個細胞凋亡的過程，在這個過程中，細胞器數量減少、結構異常并呈退化狀態，細胞質逐漸收縮，細胞壁結構加厚等現象。對菊花的轉錄組學和蛋白質組學的研究也表明，在菊花敗育胚胎中，參與細胞衰老、細胞程序性死亡的基因和蛋白都顯著上調和增多，盡管有許多信號可以誘導細胞程序死亡，但它們也有共同的特征，其中凋亡時一系列細胞內蛋白水解酶——Caspase酶的活化就是之一。因此，通過檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase酶的活性，不僅能增加對胚胎敗育過程中導致細胞死亡的原因的認識，更利于從基因和蛋白水平挖掘出控制胚胎敗育的關鍵基因和蛋白。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法及其應用。探索菊花胚胎發育從正常到敗育過程中不同Caspase酶活性的方法，為挖掘控制胚胎敗育的關鍵基因和蛋白提供了基礎。
[0006]本發明的目的通過以下技術方案實現的:
[0007]—種體外檢測菊花胚胎敗育過程中Caspase活性的方法，包括以下步驟:
[0008]I)菊花遠緣雜交后不同發育時期胚珠的獲得
[0009]選擇在人工授粉后會出現胚胎敗育現象的雜交組合進行遠緣雜交，人工授粉后12天，取形態飽滿、發育正常的正常胚珠;人工授粉后18天，部分胚胎開始敗育，分別取形態飽滿、發育正常的胚珠和不飽滿、發育異常的胚珠;一般情況下，取樣后立即在液氮中預處理l_2h，然后于_80°C貯存；
[0010]2)采用TCA/丙酮沉淀法分別提取步驟I)中所取得的3個胚珠樣品的蛋白質，得到授粉后12天發育正常的胚珠蛋白質、授粉后18天發育正常和發育異常的胚珠蛋白質；提取的蛋白質于_80°C保存；
[0011]3)將步驟2)中的蛋白質預處理后分別用Bradford法進行蛋白質定量，并分別用Caspase緩沖液調整蛋白濃度至lyg/μ? ；
[0012]4)設空白對照和待測樣品，向空白對照孔中加入熒光底物和Caspase緩沖液，向待測樣品孔中熒光底物、Caspase緩沖液和蛋白質樣品，加樣后檢測AMC釋放量，分析熒光強度，確定蛋白質樣品中Caspase的酶活性，采用五種熒光底物分別測定蛋白質樣品中對應的五種Caspase的酶活性。使用多功能酶標儀檢測AMC釋放量。
[0013]步驟I)中所述的雜交組合中以栽培菊作為母本，野菊作為父本。所述的栽培菊花為‘雨花落英，，所述野菊為菊花腦，該雜交組合在人工授粉后會出現胚胎敗育的現象。
[0014]步驟3)中蛋白質預處理的過程為:向每個蛋白質樣品中加Caspase緩沖液并混合均勻，于冰上置放后離心取上清液;優選的，于冰上置放30分鐘，離心的條件為:16000g，4°C離心20min。
[0015]所述的五種熒光底物分別為:Ac-YVAD-AMC、Ac-DEVD-AMC、Ac-LEVD-AMC、Ac-VEID-AMC和Ac-LEHD-AMC。
[0016]優選的，步驟4)中向空白對照孔加入195μ1Caspase緩沖液，5μ1熒光底物；向待測樣品孔中加入175μ1 Caspase緩沖液，5μ1熒光底物，混勻后再加入20μ1步驟3)中所得的蛋白質樣品。
[0017]上述的Caspase緩沖液的配方為:50mM醋酸鈉，1mM L-半胱氨酸，10% (vol/vol)甘油，0.I % (wt/vol，g/ml，100ml Caspase緩沖液中含0.Ig CHAPS)CHAPS，以NaOH或HCl調pH值至6.0 ο配好后于4°C保存。
[0018]步驟4)中分析熒光強度時的激發光波長380nm，發射光波長為460nm，檢測AMC釋放量時的檢測溫度為27°C。
[0019]上述的方法在篩選菊花胚胎敗育過程中控制胚胎敗育的關鍵Caspase酶中的應用。
[0020]上述的應用，其在于分析正常胚珠和異常胚珠中各種Capsase酶的活化情況，篩選出活化程度異常的Capsase酶即為控制胚胎敗育的關鍵Caspase酶。
[0021]步驟2)中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質的過程為:取樣品在液氮預冷的研缽中迅速研磨至粉末狀，加入提取液制成混合液，將混合液裝入離心管中，放在冰上并在搖床上振蕩后，在15，000g，4°C下離心15min，取上清液，向上清液中加入洗滌液I，充分震蕩混勻，-20°C靜置0.5-1.5h;然后在15，000g，4°C下離心15min，棄上清，向沉淀中加洗滌液Π洗滌，-20°C靜置30min以上，重復用洗滌液Π洗滌I _2次后冷凍干燥沉淀，于_80°C保存。
[0022]上述的提取液為:8M尿素、2%硫脲(g/ml，100ml提取液中含2g硫脲)、1%(ν/ν)Trit1n X_100、50mM NaCl、20mM Tris，pH = 8.0 ;所述的洗滌液I為:_20°C預冷丙酮加0.07%01'1'(8/1111，1001111洗滌液1中含0.078 DTT)和 10%TCA(g/ml，10ml洗滌液I 中含1gTCA);所述的洗滌液Π為:_20°C預冷丙酮加0.07%DTT(g/ml，10ml洗滌液Π中含0.07gDTT) ο
[0023]步驟3)中運用Bradford法進行蛋白質定量主要包括以下步驟:配制一組濃度分別為0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml ,0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白(BSA)溶液，測定這組溶液的吸光度，得到蛋白質濃度對吸光度的一條標準曲線。測定未知蛋白質濃度樣品的吸光度，根據標準曲線得到蛋白質的濃度。
[0024]步驟4)中的五種不同熒光底物分別是:N-Acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp_AMC(Ac-YVAD-AMC),N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AMC(Ac-DEVD-AMC),Ac-Leu-Glu-Val-Asp-AMC(Ac-LEVD-AMC)，Ac-Val-Glu-1le-Asp-AMC(Ac-VEID-AMC)，AC-LEU-GLU-HIS-ASP-AMC(Ac-LEHD-AMC) ο
[0025]本發明的有益效果:
[0026]本發明針對菊花遠緣雜交后胚胎敗育的細胞衰老和凋亡現象，提供了一種快速、準確鑒定菊花胚胎敗育過程中誘導細胞死亡的關鍵Caspase酶，探索菊花胚胎發育從正常到敗育過程中不同Caspase酶活性的方法，為研究菊花胚胎敗育的分子機理，挖掘調控胚胎敗育的關鍵基因和蛋白提供了研究基礎。
【附圖說明】
[0027]圖1為正常和敗育胚胎中Caspase-1 ike活性。
[0028]其中，NE12:12天正常胚胎;NE18:18天正常胚胎;AE18:18天敗育胚胎。五種不同的熒光底物分別為:Ac-YVAD-AMC(YVADase) ,Ac-DEVD-AMC(DEVDase) ,Ac-LEVD-AMC(LEVDase) ,Ac-VEID-AMC(VEIDase) ,Ac-LEHD-AMC(LEHDase)。以LEHDase活性的百分比作為相對熒光單位進行計算。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0030]本發明所提供的利用酶標儀體外檢測菊花胚胎敗育過程中不同Caspase活性熒光的方法，其具體實施示例如下:
[0031]1.遠緣雜交及取樣
[0032]1.1遠緣雜交
[0033]以栽培小菊‘雨花落英’(2n= 6x = 54)作母本，選取發育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，即把內輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭(不傷及柱頭)，并嚴格進行套袋。待母本柱頭伸出并開叉呈現銳角和分泌黏液時(去雄后3-5d)，于晴天10-15時收集已套袋的父本菊花腦(2n = 2x= 18)的新鮮花粉，用毛筆對母本進行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續套袋隔離。
[0034]1.2胚胎取樣
[0035]授粉后12d時，剪下一部分已授粉的花序，用尖頭鑷子取下每一朵小花，并取出每一朵小花的胚珠，并去除少部分發育不良的不飽滿胚珠，最后將發育正常飽滿的胚珠用錫箔紙包好立即在液氮中預處理l_2h，然后在_80°C條件下貯存。
[0036]授粉后18d時，剪下已授粉花序，取下每一朵小花，在體視顯微鏡下能觀察到子房的飽滿程度有差異，并將發育正常飽滿的和發育異常不飽滿的子房分開，取出胚珠，分別用錫箔紙包好立即在液氮中預處理l_2h，然后在-80°C條件下貯存。
[0037]2.蛋白質提取
[0038]用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質。具體步驟如下:
[0039]2.1溶液配制
[0040]本方法提蛋白所需的三種溶液分別為:
[0041](I)提取液:8M尿素、2%(g/ml)硫脲、l%(v/v)Trit1n X_100、50mM NaCl、20mMTris，pH=8.0 ；
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