蒽鉻紅a(acra)及其衍生物在磷酸化蛋白質熒光檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及磷酸化蛋白質熒光檢測技術，具體地說涉及磷酸化蛋白質的一種新的 熒光染料。
【背景技術】
[0002] 在生命科學研究領域，離不開對生命的基本物質蛋白質的研究，也就離不開對蛋 白質的檢測技術。尤其是最近幾年，隨著蛋白質組學的飛速發展，使我們對蛋白質的檢測技 術有了更高的要求。
[0003] 蛋白質磷酸化修飾是最常見也是最重要的蛋白質翻譯后修飾方式之一，也是目前 蛋白質組學研究的熱點之一，對于目前的研究尚且存在專屬性檢測方法的不足，磷酸化過 程基本上發生在酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等氨基酸殘基上。蛋白質的這一修飾與細胞的增 殖、分化、發育、凋亡等許多生命活動息息相關，據多年的研究證明，蛋白磷酸化與許多的臨 床疾病有著復雜的關系。因此開發一種專屬性強的檢測方法成為了研究的突破點。
[0004] 現存的凝膠上磷酸化蛋白質檢測方法包括經典的Pro-Q Diamond檢測技術及 Stains-all檢測技術等。其中Pro-Q Diamond是目前特異性最強、應用最廣、操作較為簡便、 靈敏度較高的檢測方法。
[0005] 本發明首次將ACRA及其衍生物應用于磷酸化蛋白質熒光檢測，相比于其他檢測技 術，具有檢測限低，專屬性強等眾多優點，在蛋白質組學研究中將具有廣泛的應用前景。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于建立一種蒽絡紅A(Anthracene Chrome Red A，ACRA)及其衍生 物在磷酸化蛋白質熒光檢測中的應用。
[0007] 本發明所述的ACRA相關化合物是指以ACRA為母核的鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、 硫酸氫鹽、硝酸鹽、鞣酸鹽、氫碘酸鹽等。
[0008] ACRA 母核為：
[0009]
[0010] 下面是本發明一個可用的凝膠檢測方法，其包括步驟：
[0011 ] 1)將經SD S-PAGE電泳后的蛋白質樣品凝膠置于固定液中固定2次，每次10~ 30min;棄固定液，然后用去離子水沖洗5~30min;優選的固定時間為15min，去離子水沖洗 時間為15min，固定液可以是含有50%甲醇和10%乙酸的水溶液；
[0012] 2)加入熒光染色液染色40~90min，其中所述染色液為含按摩爾濃度比1~ΙΟμΜ的 ACRA及按溶液體積比0.1~0.5 %的乙酸；優選的ACRA濃度為3μΜ，優選的乙酸濃度為 0.25%，優選的染色時間為60min;
[0013] 3)將染色完畢的凝膠置于脫色液中脫色10~30min，其中所述脫色液為含按摩爾 濃度比30~100mM的乙酸鈉，按摩爾濃度比5~20μΜ的鋁離子以及按溶液體積比5~20%的 丙二醇和20~40 %的乙醇;優選的乙酸鈉濃度為50mM，優選的鋁離子濃度為9μΜ，優選的丙 二醇濃度為10%，優選的乙醇濃度為30%，優選的脫色時間為20min;
[0014] 4)將上述經過脫色的凝膠進行第二次脫色，脫色時間為0.5~5min，其中所述的脫 色液為含按溶液體積比5~20 %的丙二醇和20~40 %的乙醇;其中優選的脫色時間為lmin， 優選的丙二醇濃度為1 〇 %，優選的乙醇濃度為30 %。
[0015] 5)檢測，運用Typhoon 9400?掃描儀進行數據采集。
[0016]本發明方法具有如下優點：
[0017] 1)高靈敏度:可媲美經典磷酸化蛋白檢測試劑盒Pro-Q Diamond;
[0018] 2)操作簡單迅速:操作步驟少，可在130min內完成；
[0019] 3)重現性穩定:受溫度、搖床擺動頻率等外部條件影響較小；
[0020] 4)染色背景好；
[0021 ] 5)線性關系好:精確，能在車父大范圍內對蛋白質進彳丁半定量測定；
[0022] 6)可逆性好:容易脫色；
[0023] 7)兼容性好:可與MALDI-T0F等質譜儀器以及其他染色方法高度兼容；
[0024] 8)使用安全、環保、低毒；
[0025] 9)專屬性強；
[0026] 1〇)成本低。
【附圖說明】
[0027] 圖1. ACRA的化學結構；
[0028] 圖2.ACRA染色法和其他常用染色法靈敏度和特異性的比較。其中（A)為ACRA染色 法，（B)為考馬斯亮藍(CBBR)染色法，（C)為Pro-Q Diamond染色法，（D)為Stains-all染法。 磷酸化蛋白質為商品化標準品，從上至下分別為磷酸化酶b(phosphorylase b，非磷酸化蛋 白），牛血清白蛋白（BSA，非磷酸化蛋白），卵白蛋白（0VA，磷酸化蛋白），α-酪蛋白（α-casein，磷酸化蛋白），β_酪蛋白（β-casein，磷酸化蛋白），κ-酪蛋白（κ-casein，磷酸化蛋 白），卵白素(Avidin，非磷酸化蛋白）和溶解酵素(Lysozyme，非磷酸化蛋白）。蛋白質載樣量 (從左至右，每條帶）如下：500,250，125,62,32，16,8,4,2，lng。
[0029] 圖3.ACRA染色法選擇性考察。選用a-casein(含8個磷酸化位點）作為研究對象，比 較其去磷酸化后(經磷酸酶處理），ACRA染色法對其的檢測靈敏度的變化。（A)為ACRA染色 法，（B)為Pro-Q Diamond染色法，（C)為SYPR0 Ruby染色法。
[0030]圖4.ACRA染色法對磷酸化蛋白檢測的線性動態范圍考察。（A)為ACRA染色法，（B) 為Pr〇-Q Diamond染色法。
【具體實施方式】：
[0031]下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明 本發明，而不能限制本發明的保護范圍。
[0032] 實施例1 ACRA染色
[0033]槲皮素磷酸化蛋白質熒光染色實驗采用下述步驟進行：
[0034] (1)固定:將電泳結束后的凝膠放置于50mL 50%乙醇/10%乙酸的固定液中固定2 次，每次30分鐘；
[0035] (2)水洗:將凝膠放入50mL去離子水中水洗15分鐘；
[0036] (3)染色:將凝膠放入50mL 3yMACRA/0.25%乙酸染色液中染色60分鐘；
[0037] (4)脫色:將凝膠放入50mM乙酸鈉/9μΜ Al3+/10%丙二醇/30%乙醇脫色液中脫色 20分鐘；
[0038] (5)脫色:將凝膠放置于50mL10%丙二醇/30%乙醇溶液中脫色1分鐘。
[0039] (6)運用Typhoon 9400?掃描儀進行數據采集。
[0040] 按照上述方法分別用ACRA的鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、鞣酸 鹽、氫碘酸鹽進行蛋白質染色，結果表明用這些衍生物均能得到類似于槲皮素的檢測結果。 SDS-PAGE參照《分子克隆實驗指南》第三版相關部分進行。
[0041] 實驗例1 ACRA與其他常用染色法效果對比
[0042] 采用不同方法進行染色，（A)為ACRA染色法，（B)為考馬斯亮藍(CBBR)染色法，（C) 為Pro-Q Diamond染色法，（D)為Stains-all染法。磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白為商品化標 準品，從上至下分別為磷酸化酶b(phosphorylase b，非磷酸化蛋白），牛血清白蛋白（BSA， 非磷酸化蛋白），卵白蛋白（0VA，磷酸化蛋白），α-酪蛋白（α-casein，磷酸化蛋白），β-酪蛋白 (β-casein，磷酸化蛋白），κ-酪蛋白（κ-casein，磷酸化蛋白），卵白素(Avidin，非磷酸化蛋 白）和溶解酵素(Lysozyme，非磷酸化蛋白）。蛋白質載樣量(從左至右，每條帶）如下：500， 250，125,62,32，16,8,4,2，lng。結果如圖2所示，ACRA染色法靈敏度比Stains-all染色法高 8-16倍，與Pro-Q Diamond染色法相當。其中ACRA染色法采用實施例1的方法進行，Pro-Q Diamond，Stains-al 1，SYPR0 Ruby和CBBR染色法分別按下述方式進行：
[0043] Pr〇-Q Diamo