一種利用卵泡抑素Follistatin促進綿羊體外胚胎發育的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種利用卵泡抑素Follistatin促進綿 羊體外胚胎發育的方法。
【背景技術】
[0002] 卵泡抑素（Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分別從牛和豬的卵泡 液中分離出的一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽。它可以通過與activin蛋白的結 合抑制促卵泡激素的分泌。卵泡抑素不僅可以阻礙activin蛋白的作用，還能降低包括 myostatin(MSTN)、GDF_9、bonemorphogeneticproteins(BMPs)在內的其它TGF-0 家族 成員功能的發揮。通過與這些TGF-0家族成員的結合，卵泡抑素廣泛參與了生物體多種生 理功能的調控，包括繁殖、生長發育、神經誘導、滲透壓調節、肌細胞生成和免疫調節。但目 前，還沒有Follistatin對綿羊體外胚胎培養發育影響的報道。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于：利用卵泡抑素Follistatin對綿羊卵母細胞體外受精后的早 期胚胎進行處理，找到一種促進綿羊體外胚胎發育的方法。
[0004] 實現本發明的目的技術方案如下：一種利用卵泡抑素Follistatin促進綿羊體 外胚胎發育的方法，該方法步驟如下：（1)在綿羊屠宰場獲取宰殺后30分鐘以內的綿羊卵 巢，置入溫度在30-35°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3-5小 時內用生理鹽水清洗3-4次；（2)然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5mm大 小的卵泡，將注射器內回收的卵泡液置于器皿中，在顯微鏡下撿出卵母細胞，用體外成熟液 洗滌3-5次，備用；（3)將步驟（2)中選擇的卵母細胞，在條件為5%C02,95%空氣，溫度為 38. 6°C的C02培養箱內培養22-24小時，用綿羊體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴 的密度加入裝有體外受精液的液滴內，備用；(4)將解凍后的凍精，放入裝有體外受精液的 試管底部，C02培養箱內上游20-25分鐘，取上層精子混懸液，以1500轉/分鐘的轉速離心 4-5分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進行密度計算，按2-4X106個/ml的密度加入步驟 (3)的體外受精液滴，與卵母細胞共同孵育；（5)將步驟（4)中受精20-22小時的早期胚胎 取出，移至含有10Ug/LFollistatin的體外培養液IVC1內洗滌3-4次，并再次培養24-26 小時；（6)將步驟（5)中在IVC1內培養24-26小時后的胚胎取出，再用常規的體外培養液 IVC2洗滌3-4次，統計卵裂率，并繼續培養，144-168小時后統計囊胚率。
[0005]所述的抽卵液為：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素鈉； 體外成熟液（IVM)為：TCM199-HC03+10%FBS+0. 05IU/mlFSH+0. 05IU/mlLH+1yg/ml雌二醇 +24. 2yg/ml丙酮酸鈉 +0.ImM/L半胱氨酸 +10ng/mlEGF+lOOIU/ml青霉素 +100IU/ ml鏈霉素； 體外受精液（IVF)為：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素； 體外培養液1(IVC1)為：S0F+3mg/mlBSA+lOyg/LFollistatin; 體外培養液 2(IVC2)為：S0F+3mg/mlBSA; 其中所述合成輸卵管液（SOF)為：6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml乳酸鈉 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml丙酮酸鈉 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20。
[0006] 有益效果：通過卵泡抑素Follistatin對綿羊卵母細胞體外受精后的早期胚胎進 行處理，能顯著提高體外胚胎發育囊胚率。為科研生產實踐探索出一條新的生物學方法。
【具體實施方式】
[0007] 實施例1 :摘取宰殺30分鐘內的綿羊卵巢，置入溫度在30-35°C，含1000IU/ml青 霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內用生理鹽水清洗3-4次；用吸有2ml抽卵 液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2-5_大小的卵泡，將注射器內回收的卵泡 液打在35-60mm的皿內，在顯微鏡下撿出卵母細胞，用體外成熟液洗滌3次；在條件為5% C02,95%空氣，溫度為38. 6°C的C02培養箱內培養22-24小時，用體外受精液洗滌2-4次；按 25-30枚/滴的密度加入2小時前平衡好的50-70y1的體外受精液滴內；用水浴解凍精液， 移入2小時前平衡好的裝有體外受精液的試管底部，放入C02培養箱，上游20-25分鐘，取 上層精子混懸液，以1500轉/分鐘的轉速離心4-5分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進 行密度計算，按2-4X106個/ml的密度加入上述放有卵母細胞的體外受精液滴，與卵母細 胞共同孵育；將受精20-22小時的早期胚胎取出，用平衡好的添加了10yg/LFollistatin 的體外培養液IVC1內洗滌3-4次，并用IVC1培養24-26小時；用不含Follistatin的體外 培養液IVC2洗滌3次，統計卵裂率，并繼續培養，168小時后統計囊胚率。
[0008] 其中實驗液體的配置：抽卵液：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素鈉； 體外成熟液（IVM) :TCM199-HC03+ 10%FBS十0? 05IU/mlFSH十0? 05IU/mlLH十 1yg/ml雌二醇+24. 2yg/ml丙酮酸鈉+0.ImM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml鏈霉素； 合成輸卵管液（SOF) :6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 6y1/ml乳酸納 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml丙酬酸納 +0? 299mg/ml CaCL2 ? 2H20 ; 體外受精液（IVF) :S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素； 體外培養液 1(IVC1) :S0F+3mg/mlBSA+lOyg/LFollistatin; 體外培養液2(IVC2) :S0F+3mg/mlBSA。
[0009] 實驗結果及數據驗證：用一組數據驗證添加Follistatin的有效性。
[0010] 表 1
【主權項】
1. 一種利用卵泡抑素Follistatin促進綿羊體外胚胎發育的方法，其特征在于：該方 法步驟如下： (1) 在綿羊屠宰場獲取宰殺后30分鐘以內的綿羊卵巢，置入溫度在30-35 °C，含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3-5小時內用生理鹽水清洗3-4次； (2) 然后，用吸有2ml抽卵液注射器抽吸卵巢表面2-5_大小的卵泡，將注射器內回收 的卵泡液置于器皿中，在顯微鏡下撿出卵母細胞，用體外成熟液洗滌3-5次，備用； (3) 將步驟（2)中選擇的卵母細胞，在條件為5%C02,95%空氣，溫度為38. 6°C的0)2培 養箱內培養22-24小時，用綿羊體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴的密度加入裝有體 外受精液的液滴內，備用； (4) 將解凍后的凍精，放入裝有體外受精液的試管內，CO2培養箱內培養20-25分鐘，取 上清液，以1500轉/分鐘的轉速離心4-5分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進行密度計 算，按2-4XIO6個/ml的密度加入步驟（3)的體外受精液滴，與卵母細胞共同孵育； (5) 將步驟（4)中受精20-22小時的早期胚胎取出，移至含有10yg/LFollistatin的 體外培養液IVCl內洗滌3-4次，并再次培養24-26小時； (6) 將步驟（5)中在IVCl內培養24-26小時后的胚胎取出，再用常規的體外培養液 IVC2洗滌3-4次，統計卵裂率，并繼續培養，144-168小時后統計囊胚率。
2. 根據權利要求1所述的一種利用卵泡抑素Follistatin促進綿羊體外早期胚胎發育 的方法，其特征在于：所述的抽卵液為：TCM199-hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素鈉； 體外成熟液（1雅)為：!111199-110)3+109^85+0.05叨/1111?511+0.05叨/11111^+11^/1111雌 二醇 + 24. 2yg/ml丙酮酸鈉 +0.ImM/L半胱氨酸 +10ng/mlEGF+100IU/ml青霉素 +100IU/ ml鏈霉素； 體外受精液（IVF)為：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素； 體外培養液I(IVCl)為：S0F+3mg/mlBSA+10yg/LFollistatin; 體外培養液 2 (IVC2)為：S0F+3mg/mlBSA; 其中所述合成輸卵管液（SOF)為：6. 29mg/ml NaCL +0.534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸鈉 +0? 089mg/ml MgS04+2. lmg/ml NaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0? 299mg/ml CaCL2 ? 2H20。
【專利摘要】本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種利用卵泡抑素Follistatin促進綿羊體外胚胎發育的方法，步驟如下：（1）獲取宰殺后綿羊卵巢；（2）抽吸卵泡備用；（3）選擇的卵母細胞，在CO2培養箱內培養，加入裝有體外受精液的液滴內；（4）放入體外受精液滴，與卵母細胞共同孵育；（5）將早期胚胎取出，移至含有10μg/L Follistatin的體外培養液洗滌3-4次，并再次培養24-26小時；（6）將胚胎取出，用體外培養液洗滌，統計卵裂率，培養144-168小時后統計囊胚率。通過卵泡抑素Follistatin對綿羊卵母細胞體外受精后的早期胚胎進行處理，能顯著提高體外胚胎發育囊胚率。
【IPC分類】C12N5-073
【公開號】CN104694463
【申請號】CN201510107124
【發明人】黃俊成, 汪立芹, 吳陽升, 林嘉鵬, 何宗霖, 唐森, 阿米娜·阿布都瓦力
【申請人】新疆畜牧科學院生物技術研究所
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月10日