體外胚胎操作試驗盒及試驗方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及胚胎生物學技術領域，更具的說，涉及一種體外胚胎操作試驗時使用的試驗盒及其試驗方法。
【背景技術】
[0002]胚胎是細胞生物學，生殖生物學，發育生物學及胚胎工程領域的主要研宄對象。目前胚胎體外操作實驗存在以下問題:
[0003]1、胚胎和貼壁生長的細胞不同，不能直接固定在載玻片或培養皿中，因此每步操作都需要用口吸管將胚胎轉移至其他液滴中，操作繁瑣，且易丟失胚胎。
[0004]2、試驗用試劑多有毒性，對科研工作者，特別是采用口吸管移取胚胎操作，存在一定的傷害風險。
[0005]3、一些試驗試劑還具有擴散性特性，每步操作若需等待20-30min時，往往液滴干涸，使胚胎出現浸潤不徹底、干燥、變形、崩裂、丟失等現象而無法進行下一步操作，導致試驗失敗。
[0006]4、用于胚胎試驗的載體通常為培養皿或是4/6/12/24孔板，在培養皿中操作，液滴易擴散或是連在一起，難以辨別胚胎的組別；在4/6/12/孔板中，底部面積較大，不僅浪費試劑，而且在顯微鏡下尋找胚胎需時較長；在24孔板中操作，板孔太深，易使吸胚針折斷，胚胎易丟失。
[0007]以上幾點問題，不利于試驗操作，并可能影響試驗成功率和試驗效率。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在于提供一種體外胚胎試驗操作用試驗盒及使用方法，該試驗盒操作簡便，用其進行胚胎操作試驗可提高試驗效率和試驗成功率。
[0009]體外胚胎操作試驗盒，包括操作皿和操作皿盒。操作皿包括操作皿本體、操作皿蓋和密封塞，操作皿蓋可以覆蓋整個操作皿的上端面。操作皿本體內部為中空腔，操作皿本體側壁設置有連通口，使中空腔與外界相通，連通口向外有一延伸部，外接抽氣裝置，延伸部處設置有止回閥；沿操作皿上端面向操作皿本體內，設置有多個互不相通的凹槽，試驗中，凹槽用來防止不同組別胚胎和試劑混合在一起。試驗時可根據具體試驗分組，選擇相應數量的凹槽使用。密封塞與凹槽配合，每個凹槽的頂部均有與其相匹配的密封塞，塞住凹槽口。所述凹槽的槽底為超濾膜，超濾膜具有一定的弧度，超濾膜孔徑<最小胚胎直徑，保證胚胎放置其中不能透過此膜。根據具體的試驗需求，可定制超濾膜，例如，當進行胚胎蛋白試驗時，需同時保證最大蛋白直徑<超濾膜孔徑。由于不同的試驗對試劑量的需求不同，凹槽的容積可根據試驗對試劑量的需求進行特殊設計。沿凹槽側壁設置有引流柱，引流柱用于規范試驗試劑的流動。所述操作皿盒為不透光盒，可包裹住整個操作皿。
[0010]優選的是:密封塞包括塞架和塞頭，所述塞架包括多條塞骨，多條塞骨匯聚到一點，形成傘骨形塞架，塞頭設置在塞骨的末端，塞骨的個數與操作皿本體內凹槽的個數相同，保證每個凹槽均有與其配合的塞頭。
[0011]優選的是:操作皿內部，在操作皿底和凹槽之間沿操作皿側壁設置有一斜面，所述斜面覆蓋整個操作皿底的范圍，保證每個凹槽內流出的試劑均可落到斜面上，斜面較高的一端位于與連通口相對一側的操作皿本體的側壁上，較低的一端，位于連通口處；斜面結構有利于試驗試劑流動到連通口處。
[0012]更進一步的:引流柱底部與斜面相接，用過的試劑可沿引流柱流到斜面上。
[0013]優選的是:操作皿盒為不透光盒，操作皿盒底部覆蓋吸水材料，使用前加入少量水，使吸水材料浸濕。操作皿盒用于為操作皿提供一個黑暗潮濕的環境，以使其適用于特定的試驗需求。
[0014]采用體外胚胎操作試驗盒進行胚胎試驗的方法，包括以下步驟:
[0015]S1:在操作皿連通口處連接一抽氣裝置，準備待測胚胎，對胚胎分組，根據胚胎分組數，打開相應數量的密封塞；
[0016]S2:將試驗用試劑滴入凹槽內，將待測試胚胎移入凹槽內，處理相應的時間后，啟動抽氣裝置，止回閥打開，此時，操作皿本體內中空腔的壓力小于外界壓力，試驗用過的試劑透過超濾膜，流入中空腔底部關閉抽氣裝置，止回閥關閉，中空腔內外壓力恢復平衡；
[0017]S3:將下一種試驗用試劑滴入凹槽內，反應完成后，啟動抽氣裝置，試驗用過的試劑透過超濾膜，流入中空腔底部；
[0018]S4:重復S3中的操作，直至試驗結束。
[0019]本發明的有益效果是:
[0020]1、本發明提供的試驗盒中的操作皿，是專為胚胎試驗設計的，保證在一個完整的試驗周期過程中，胚胎都保持在操作皿的凹槽內部，每步操作過程中，在不移動胚胎的前提下，方便更換試劑，減少每步操作都需要移動胚胎來更換液滴的操作，減少因反復移動胚胎而導致的胚胎丟失現象，提高試驗效率，簡化操作步驟，同時可避免用口吸管移取胚胎時試劑對操作者造成傷害的危險。
[0021]2、本發明試驗盒可高壓滅菌，多次重復利用，即節約試驗成本又環保。
[0022]3、本發明試驗盒中的操作皿各凹槽之間互不相通，可同時操作多組胚胎，也可同時進行不同的檢測試驗。
[0023]4、在操作皿本體的中空腔內設置斜面，在每個凹槽側壁設置引流柱，使試驗后的試劑可沿引流柱流到斜面上，再經由斜面流到連通口處，便于收集試驗過的試劑。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發明結構示意圖。
[0025]圖2為本發明主視結構示意圖。
[0026]圖3為【具體實施方式】I試驗結果圖，采用本發明進行小鼠胚胎HSP70蛋白免疫熒光檢測試驗所得到的HSP70蛋白表達情況圖。
[0027]圖4為【具體實施方式】2試驗結果圖，采用本發明進行小鼠囊胚Bcl-2蛋白和Bax蛋白免疫熒光檢測試驗所得到的Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達情況圖。
[0028]圖5為【具體實施方式】3試驗結果圖，采用本發明進行小鼠囊胚地衣紅染色，統計囊胚細胞總數試驗所得到的囊胚細胞染色結果圖。
[0029]其中，1-操作皿本體；2-凹槽；3-連通口 ；4-延伸部；5-止回閥；6-引流柱；7-斜面；8-塞骨；9-塞頭；10-超濾膜。
【具體實施方式】
[0030]以下結合附圖對本發明做進一步詳細的說明。
[0031]實施例1:
[0032]本實施例以小鼠胚胎HSP70蛋白免疫熒光檢測試驗為例，來說明本發明提供的胚胎試驗盒的結構和試驗方法。
[0033]試驗前，配制試劑。本試驗所應用的試劑包括固定液、孵育液、清洗液、封閉液A、封閉液B、PI染液和抗熒光淬滅劑。上述固定液為含4%的多聚甲醛的PBS液；上述孵育液為含 0.285g/LMgCl2、2.947g/LNaCl、4.77g/LHepesU02.69g/L 蔗糖，lg/LNaN3和 0.5%TritonX-100 的水溶液；上述清洗液為含 0.1 % Tffeen-20 和 0.01 % TritonX-1OO 的 PBS 液；上述封閉液A為含1% BSA的清洗液；上述封閉液B為含I % BSA和112.5g/L甘氨酸的清洗液；上述PI染液為PI含量為10 μ g/mL的PBS液；上述抗熒光淬滅劑為含8.9g/LDABC0、4.4% Tris-HCl (0.2M，pH7.4)，40%甘油的水溶液。配置好上述試劑，將其存放于棕色瓶中，加蓋密封，置于4°C冰箱保存，保存期限一年。
[0034]體外胚胎操作試驗盒，包括操作皿，操作皿包括操作皿本體1、操作皿蓋和密封塞，操作皿蓋可以覆蓋整個操作皿的上端面。操作皿本體I內部為中空腔，操作皿本體I側壁設置有連通口 3，使中空腔與外界相通，連通口 3向外有一延伸部4，延伸部4處設置有止回閥5，延伸部4末端為橡膠管，外接抽氣裝置；沿操作皿上端面向操作皿本體內，設置有多個互不相通的凹槽2，凹槽2的容積100 μ L，密封塞與凹槽2配合，每個凹槽2的頂部均有與其相匹配的密封塞，塞住凹槽口。凹槽2的槽底為超濾膜10，超濾膜10具有一定的弧度，HSP70蛋白直徑<超濾膜10孔徑<小鼠胚胎直徑，保證胚胎放置其中不能透過此膜。沿凹槽2側壁設置有引流柱6，引流柱6用于規范試驗試劑的流動。
[0035]密封塞包括塞架和塞頭9，塞架包括多條塞骨8，多條塞骨8匯聚到一點，形成傘骨形塞架，塞頭9設置在塞骨8的末端。塞骨8采用柔性材料，移動方便。塞骨8的個數與操作皿本體內凹槽2的個數相同，保證每個凹槽2均有與其配合的塞頭9。
[0036]操作皿內部，在操作皿底和凹槽2之間沿操作皿側壁設置有一斜面7，斜面7覆蓋整個操作皿底的范圍，保證每個凹槽2內流出的試劑均可落到斜面7上，斜面7較高的一端位于與連通口 3相對一側的操作皿本體的側壁上，較低的一端，位于連通口 3處；斜面7結構有利于試驗試劑流動到連通口 3處。每個引流柱6底部均與斜面7相接，試驗試劑可沿引流柱6流到斜面7上。
[0037]體外胚胎操作試驗盒還包括與其配套使用的操作皿盒，操作皿盒為不透光盒，可包裹住整個操作皿本體，操作皿盒底部覆蓋吸水材料，使用前加入少量水，使吸水材料浸濕。操作皿盒用于為操作皿提供一個黑暗潮濕的環境，以使其適用于特定的試驗需求。
[0038]試驗具體過程如下:
[0039]1、采用注射器作為抽氣裝置，試驗前，將注射器與延伸部4處的橡膠管相連接。
[0040]2、本試驗涉及四組胚胎，試驗前對四組胚胎記錄編號，打開四個凹槽2上的密封塞塞頭9。
[0041]3、將固定液50 μ L滴入凹槽2中，將各階段的四組小鼠胚胎分別移入不同的凹槽2中，并做好標記，蓋上操作皿蓋，固定，桑椹胚之前固定30min，桑椹胚后固定40min。固定結束后，輕輕抽注射器，使固定液透過超濾膜10，沿引流柱6被引出，流入中空腔內，流到斜面7上。
[0042]4、將孵育液50 μ L滴入凹槽2，蓋上操作皿蓋，對胚胎進行透膜處理，桑椹胚之前孵育30min，桑椹胚之后孵育40min。孵育結束后，輕輕抽注射器，使孵育液透過超濾膜10，沿引流柱6被引出，流入中空腔內，流到斜面7上。
[0043]5、將封閉液A50 UL滴入凹槽2，蓋上操作皿蓋，將胚胎在室溫下封閉處理lh。封閉結束后，輕輕抽注射器，使封閉液A透過超濾膜10，沿引流柱6流入中空腔內，流到斜面7上。
[0044]6、根據抗體使用說明書，用封閉液B，按1:50的比例稀釋HSP70抗體，將50 μ L稀釋后的HSP70抗體滴入凹槽2中，蓋上密封塞，斷開注射器與橡膠管的連接，并蓋上操作皿蓋，在操作皿盒中注入少量水，使操作皿盒中吸水材料浸濕，將操作皿放入操作盒中，4°C冰箱中過夜孵育。
[0045]7、從冰箱中取出操作盒，在室溫下靜置復溫30min，重新連接注射器與橡膠管，打開密封塞，輕輕抽注射器，使一抗孵育液透過超濾膜10，沿引流柱6流入中空腔內，流到斜面7上。使用清洗液清洗三次，每次滴加清洗液50 μ L，5min/次。每次清洗后都抽動注射器，使清洗液透過超濾膜10，沿引流柱6引出，流入中空腔內。
[0046]8、清洗后，根據FITC標記Ant1-GoatIgG說明書，將