水牛卵母細胞體外成熟培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于胚胎工程技術領域，尤其是水牛卵母細胞體外成熟培養方法。
【背景技術】
[0002] 作為胚胎生物工程技術研究的基礎只有的牛卵母細胞體外成熟培養技術，自上世 紀30年代至今，許多科學研究人員在牛卵母細胞體外生長、發育領域做了大量工作，對牛卵 母細胞培養條件進行了廣泛而深入地研究，并取得了較大的進展。
[0003] 近年來，水牛卵母細胞體外成熟技術取得了巨大進展，形成了一套較成熟的卵母 細胞體外成熟技術體系，但與體內成熟相比，仍有許多差距，特別是囊胚率和囊胚質量較 低，導致受精后的水牛卵母細胞發育率低下。現有的水牛卵母細胞體外成熟培養液為 TCM199+10%FBS，此培養液下桑葚率和囊胚率都比較低。生殖激素 oFSH能夠促進顆粒細胞擴 散，有利于卵母細胞成熟及后續發育;適當濃度的生殖激素17β_ E2能促進卵母細胞成熟分 裂的復始，顯著提高卵母細胞的受精能力及早期胚胎的發育能力;抗氧化劑GSH能夠促進水 牛卵母細胞成熟、卵裂向桑葚胚及囊胚方向發育。組合添加用于水牛卵母細胞成熟培養，具 有相互協同促進卵母細胞成熟的作用。

【發明內容】

[0004] 針對現有方法受精后的水牛卵母細胞發育率低下的問題，本發明提出一種水牛卵 母細胞體外成熟培養方法。
[0005] 本發明的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于包括下列步驟： 步驟一，卵母細胞準備:收集水牛卵巢，用含雙抗生理鹽水進行清洗，將卵巢上的血液 洗凈，消毒紗布吸干，吸取卵巢上的有腔卵泡，將卵泡液連同卵母細胞復合體(COCs)放入事 先添加吸卵液的試管中恒溫保存； 步驟二，IVM培養小滴制備:在培養皿中放入體外成熟培養液，制備IVM小滴，覆蓋上礦 物油，放入C02培養箱中平衡2h; 步驟三，體外成熟培養:將步驟一中收集的液體倒入有洗卵液的培養皿中，顯微鏡下查 找卵母細胞，將可用的A、B級卵母細胞移至加有DPBS的培養皿中洗滌，然后在體外成熟培養 液中洗滌，將洗滌后的卵母細胞放入步驟二制備的IVM培養小滴中進行成熟培養24~26h， 倒置顯微鏡下觀察，卵丘細胞擴散、卵周隙擴大并有第一極體(PBI)排出、胞質均一的為成 熟卵母細胞。
[0006] 步驟一中，選擇直徑2~8mm的有腔卵泡;將卵泡液連同卵母細胞復合體(COCs)放 入事先添加吸卵液的試管中，試管試管放置在30~35°C的恒溫水浴鍋中。
[0007] 步驟二中，在吸取卵母細胞前至少2h制備IVM小滴；制備好IVM小滴的培養皿放入 C〇2培養箱中平衡至少2h，平衡條件為39°C，5%C〇2的飽和空氣。
[0008] 步驟三中所有操作必須在39°C的顯微鏡恒溫臺上進行，并保持室溫在25~30°C， 在培養皿中加入洗卵液后，將洗卵液的試管收集的液體置入培養皿中并用洗卵液沖洗試管 2次，然后在顯微鏡下查找卵母細胞，將可用的A、B級卵母細胞移置加有DPBS的直徑35mm培 養皿中。
[0009]可選用的體外成熟培養液為： A液：TCM199+80-120 mL/L FBS 8液4液+0.008-0.012 11/11^〇卩5!1 〇液4液+〇.8-1.2 48/11^17042 0液4液+1.5-2.5臟〇1/165!1 E液：A液+0.008-0.012 u/mL oFSH+0.8-1.2 yg/mL 17β-Ε2+1·5-2.5 mmol/L GSH 上述體外成熟培養液對水牛卵母細胞成熟率、卵裂率、8-cel 1率、桑葚率及囊胚率影響 見表1。 「00101 豐一
[0011] 最優的，所述的體外成熟培養液為:TCM199+100mL/L FBS+0.01u/mL oFSH+l.Oyg/ mL 170-E2+2.Ommol/L GSH。
[0012] 在卵母細胞成熟培養液中添加生殖激素 oFSH、17β- E2和抗氧化劑GSH均能夠促進 水牛卵母細胞體外成熟及卵裂，特別是GSH能夠促進卵裂向桑葚及囊胚方向發育。成熟培養 液采用生殖激素〇FSH、170- E2和抗氧化劑GSH組合，與單獨添加對比，組合添加總體效果更 好，更能促進水牛卵母細胞成熟發育。
[0013] 本發明的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，能顯著促進卵母細胞的細胞質成熟， 解決了目前水牛體外成熟的卵母細胞受精后胚胎體外發育率低的問題;本發明的成熟培養 液能促進水牛卵母細胞成熟發育，且對維持卵母細胞和早期胚胎形態有良好作用。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1:步驟一，卵母細胞的準備:收集水牛卵巢，所有卵巢用保溫瓶在25~35 °C 的含雙抗生理鹽水中3~4h內運回。用肥皂清洗雙手，將卵巢轉換到廣口保溫瓶中，倒入含 雙抗生理鹽水至浸沒卵巢，用手清洗卵巢，盡量將卵巢上的血液洗凈，消毒紗布吸干，吸取 卵巢上直徑2mm的有腔卵泡，將卵泡液連同卵母細胞復合體(COCs)放入事先添加吸卵液的 試管中（試管放置在30~35°C的恒溫水浴鍋中）。
[0015] 步驟二，IVM培養小滴制備：在吸取卵母細胞前至少2h制備IVM小滴。IVM小滴的制 備必須在超凈工作臺操作。用微量移液器吸取50yL IVM培養液，滴于直徑35mm的培養皿中， 每個培養皿制備7個IVM小滴。小滴制備完畢后，覆蓋上礦物油，放入C02培養箱中平衡2h。平 衡條件為39°C，5%C0 2的飽和空氣； 步驟三，體外成熟培養:所有操作必須在顯微鏡恒溫臺上(39 °C )進行，并保持室溫在25 ~30°C左右，在大培養皿中加入洗卵液后，將吸卵液的試管收集的液體置入培養皿中并用 洗卵液沖洗試管2次。然后在顯微鏡下查找卵母細胞，將可用的A、B級卵母細胞移置加有 DPBS的直徑35mm培養皿中。將卵母細胞再在DPBS的培養皿中洗滌2次，體外成熟培養液中洗 滌2次，立即將卵母細胞轉移至IVM培養小滴中（10個卵母細胞/小滴)進行成熟培養。培養條 件為39°C，5%C0 2的飽和空氣，培養時間為24h，在倒置顯微鏡下觀察卵丘細胞擴散、卵周隙 擴大并有第一極體(PBI)排出、胞質均一來判斷卵母細胞成熟。
[0016]本例采用的成熟培養液為TCM199++100mL/L FBS +2.0mmol/L GSH 實施例2:步驟一，卵母細胞的準備:收集水牛卵巢，所有卵巢用保溫瓶在25~35°C的含 雙抗生理鹽水中3~4h內運回。用肥皂清洗雙手，將卵巢轉換到廣口保溫瓶中，倒入含雙抗 生理鹽水至浸沒卵巢，用手清洗卵巢，盡量將卵巢上的血液洗凈，消毒紗布吸干，吸取卵巢 上直徑8mm的有腔卵泡，將卵泡液連同卵母細胞復合體(COCs)放入事先添加吸卵液的試管 中（試管放置在30~35°C的恒溫水浴鍋中）。
[0017] 步驟二，IVM培養小滴制備：在吸取卵母細胞前至少2h制備IVM小滴。IVM小滴的制 備必須在超凈工作臺操作。用微量移液器吸取50yL IVM培養液，滴于直徑35mm的培養皿中， 每個培養皿制備7個IVM小滴。小滴制備完畢后，覆蓋上礦物油，放入C02培養箱中平衡2h。平 衡條件為39°C，5%C0 2的飽和空氣。
[0018] 步驟三，體外成熟培養:所有操作必須在顯微鏡恒溫臺上(39°C)進行，并保持室溫 在25~30°C左右，在大培養皿中加入洗卵液后，將吸卵液的試管收集的液體置入培養皿中 并用洗卵液沖洗試管2次。然后在顯微鏡下查找卵母細胞，將可用的A、B級卵母細胞移置加 有DPBS的直徑35mm培養皿中。將卵母細胞再在DPBS的培養皿中洗滌2次，成熟培養液中洗滌 2次，立即將卵母細胞轉移至IVM培養小滴中（10個卵母細胞/小滴)進行成熟培養。培養條件 為39°C，5 %C02的飽和空氣，培養時間為24h，在倒置顯微鏡下觀察卵丘細胞擴散、卵周隙擴 大并有第一極體(PBI)排出、胞質均一來判斷卵母細胞成熟。
[0019] 本例采用的成熟培養液為!^199+1〇〇11^/1?85+〇.〇111/11^(^5!1+1.(^8/11^170-E2+2.0mmol/L GSH。
【主權項】
1. 水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于包括下列步驟： 本發明的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于包括下列步驟： 步驟一，卵母細胞準備：收集水牛卵巢，用含雙抗生理鹽水進行清洗，將卵巢上的血液 洗凈，消毒紗布吸干，吸取卵巢上的有腔卵泡，將卵泡液連同卵母細胞復合體(COCs)放入事 先添加吸卵液的試管中恒溫保存； 步驟二，IVM培養小滴制備:在培養皿中放入體外成熟培養液，制備IVM小滴，覆蓋上礦 物油，放入C02培養箱中平衡2h; 步驟三，體外成熟培養:將步驟一中收集的液體倒入有洗卵液的培養皿中，顯微鏡下查 找卵母細胞，將可用的A、B級卵母細胞移至加有DPBS的培養皿中洗滌，然后在體外成熟培養 液中洗滌，將洗滌后的卵母細胞放入步驟二制備的IVM培養小滴中進行成熟培養24~26h， 倒置顯微鏡下觀察，卵丘細胞擴散、卵周隙擴大并有第一極體(PBI)排出、胞質均一的為成 熟卵母細胞。2. 如權利要求1所述的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于步驟一中，選擇直 徑2~8mm的有腔卵泡；將卵泡液連同卵母細胞復合體(COCs)放入事先添加吸卵液的試管 中，試管試管放置在30~35°C的恒溫水浴鍋中。3. 如權利要求1所述的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于步驟二中，在吸取 卵母細胞前至少2h制備IVM小滴;制備好IVM小滴的培養皿放入C0 2培養箱中平衡至少2h，平 衡條件為39°C，5%C02的飽和空氣。4. 如權利要求1所述的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于步驟三中操作在 39°C的顯微鏡恒溫臺上進行，保持室溫在25~30°C，在培養皿中加入洗卵液后，將洗卵液的 試管收集的液體置入培養皿中并用洗卵液沖洗試管2次，然后在顯微鏡下查找卵母細胞，將 可用的A、B級卵母細胞移置加有DPBS的直徑35mm培養皿中。5. 如權利要求1所述的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于體外成熟培養液 由 TCM199、FBS、oFSH、17β-Ε2、GSH 組成。
【專利摘要】本發明的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，其特征在于包括卵母細胞準備、IVM培養小滴制備以及體外成熟培養三個步驟，其采用的體外成熟培養液由TCM199、FBS、oFSH、17β-E2、GSH組成。本發明的水牛卵母細胞體外成熟培養方法，能顯著促進卵母細胞的細胞質成熟，解決了目前水牛體外成熟的卵母細胞受精后胚胎體外發育率低的問題；本發明的成熟培養液能促進水牛卵母細胞成熟發育，且對維持卵母細胞和早期胚胎形態有良好作用。
【IPC分類】C12N5/075
【公開號】CN105624100
【申請號】CN201610208646
【發明人】蘇雷
【申請人】云南中科胚胎工程生物技術有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年4月6日