用于rna遞送的可電離的陽離子脂質的制作方法
【專利摘要】描述了式(I)的化合物或其可藥用鹽，其中R1和R2相同或不同，各自是具有1至9個碳的直鏈或支鏈烷基，或者具有2至11個碳原子的烯基或炔基；L1和L2相同或不同，各自是具有5至18個碳原子的直鏈烷基，或者與N形成雜環；X1是鍵，或者是?CO?O?，由此形成L2?CO?O?R2；X2是S或O；L3是鍵或低級烷基，或者與N形成雜環；R3是低級烷基；并且R4和R5相同或不同，各自是低級烷基。
【專利說明】用于RNA遞送的可電離的陽離子脂質
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年11月18日提交的美國臨時專利申請No. 61/905,724的權益， 其內容通過引用整體并入本文。
【背景技術】
[0003] 目前，大量不同類型的核酸正被開發作為用于治療多種疾病的治療劑。運些核酸 包括基因治療中的DNA、基于質粒的干擾核酸、用于RNA干擾(RNA interference,RNAi)的小 干擾核酸，包括siRNA、miRNA、反義分子、核酶和適配體。隨著運些分子的開發，已發展出W W下形式對其進行生產的需求，所述形式穩定且具有長貨架期（shelf-life)并且可容易地 引入到無水有機溶劑或無水極性非質子溶劑中W實現核酸的包封而沒有可在極性水溶液 或非極性溶劑中發生的副反應。
[0004] 本發明設及有利于胞內遞送生物活性和治療性分子的新脂質組合物。本發明還設 及含有此類脂質組合物并且可用于向患者的細胞中遞送治療有效量生物活性分子的藥物 組合物。
[0005] 將治療性化合物遞送至對象對其治療效果而言是重要的并且運通常可因該化合 物到達所祀向細胞和組織的有限能力而受到阻礙。通過多種遞送方式對此類化合物進行改 進W進入所祀向的組織細胞至關重要。本發明設及有利于生物活性分子的祀向胞內遞送的 新脂質。
[0006] 通常無法實現有效地祀向患者組織的生物活性分子的實例包括（1)多種蛋白質， 包括免疫球蛋白；（2)多核巧酸，例如基因組DNA、CDNA或mRNA;(3)反義多核巧酸;和(4)很多 低分子量化合物，不管是合成的還是天然存在的，例如膚類激素和抗生素。
[0007] 醫療從業者現在正面臨的基本挑戰之一是目前大量不同類型的核酸正被開發作 為用于治療多種疾病的治療劑。運些核酸包括基因治療中的DNA、用于RNA干擾(RNAi)的質 粒小干擾核酸（interfering nucleic acid, iNA)、反義分子、核酶、antagomir、微RNA和適 配體。隨著運些核酸的開發，存在生產易于制備并且可容易地遞送至祀組織的脂質制劑的 需求。
[000引發明概述
[0009] 本文中描述了式1的化合物：
[0010]
[00川其中
[0012] Ri和化相同或不同，各自是直鏈或支鏈的烷基、締基或烘基，
[0013] 。和1^2相同或不同，各自是具有至少5個碳原子的直鏈烷基，或者與N形成雜環，
[0014] Xi是鍵，或者是-CO-O-，由此形成L2-C0-0-R2，
[001引 X2是S或0，
[0016] L3是鍵或低級烷基，
[0017] Rs是低級烷基，
[001引R4和化相同或不同，各自是低級烷基。
[0019] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3不存在，Ri和R2各自由至少7個碳原子組成， Rs是亞乙基或亞正丙基(n-propylene)，R4和R日是甲基或乙基，并且^和1^2各自由具有至少5 個碳原子的直鏈烷基組成。
[0020] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3不存在，Ri和R2各自由至少7個碳原子組成， Rs是亞乙基或亞正丙基，R4和化是甲基或乙基，并且^和1^2各自由具有至少5個碳原子的直鏈 烷基組成。
[0021] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3不存在瓜和R2各自由具有至少9個碳原子的 締基組成，R3是亞乙基或亞正丙基，R4和Rs是甲基或乙基，并且。和12各自由具有至少5個碳 原子的直鏈烷基組成。
[0022] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3是亞甲基，Ri和R2各自由至少7個碳原子組 成，R3是亞乙基或亞正丙基，R4和Rs是甲基或乙基，并且^和12各自由具有至少5個碳原子的 直鏈烷基組成。
[0023] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3是亞甲基，Ri和R2各自由至少9個碳原子組 成，R3是亞乙基或亞正丙基，R4和Rs各自是甲基，Li和L2各自由具有至少7個碳原子的直鏈燒 基組成。
[0024] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3是亞甲基，Ri由具有至少9個碳原子的締基組 成并且R2由具有至少7個碳原子的締基組成，R3是亞正丙基，R4和Rs各自是甲基，Li和L2各自 由具有至少7個碳原子的直鏈烷基組成。
[0025] 本文中還描述了式1的化合物，其中L3是亞甲基，Ri和化各自由具有至少9個碳原子 的締基組成，R3是亞乙基，R4和Rs各自是甲基，Li和L2各自由具有至少7個碳原子的直鏈烷基 組成。
[0026] 本文中還描述了具有W下結構的化合物：
O
[0027]
[002引
[0029] 1 本文中還描述了具有W下結構的化合物：
[0031：
[0032：
[0033：
[0034：
[0035：
[003t
[0037：
[0038：
[0039：
[0040：
[0041：
[0042：
[0043：
[0044]本文中還描述了具有W下結構的化合物：
[0045]
[0046]
[0047]
[004引
[0049]
[0050] 本文中還描述了下表1中列出的ATX-OOl至ATX-032中列舉的任意化合物或其可藥 用鹽，其在包含脂質分子的納米顆粒或雙層的脂質組合物中。所述脂質雙層優選地還包含 中性脂質或聚合物。所述脂質組合物優選地包含液體介質。所述組合物優選地還包封有核 酸。所述核酸優選地具有通過利用RNA干擾(RNAi)來抑制祀基因表達的活性。所述脂質組合 物優選地還包含核酸和中性脂質或聚合物。所述脂質組合物優選地包封所述核酸。
[0051] 所述核酸優選地具有抑制祀基因表達的活性。所述祀基因優選地是與炎癥相關的 基因。
[0052] 本文中還描述了用于通過使用上述任意組合物來將核酸導入哺乳動物細胞中的 方法。所述細胞可在肝、肺、腎、腦、血液、脾或骨中。所述組合物優選地靜脈內、皮下、腹膜內 或銷內施用。優選地，本文中所述的組合物用于治療癌癥或炎性疾病的方法。所述疾病可W 是選自W下的一種：免疫素亂（immune disorder)、癌癥、腎病、纖維變性疾病（fibrotic disease)、遺傳異常、炎癥和屯、血管疾病。
[0化3] 附圖簡述
[0054] 圖1示出了經不同陽離子脂質包封的SiRNA的敲減化nockdown)活性。所述脂質包 括MC3(0.3mg/kg)、NCl(0.3mg/kg)、ATX-547(0.3mg/kg)、ATX-OO1(0.3和1.Omg/kg)、ATX-002(0.3和I .Omg/kg)和ATX-003(0.3和I .Omg/kg)。示出了與單獨注射載劑相比在將SiRNA 制劑施用于巧7BL6小鼠之后小鼠血漿中因子VII敲減物的量。包括異常和正常人血漿中因 子Vn的量作為對照。星號（*)表示因子Vn水平在統計學上顯著降低(p<0.01)。
[0055] 圖2示出了 SiRNA對因子Vn活性的作用的評價，其基于圖2中所示并且相對于與單 獨載劑相比的敲減百分比歸一化的結果。
[0056] 圖3示出了經不同陽離子脂質包封的SiRNA的敲減活性。所述脂質包括MC3(0.3和 1.5mg/kg)、NCl (0.3mg/kg)、4巧47 (0.1 和0.3mg/kg)、AT004 (0.3)、AT006 (0.3和 1. Omg/kg)、 ATX-010(0.3mg/kg)和ATOOl (0.3和1.5mg/kg)。示出了與單獨注射載劑相比在將SiRNA制劑 施用于巧7BL6小鼠之后小鼠血漿中因子VII敲減物的量。包括異常和正常人血漿中因子VII 的量作為對照。星號（*)表示因子vn水平在統計學上顯著降低(p<o.01)。
[0057]圖4示出了 SiRNA對因子vn活性的作用的評價，其基于圖2中所示并且相對于與單 獨載劑相比的敲減百分比歸一化的結果。
【具體實施方式】
[005引"至少一個/種"意指一個/種或更多個/種（例如，1至3個/種、1至2個/種或1個/ 種)。
[0059] "組合物"包括含有特定量的指定成分的產物，W及由特定量的指定成分之組合直 接或間接得到的任意產物。
[0060] "與…組合"當用于描述式（1)化合物與其他藥物在本發明的治療方法中的施用時 意指式(1)化合物與其他藥物W單獨劑型依次或同時施用，或者W同一劑型同時施用。
[0061] "哺乳動物"意指人或其他哺乳動物，或者意指人類。
[0062] "患者"包括人和其他哺乳動物二者，優選人。
[0063] "烷基"是飽和或不飽和的直鏈或支鏈控鏈。在多個實施方案中，所述烷基具有1至 18個碳原子，即，是Ci-Cis基團，或者是Ci-Ci2基團、Ci-Cs基團或C1-C4基團。獨立地，在多個實 施方案中，所述烷基具有0個分支（即，是直鏈）、1個分支、2個分支或多于2個分支。"締基"是 可具有1個雙鍵、2個雙鍵、多于2個雙鍵的不飽和的烷基。"烘基"（alkynal)是可具有1個S 鍵、2個=鍵或多于2個=鍵的不飽和烷基。烷基鏈可任選地經1個取代基（即，烷基是經單取 代的），或1至2個取代基，或1至3個取代基，或1至4個取代基等取代。所述取代基可選自徑 基、氨基、烷基氨基、棚基(boronyl)、簇基、硝基、氯基等。當烷基引入一個或更多個雜原子 時，在此可將該烷基稱為雜烷基。當烷基上的取代基是控時，則將得到的基團簡稱為經取代 的烷基。在多個方面，烷基包括取代基在內具有少于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11、10、9、8或7個碳。
[0064] "低級烷基"意指在鏈中具有約1至約6個碳原子的基團，所述鏈可W是直鏈或支鏈 的。合適烷基的非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正下基、叔下基、正戊基和己 基。
[0065] "烷氧基"意指烷基-0-基團，其中烷基如上文所定義的。烷氧基的非限制性實例包 括：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正下氧基和庚氧基。與母體部分的鍵是通過酸氧。
[0066] "烷氧基烷基"意指烷氧基-烷基-基團，其中烷氧基和烷基如前文所定義的。優選 的烷氧基烷基包含低級烷基。與母體部分的鍵是通過烷基。
[0067] "烷基芳基"意指烷基-芳基-基團，其中烷基和芳基如前文所定義的。優選的烷基 芳基包含低級烷基。與母體部分的鍵是通過芳基。
[0068] "氨基烷基"意指NH2-烷基-基團，其中烷基如上文所定義，其通過烷基與母體部分 務主厶 臺口口 O
[0069] "簇基烷基"意指HOOC-烷基-基團，其中烷基如上文所定義，其通過烷基與母體部 分結合。
[0070] "商購可得的化學品"W及本文中所示的實施例中使用的化學品可從標準的商業 來源獲得，其中運樣的來源包括例如Acros Organics(Pittsbur曲，Pa. )、Sigma-Ahich ChemicaKMilwaukee,Wis.)、Avocado Research(Lancashire，U.K.)、Bionet(Cornwal1， U.K.)、Boron MoIecular(Research Triangle Park，N.C.)、Combi-Blocks(San Diego， Calif.)、Eastman Organic Chemicals、Eastman Kodak Company(Rochester，N. Y.)、 Fisher Scientific Co .(Pittsburgh,Pa.)、Frontier Scientific(Logan,Utah)、ICN Biomedicals，Inc.(Costa Mesa，Cal if .)、Lancaster Synthesis(Windham，N.H.)、 Maybridge Chemical Co .(Cornwall，U.K.)、Pierce Chemical Co .(Rockford，111.)、 Riedel de Haen(Hannover,Germany)、Spectrum Quality Product，Inc.(New Brunswick， N.J.)、TCI Ame;rica(Po;rtland，Oreg.)和Wako Chemicals USA,Inc. (Richmond,Va.)。
[0071] 本領域普通技術人員知曉，"化學文獻中所述的化合物"可通過設及化合物和化學 反應的參考書和數據庫確定。詳述可用于制備本文中所公開化合物之反應物的合成或者提 供參考描述本文中所公開化合物之制備的文獻的合適參考書和論文包括例如，"Synthetic Organic Chemistry" ,John Wiley and Sons , Inc .New York; S. R. Sandler 等，('Organic Functional Group Preparations，"第2片反，Academic Press,New York,1983；H.0.House, "Modern SyntheticReactions，"第2版，W.A.Benjamin，Inc.Menlo Park,Calif.,1972； T丄.Glichrist，('Heterocyclic Chemistry，"第2版John Wiley and Sons,New York, 1992;J.March，"Advanced Organic Chemistry:re曰ctions,Mechanisms and Structure，'' 第5版，Wil巧Interscience，New化rk，2001;特定和類似的反應物還可通過由美國化學會 化學文摘服務社（化emical Abshact Service of the American 化emical Society)制 作之已知化學品的索引來確定，其可在大部分的公共和大學圖書館W及通過在線數據庫得 到(更多細節可聯系美國化學會，Washington,D.C.)。已知但在目錄中不可商購得到的化學 品可W通過定制化學合成機構制備，其中許多標準的化學品供應機構(例如，上列機構）提 供定制化合成服務。
[0072] "面代"意指氣代、氯代、漠代或艦代基團。優選的是氣代、氯代或漠代，并且更優選 的是氣代和氯代。
[0073] "面素"意指氣、氯、漠或艦。優選的是氣、氯和漠。
[0074] "雜烷基"是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、包含碳和至少1個雜原子的鏈。在多 個實施方案中，雜烷基可具有1個雜原子，或1至2個雜原子，或1至3個雜原子，或1至4個雜原 子。在一個方面，雜烷基鏈包含1至18個(即，1-18個)成員原子(碳和雜原子），并且在多個實 施方案中包含1至12,或1至6,或1至4個成員原子。獨立地，在多個實施方案中，雜烷基具有0 個分支（即，是直鏈）、1個分支、2個分支或多于2個分支。獨立地，在一個實施方案中，雜烷基 是飽和的。在另一個實施方案中，雜烷基是不飽和的。在多個實施方案中，不飽和的雜烷基 可具有1個雙鍵、2個雙鍵、多于2個雙鍵，和/或1個=鍵、2個=鍵或多于2個=鍵。雜烷基鏈 可W是經取代或未經取代的。在一個實施方案中，雜烷基鏈是未經取代的。在另一個實施方 案中，雜烷基鏈是經取代的。經取代的雜烷基鏈可具有1個取代基（即，經單取代的），或者可 具有1至2個取代基，或1至3個取代基，或1-4個取代基等。示例性的雜烷基取代基包括醋(-C (O)-O-R)和幾基(-C(O)-)。
[0075] "徑基烷基"意指HO-烷基-基團，其中烷基如前文所定義的。優選的徑基烷基包含 低級烷基。合適徑基烷基的非限制性實例包括徑甲基和2-徑基乙基。
[0076] "水合物"為其中溶劑分子是出0的溶劑合物。
[0077] "溶劑合物"意指本公開內容的化合物與一個或更多個溶劑分子的物理締合物。運 種物理締合物設及不同程度的離子鍵和共價鍵鍵合，包括氨鍵鍵合。在某些情況下，溶劑合 物將能夠被分離，例如當一個或更多個溶劑分子并入結晶固體的晶格中時。"溶劑合物"涵 蓋溶液相溶劑合物和可分離的溶劑合物二者。合適溶劑合物的非限制性實例包括乙醇合 物、甲醇合物等。
[0078] 術語"經取代的"意指被不同于氨的指定基團取代，或者被一個或更多個可相同或 不同的基團（group )、部分或基團(rad i Ca 1)取代，其中每個例如獨立進行選擇。
[0079] "反義核酸"意指非酶促核酸分子，其借助RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白質核 酸;E曲Olm等1993化ture 365，566)相互作用與祀RNA結合并且改變祀RNA的活性(有關綜 述，參見Stein和Cheng, 1993Science 261,1004W及Woolf等，美國專利No.5,849,902)。通 常來說，反義分子沿該反義分子的單個連續序列與祀序列互補。然而，在某些實施方案中， 反義分子可與底物結合使得該底物分子形成環，和/或反義分子可結合W使反義分子形成 環。因此，反義分子可與兩個(或甚至更多個)非連續的底物序列互補，或者反義分子的兩個 (或甚至更多個)非連續序列部分可與祀序列互補，或者運兩種情況均可。另外，反義DNA可 用于借助DNA-RNA相互作用來祀向RNA，從而激活RNA酶H，其消化雙鏈體中的祀RNA。反義寡 核巧酸可包含一個或更多個能夠激活祀RNA的RNA酶H切割的RNA酶H活化區。反義DNA可化學 合成或者通過使用單鏈DNA表達載體或其等同物表達。"反義RNA"是具有與祀基因 mRNA互補 的序列的RNA鏈，其可通過與祀基因 mRNA結合來誘導RNAi。"反義RNA"是具有與祀基因 mRNA 互補的序列的RNA鏈，并且被認為通過與祀基因 mRNA結合來誘導RNAi有義RNA"具有與反 義RNA互補的序列并且退火于其互補的反義RNA而形成iNA。運些反義和有義RNA常規地用 RNA合成儀來常規合成。
[0080] "核酸"指脫氧核糖核巧酸或核糖核巧酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術語涵 蓋合成的、天然存在的或非天然存在的含有已知核巧酸類似物或者經修飾骨架殘基或鍵的 核酸，其與參照核酸具有類似的結合特異性，并且W與參照核巧酸類似的方式代謝。運樣的 類似物的實例包括但不限于硫代憐酸醋、氨基憐酸醋、甲基麟酸醋、手性甲基麟酸醋、2'-0-甲基核糖核巧酸、膚-核酸(P巧tide-nucleic acid,PM)。
[0081 ] "RNA"意指包含至少1個核糖核巧酸殘基的分子。"核糖核巧酸"意指在P-D-巧喃核 糖部分的2'位具有徑基的核巧酸。該術語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA，例如經部分純 化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA，W及與天然存在RNA的不同之處在于一 個或更多個核巧酸的添加、缺失、替換和/或改變的經改變RNA。運樣的改變可包括例如向干 擾RNA的末端或者在內部(例如在該RNA的一個或更多個核巧酸處)添加非核巧酸物質。本發 明的RNA分子中的核巧酸還可包含非標準核巧酸，例如非天然存在的核巧酸或者化學合成 的核巧酸或脫氧核巧酸。可將運些經改變的RNA稱為類似物或天然存在RNA的類似物。本文 中使用的術語"核糖核酸"和"RNA"指包含至少一個核糖核巧酸殘基的分子，包括siRNA、反 義RNA、單鏈RNA、微RNA、mRNA、非編碼RNA和多價RNA。核糖核巧酸是在P-D-巧喃核糖部分的 2'位具有徑基的核巧酸。運些術語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA，例如經部分純化的 RNA、基本純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA，W及與天然存在RNA的不同之處在于一個或 更多個核巧酸的添加、缺失、替換、修飾和/或改變的經修飾和經改變的RNAdRNA的改變可包 括例如向干擾RNA的末端或者在內部(例如在RNA的一個或更多個核巧酸處)添加非核巧酸 物質。RNA分子中的核巧酸包括非標準核巧酸，例如非天然存在的核巧酸或化學合成的核巧 酸或脫氧核巧酸。可將運些經改變的RNA稱為類似物。
[0082] 本文中使用的"核巧酸"如本領域中公認的包含天然堿基(標準堿基）W及本領域 中公知的經修飾堿基。此類堿基一般位于核巧酸糖部分的1'位。核巧酸一般包含堿基、糖和 憐酸部分。核巧酸可W是未經修飾的或者可在糖、憐酸和/或堿基部分發生了修飾(還可互 換地稱為核巧酸類似物、經修飾的核巧酸、非天然核巧酸、非標準核巧酸等；參見，例如， Usman和McSwiggen，同上；Eckstein，等，國際PCT公開No. WO 92/07065; Usman，等，國際PCT 公開No.WO 93/15187;化Iman和化yman，同上，所有均在此通過引用并入本文）。本領域中已 知的經修飾核酸堿基存在數個實例，如Limbach,等，Nucleic Acids Res.22:2183,1994所 概括的。可引入核酸分子中的堿基修飾的一些非限制性實例包括肌巧、嚷嶺、化晚-4-酬、化 晚-2-酬、苯基、假尿喀晚、2,4,6-=甲氧基苯、3-甲基尿喀晚、二氨尿巧、糞基、氨基苯基、5-烷基胞巧（例如，5-甲基胞巧）、5-烷基尿巧（例如，胸腺喀晚核糖核巧）、5-面代尿巧(例如， 5-漠尿巧）或者6-氮雜喀晚或6-烷基喀晚（例如6-甲基尿巧）、丙烘等（Burgin，等， Biochemistry 35:14090,1996 ;Uhlman和化yman，同上）。在運一方面，"經修飾的堿基"意指 1'位的除腺嚷嶺、鳥嚷嶺、胞喀晚和尿喀晚之外的核巧酸堿基或其等同物。
[0083] 本文中使用的互補性核巧酸堿基為彼此形成氨鍵的核巧酸堿基對。腺嚷嶺(A)與 胸腺喀晚(T)配對或者在RNA中與尿喀晚化)配對，并且鳥嚷嶺(G)與胞喀晚(C)配對。互補性 核酸區段或核酸鏈彼此雜交（通過氨鍵鍵合連接）。"互補性的"意指核酸可通過傳統的 Watson-化ick或者通過其他非傳統結合模式與另一核酸序列形成氨鍵。
[0084] 微RNA(miRNA)是長度為約21至23個核巧酸的單鏈RNA分子，其調芐基因表達。 miRNA由從DNA轉錄的基因編碼但不翻譯成蛋白質(非編碼RNA);作為替代，其從初級轉錄物 (稱為pri-miRNA)加工成短的莖環結構(稱為pre-miRNA)，并最終加工成功能性miRNA。成熟 的miRNA分子與一種或更多種信使RNA(mRNA)分子部分互補，并且其主要功能是下調基因表 達。
[0085] 本文中使用的術語小干擾RNA(small inte計ering RNA，siRNA)(有時稱為短干擾 RNA或沉默RNA)用于指在生物學中發揮多種作用之長度為16至40個核巧酸的一類雙鏈RNA 分子。最值得注意的是，S i RNA參與RNA干擾(RNAi)途徑，其中其干擾特定基因的表達。除其 在RNAi途徑中的作用之外，SiRNA還在RNAi相關的途徑中發揮作用，例如作為抗病毒機制或 者在成形基因組的染色質結構中發揮作用;運些途徑的復雜性僅目前才進行闡釋。
[0086] 本文中使用的術語RMi指細胞中由RM誘導的沉默復合物（RM-induced S i 1 enc ing comp lex，RI SC)控制并且由短雙鏈RNA分子啟動的RNA依賴性基因沉默過程，其 中所述雙鏈RNA分子與催化性RISC組分argonaute相互作用。當雙鏈RNA或RNA樣iNA或SiRNA 是外源性的（來自于具有RNA基因組之病毒的感染或者來自于經轉染的iNA或SiRNA)時，將 RNA或iNA直接導入細胞質中并通過酶dicer切割成短的片段。啟動性dsRNA還可W是內源性 的（來源于細胞），如由基因組中的RNA編碼基因表達的pre-微RNA。來自此類基因的初級轉 錄物首先在細胞核中加工而形成pre-miRNA的特征性莖環結構，然后輸出到細胞質W被 dicer切割。因此，兩個dsRNA途徑（內源性和外源性）均匯集于RISC復合物。RNA誘導的沉默 復合物的活性組分是稱為argonaute蛋白的核酸內切酶，其切割與其所結合的SiRNA或iNA 互補的祀mRNA鏈，由于通過dicer產生的片段是雙鏈的，因此其在理論上均可產生功能性 SiRNA或iNA。然而，兩條鏈中只有一條(稱為引導鏈(guide strand))與argonaute蛋白結合 并且指導基因沉默。另一條反引導鏈(anti-guide shand)或過客鏈（passenger strand) 在RISC活化期間降解。
[0087] 式（1)的化合物形成鹽，其也在本公開內容的范圍之內。除非另外指出，否則本文 中提及的式（1)化合物應理解為包括提及其鹽。本文中采用的術語"鹽"指代與無機酸和/或 有機酸形成的酸式鹽，W及與無機堿和/或有機堿形成的堿式鹽。另外，當式（1)的化合物同 時包含堿性部分(例如但不限于化晚或咪挫）和酸性部分(例如但不限于簇酸)時，可形成兩 性離子（"內鹽"）并且其包括在本文中使用的術語"鹽"之內。所述鹽可W是可藥用的（即，無 毒的、生理學上可接受的）鹽，但是其他鹽也是可用的。式（1)化合物的鹽可例如如下形成： 使式（1)的化合物與一定量(例如等價量)的酸或堿在介質例如其中鹽沉淀的介質中或者在 水性介質中反應，隨后凍干。
[0088] 示例性的酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲 酸鹽、苯橫酸鹽、硫酸氨鹽、棚酸鹽、下酸鹽、巧樣酸鹽、精腦酸鹽、精腦橫酸鹽、環戊燒丙酸 鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙橫酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油憐酸鹽、半硫酸 鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氨漠酸鹽、氨艦酸鹽、2-徑基乙橫酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲橫 酸鹽、2-糞橫酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、憐酸鹽、苦 味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、水揚酸鹽、班巧酸鹽、硫酸鹽、橫酸鹽(例如本文中提及的那些）、 酒石酸鹽、硫氯酸鹽、甲苯橫酸鹽(1〇1116]16311^〇]1日16)(也稱為甲苯橫酸鹽(1：035^1日16))、十 一酸鹽等。另外地，一般認為適于由堿性藥物化合物形成可藥用鹽的酸例如通過S.Berge 等，J.Pharmaceut i cal Sciences(1977)66(l)l-19;P.Gould,International J.Pharmaceutics(1986)33201-217；Anderson#,The Practice of Medicinal Chemistry ( 1996)，Academic Press，New York;并且在The Orange Book(Food&D;ru邑 Adminis化ation，Washington，D.C.見其網頁）中進行了討論。運些公開內容通過引用并入 本文。
[0089] 示例性的堿式鹽包括錠鹽;堿金屬鹽（例如鋼鹽、裡鹽和鐘鹽）；堿±金屬鹽（例如 巧鹽和儀鹽）；與有機堿(例如，有機胺)例如節星、二環己基胺、哈胺(hydrabamine)(用N，N-雙(脫氨松香基）乙二胺形成）、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖酷胺、叔下胺的鹽；W及與 氨基酸例如精氨酸、賴氨酸的鹽，等。堿性含氮基團可經例如W下試劑季錠化:低級烷基面 (例如，甲基、乙基、丙基和下基的氯化物、漠化物和艦化物）、硫酸二烷基醋(例如，硫酸二甲 醋、硫酸二乙脂、硫酸二下醋和硫酸二戊醋）、長鏈面化物(例如癸基、月桂基、肉豆違基和硬 脂酷基的氯化物、漠化物和艦化物）、芳基烷基面（例如，芐基和苯乙基的漠化物)等。
[0090] 出于本公開內容的目的，所有運樣的酸式鹽和堿式鹽旨在為在本公開內容的范圍 之內的可藥用鹽并且認為所有的酸式鹽和堿式鹽等同于對應化合物的游離形式。
[0091] 式（1)的化合物可W W非溶劑化形式和溶劑化形式(包括水化形式)存在。一般來 說，出于本公開內容的目的，與可藥用溶劑例如水、乙醇等的溶劑化形式等同于非溶劑化形 式。
[0092] 式（1)的化合物及其鹽、溶劑合物可W W其互變異構體形式(例如，作為酷胺或亞 氨基酸)存在。所有運樣的互變異構體形式均作為本公開內容的一部分而包括在本文中。
[0093] 本公開內容的化合物的多晶型物也在本公開內容的范圍之內（即，式1化合物的多 晶型物在本公開內容的范圍之內）。
[0094] 本公開內容的范圍內考慮本發明化合物(包括所述化合物的鹽、溶劑合物和前藥 W及所述前藥的鹽和溶劑合物中的那些）的所有立體異構體(例如，幾何異構體、光學異構 體等），例如可由于多種取代基上的不對稱碳而可存在的那些，包括對映體形式（其可甚至 在不存在不對稱碳下存在）、旋轉異構體形式、阻轉異構體(a化opisomer)和非對映體形式。 本公開內容化合物的個體立體異構體可例如基本不含其他異構體，或者可例如作為外消旋 物混合，或者與所有其他立體異構體或其他選定的立體異構體混合。本文中化合物的手性 中屯、可具有如IUPAC 1974Recommendations所限定的S或R構型。術語"鹽"、"溶劑合物"等的 使用旨在同等地適用于所公開化合物之對映體、立體異構體、旋轉異構體、互變異構體、外 消旋體或前藥的鹽和溶劑合物。
[0095] 可用作化學治療劑(抗腫瘤劑)的化合物類別包括:燒化劑、抗代謝物、天然產物及 其衍生物、激素和醬族化合物(包括合成類似物)和合成物。下文給出了屬于運些類別的化 合物的實例。
[0096] 陽離子脂質
[0097] 本說明書包括某些陽離子脂質化合物的合成。如在后續部分中所證明的，所述化 合物特別地適于將多核巧酸遞送至細胞和組織。本文中所述的脂大環類化合物 (Iipomacrocycle compound)還可用于其他目的W及例如賦形劑和添加劑。
[0098] 用于陽離子脂質化合物的合成方法可用本領域中的技術合成。本領域技術人員將 認識到產生運些化合物并且還產生本說明書其他化合物的其他方法。
[0099] 陽離子脂質化合物可與藥劑組合而形成微米顆粒、納米顆粒、脂質體或膠束。需通 過顆粒、脂質體或膠束遞送的藥劑可W是氣體、液體或固體形式，并且所述藥劑可W是多核 巧酸、蛋白質、膚或小分子。所述脂大環類化合物可與其他陽離子脂質化合物、聚合物(合成 或天然的）、表面活性劑、膽固醇、碳水化合物、蛋白質、脂質等組合而形成顆粒。然后，可將 運些顆粒任選地與藥用賦形劑組合W形成藥物組合物。
[0100] 本說明書提供了新的陽離子脂質化合物，W及基于使用此類陽離子脂質化合物的 藥物遞送系統。所述系統可在藥學/藥物遞送領域中用于向患者、組織、器官或細胞遞送多 核巧酸、蛋白質、小分子、膚、抗原、藥物等。運些新化合物還可用作用于包衣、添加劑、賦形 劑、材料或生物工程的材料。
[0101] 本說明書的陽離子脂質化合物提供了在藥物遞送領域中的數種不同用途。所述陽 離子脂質化合物的含胺部分可用于與多核巧酸形成復合物，從而增強多核巧酸的遞送并防 止其降解。所述陽離子脂質化合物還可用于形成含有待遞送藥劑的皮米顆粒、納米顆粒、微 米顆粒、脂質體和膠束。優選地，所述陽離子脂質化合物是生物相容且生物可降解的，形成 的顆粒也是生物可降解且生物相容的并且可用于提供待遞送藥劑的受控、持續釋放。鑒于 運些化合物及其相應顆粒在較低的pH下質子化，其還可對pH改變作出響應。其還可在向細 胞遞送藥劑中充當質子海綿W引起內體裂解。
[0102] 在某些實施方案中，所述陽離子脂質化合物相對而言沒有細胞毒性。所述陽離子 脂質化合物可W是生物相容且生物可降解的。陽離子脂質的地a可W是約5.5至約7.5,更優 選地約6.0至約7.0。可設計成具有約3.0至約9.0或者約5.0至約8.0的期望地3。本文中所述 的陽離子脂質化合物出于W下幾個原因而對藥物遞送特別具有吸引力:其含有與DNA、RNA、 其他多核巧酸及其他帶負電荷藥劑相互作用的氨基而用于緩沖抑、用于引起內體裂解、用 于保護待遞送的藥劑;其可由商購可得的起始材料合成;和/或其是抑響應性的并且可工程 化成具有期望的地3。
[0103] 含有陽離子脂質化合物的組合物可W是30%至70%陽離子脂質化合物、0%至 60%膽固醇、0 %至30%憐脂和1 %至10 %聚乙二醇（PEG)。優選地，所述組合物為30%至 40%陽離子脂質化合物、40%至50%膽固醇和10%至20%陽G。在另一些優選實施方案中， 所述組合物為50 %至75 %陽離子脂質化合物、20 %至40 %膽固醇和5 %至10 %憐脂W及1 % 至10 %PEG。所述組合物可包含60 %至70 %陽離子脂質化合物、25 %至35 %膽固醇和5 %至 10%PEG。所述組合物可包含多至90%陽離子脂質化合物和2%至15%輔助性脂質化elper lipid)O
[0104] 制劑可W是例如包含W下的脂質顆粒制劑:8%至30%化合物、5%至30%輔助性 脂質和0%至20%膽固醇；4%至25%陽離子脂質、4%至25%輔助性脂質、2%至25%膽固 醇、10%至35%膽固醇-PEG和5 %膽固醇-胺;或者2%至30%陽離子脂質、2%至30%輔助性 脂質、1 %至15%膽固醇、2%至35%膽固醇-PEG和1 %至20%膽固醇-胺;或者多至90%陽離 子脂質和2%至10%輔助性脂質，或者甚至100%陽離子脂質。
[0105] 用于施用的組合物和制劑
[0106] 本公開內容的核酸-脂質組合物可通過多種途徑來施用，例如通過靜脈內、腸胃 夕F、腹膜內或表面(topical)途徑來實現全身性遞送。在一些實施方案中，SiRNA可細胞內遞 送到例如祀組織(例如肺或肝）的細胞中或發炎組織中。在一些實施方案中，本公開內容提 供了用于體內遞送SiRNA的方法。可將核酸-脂質組合物靜脈內、皮下或腹膜內施用于對象。 在一些實施方案中，本公開內容提供了用于將干擾RNA體內遞送至哺乳動物對象的肺的方 法。
[0107] 在一些實施方案中，本公開內容提供了在哺乳動物對象中治療疾病或病癥的方 法。可向患有與可通過所述組合物而降低、減小、下調或沉默的基因表達或過表達相關的疾 病或病癥的對象施用治療有效量的本公開內容的組合物，所述組合物包含核酸、陽離子脂 質、兩親物、憐脂、膽固醇和PEG連接的膽固醇。
[0108] 本公開內容的組合物和方法可通過多種黏膜施用方式來施用于對象，包括通過經 口、經直腸、經陰道、鼻內、肺內或者經皮或經皮膚遞送，或者通過表面遞送至眼、耳、皮膚或 其他黏膜表面。在本公開內容的一些方面，黏膜組織層包括上皮細胞層。上皮細胞可W是肺 的、氣管的、支氣管的、肺泡的、鼻的、頰的、表皮的或胃腸的。本公開內容的組合物可使用常 規致動器例如機械噴霧裝置，W及加壓、電激活或其他類型的致動器來施用。
[0109] 本公開內容的組合物可作為經鼻或經肺噴霧劑W水溶液施用，并且可通過本領域 技術人員已知的多種方法W噴霧劑形式分配。經肺遞送本公開內容的組合物通過將組合物 W滴劑、顆粒劑或噴霧劑的形式施用來實現，所述形式可W是例如氣溶膠化的 (aerosolized)、霧化的（atomized)或成霧狀的（nebulized)。組合物、噴霧劑或氣霧劑的顆 粒可W是液體或固體形式。用于作為經鼻噴霧劑來分配液體的優選系統公開于美國專利 No. 4，511，069中。運樣的制劑可如下常規制備:將根據本公開內容的組合物溶解于水中W 產生水溶液，并使得所述溶液無菌。所述制劑可在多劑量容器中，例如在美國專利No . 4， 511，069中公開的密封分配系統中提供。另一些合適的經鼻噴霧劑遞送系統已在 Transdermal Systemic Medication，Y.W.Chien編車茸，Elsevier Publishers,New York, 1985;和美國專利No. 4,778,810中進行了描述。另外的氣霧劑遞送形式可包括例如壓縮空 氣噴霧器、噴氣式噴霧器、超聲噴霧器和壓電噴霧器，其遞送溶解或混懸于藥用溶劑(例如 水、乙醇或其混合物）中的生物活性劑。
[0110] 本公開內容的經鼻和經肺噴霧劑溶液通常包含任選地與表面活性劑(例如非離子 表面活性劑(例如聚山梨醇醋-80))和一種或更多種緩沖劑一起配制的藥物或待遞送藥物。 在本公開內容的一些實施方案中，經鼻噴霧劑溶液還包含拋射劑。經鼻噴霧劑溶液的pH可 W是約pH 6.8至pH 7.2。所采用的藥用溶劑還可W是pH 4至pH 6的微酸性水性緩沖液。可 添加其他組分W增強或維持化學穩定性，包括防腐劑、表面活性劑、分散劑或氣體。
[0111] 在一些實施方案中，本公開內容是藥物產品，其包括含有本公開內容的組合物的 溶液和用于經肺、經黏膜或鼻內噴霧劑或氣霧劑的致動器。
[0112] 本公開內容的組合物的劑型可W是液體，滴劑或乳劑形式或者氣霧劑形式。
[0113] 本公開內容的組合物的劑型可W是固體，其可在施用之前在液體中重構。所述固 體可作為粉末施用。所述固體可W是膠囊劑、片劑或凝膠劑的形式。
[0114] 為了配制本公開內容中的用于經肺遞送的組合物，可將生物活性劑與多種可藥用 添加劑W及用于分散活性劑的基質(base)或載體組合。添加劑的實例包括抑控制劑，例如 精氨酸、氨氧化鋼、甘氨酸、鹽酸、巧樣酸及其混合物。另一些添加劑包括局部麻醉劑(例如， 苯甲醇）、等滲劑(例如，氯化鋼、甘露醇、山梨醇）、吸附抑制劑(例如，Tween 80)、溶解度增 強劑(例如，環糊精及其衍生物）、穩定劑(例如，血清白蛋白）和還原劑(例如，谷脫甘膚）。當 用于經黏膜遞送的組合物為液體時，如參照作為統一之0.9 % (w/v)生理鹽水溶液的滲透性 (tonicity)所測量的，通常將制劑的滲透性調整至在施用部位的黏膜內將不誘導顯著的不 可逆轉組織損傷的值。一般來說，將溶液的滲透性調整至約1/3至3、更一般地1/2至2、并且 最經常3/4至1.7的值。
[0115] 生物活性劑可分散在基質或載劑中，所述基質或載劑可包含能夠分散活性劑和任 何期望的添加劑的親水性化合物。所述基質可選自很多種合適的載體，包括但不限于:多聚 簇酸或其鹽、簇酸酢（例如，馬來酸酢）與其他單體(例如，（甲基)丙締酸甲醋、丙締酸等）的 共聚物;親水性乙締基聚合物，例如聚乙酸乙締醋、聚乙締醇、聚乙締化咯燒酬;纖維素衍生 物，例如徑甲基纖維素、徑丙基纖維素等；W及天然聚合物，例如殼聚糖、膠原、藻酸鋼、明 膠、透明質酸，及其無毒金屬鹽。通常來說，選擇生物可降解的聚合物作為基質或載體，例如 聚乳酸、聚（乳酸-乙醇酸)共聚物、聚徑基下酸、聚(徑基下酸-乙醇酸)共聚物及其混合物。 作為替代地或補充，可采用合成的脂肪酸醋例如聚甘油脂肪酸醋、薦糖脂肪酸醋等作為載 體。親水性聚合物及其他載體可單獨或組合使用，并且可通過部分結晶、離子鍵鍵合、交聯 等來賦予載體增強的結構完整性。載體可W W多種形式提供，包括用于直接施用于鼻黏膜 的流體或黏性溶液、凝膠、糊劑、粉末、微球體和膜。所選載劑在運一情況下的使用可導致促 進生物活性劑的吸收。
[0116] 用于經黏膜、經鼻或經肺遞送的制劑可包含親水性低分子量化合物作為基質或賦 形劑。此類親水性低分子量化合物提供運樣的通道介質，通過其水溶性活性劑(例如生理活 性膚或蛋白質)可通過基質擴散至體表，在此活性劑被吸收。所述親水性低分子量化合物任 選地從黏膜或施用氣氛吸收水分并使水溶性活性膚溶解。所述親水性低分子量化合物的分 子量一般不超過10,000,并且優選地不超過3000。親水性低分子量化合物的實例包括多元 醇化合物，例如寡糖、二糖和單糖，包括薦糖、甘露醇、乳糖、阿拉伯糖、D-赤薛糖、D-核糖、 D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纖維二糖、龍膽二糖(gentibiose)、甘油、聚乙二醇及 其混合物。親水性低分子量化合物的其他實例包括N-甲基化咯燒酬、醇類(例如，寡聚乙締 醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等），及其混合物。
[0117] 本公開內容的組合物可作為替代地根據大致生理條件的需求包含例如W下作為 可藥用載體物質：pH調節劑和緩沖劑、滲透性調節劑和濕潤劑，例如乙酸鋼、乳酸鋼、氯化 鋼、氯化鐘、氯化巧、脫水山梨醇單月桂酸醋、=乙醇胺油酸醋及其混合物。對于固體組合 物，可使用常規的無毒可藥用載體，其包括例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸儀、糖 精鋼、滑石、纖維素、葡萄糖、薦糖、碳酸儀等。
[0118] 在本公開內容的某些實施方案中，生物活性劑可W W時間釋放制劑施用，例如W 包含緩慢釋放聚合物的組合物施用。活性劑可與將保護免于迅速釋放的載體(例如受控釋 放載劑，例如聚合物、經微包封遞送系統或生物黏附性凝膠)一起制備。活性劑在本公開內 容之多種組合物中的延長遞送可通過在組合物中包含延遲吸收的物質（例如單硬脂酸侶水 凝膠和明膠)來實現。
[0119] 盡管已針對某些實施方案對本公開內容進行了描述并且出于舉例說明的目的已 提供了很多細節，但是對本領域技術人員而言將明顯的是，本公開內容包括另外的實施方 案并且本文中所述的一些細節可顯著改變而不偏離本公開內容。本公開內容包括運樣的另 外實施方案、改變方案和等同方案。特別地，本公開內容包括多種說明性組分和實例的特 征、項(term)或要素的任意組合。
[0120] 實施例
[0121] 實施例1.
[0122] 式(1)的示例性化合物在表1中提供。
[0123] 表1
[0126]
[0127]表1示出了每種化合物的名稱和結構、其分子量、其地aW及其在下文實施例19中 所述的測定中的敲減生物活性化nockdown bioactivity，KD)。
[012引 生施仿||2胃S-迫革酸巧鵬的會冊
[0129]
[01301
[0131] 在N2氣氛下，將8-漠辛酸溶解于無水甲醇中。逐滴添加濃也S〇4并將反應混合物在 回流下攬拌3小時。
[0132] 通過薄層色譜監測反應直至完成。在真空下完全除去溶劑。將反應混合物用乙酸 乙醋稀釋并用水洗涂。用乙酸乙醋再萃取水層。用化肥化飽和溶液洗涂總有機層。將有機層 再用水洗涂并最后用鹽水洗涂。經無水Na2S〇4干燥產物并濃縮。
[0133] 連施例3. 8,8'-(韋某氣糕二某）二宰酸二甲鵬的合成
[0136] 取無水K2CO3并在化下將其添加至無水二甲基甲酯胺。緩慢地添加在二甲基甲酯胺 中的節胺。然后，在室溫下添加溶解于二甲基甲酯胺中的8-漠辛酸甲醋。將反應混合物加熱 至8(TC并在攬拌下維持反應36小時。
[0137] 通過薄層色譜監測反應直至完成。將反應產物冷卻至室溫并添加水。用乙酸乙醋 萃取化合物。用乙酸乙醋再萃取水層。將總有機層用水洗涂并最后用鹽水溶液洗涂。經無水 NasSCk干燥產物并濃縮。
[0138] 通過硅膠柱色譜在氯仿中的3 %甲醇中純化反應產物。回收到44gm純產物。
[0139] 使用氯仿中的10%甲醇的TLC系統，該產物WRf :0.8遷移，通過在巧S酬中炭化而 可視化。總產率為82%。該化合物為淺褐色的液體。結構通過Ih-NMR來確定。
[0140] 實施例4. 8，8氮焼二基二辛酸二甲醋的合成
[0141：
[0142]
[0143] ~將8,8'-(芐基氮燒二基）二辛酸二甲醋轉移至氨化用玻璃容器并添加乙醇，之后' 添加10%Pd/C。將反應混合物在室溫下在50psi出大氣壓下于帕爾搖床設備(Parr-shaker appara1:us)中搖動2小時。
[0144] 通過娃藻±(celite)過濾反應產物并用熱乙酸乙醋洗涂。在真空下濃縮濾液。
[0145] 實施例5. 8,8'-((叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二甲醋的合成
[0148] 將8,8'-氮燒二基二辛酸二甲醋轉移至DCM和EtsN到反應物料中并冷卻至(TC。向 上述反應逐滴添加在DCM中稀釋的Boc酸酢。在完成添加之后，將反應混合物在室溫下攬拌3 小時。
[0149] 用水澤滅反應并分離DCM層。用DCM再萃取水相，將合并的DCM層用鹽水溶液洗涂并 用Na2S〇4干燥。在濃縮之后，收集到40gm的粗制化合物。
[0150] 通過柱色譜使用在己燒中的0%至12%乙酸乙醋純化粗制反應產物。回收到的產 率為48%。單一產物通過薄層色譜在己燒中的20%乙酸乙醋中Wo. 5的Rf遷移，用巧S酬炭 化。
[0151] 違脯例R. 8,8'-((叔T氧,其餓其）氣糕^其宰酸的合成 [015
[01531
[0154] 將8,8'-((叔下氧基幾基）氮燒二基）二辛酸二甲醋轉移至THF。在室溫下，添加6N 氨氧化鋼溶液。將反應在室溫下于攬拌下維持過夜。
[0155] 在25°C下于真空下蒸發反應物料W除去THF。用5N HCl酸化反應產物。向水層添加 乙酸乙醋。用水洗涂分離的有機層并用乙酸乙醋再萃取水層。將合并的有機層用鹽水溶液 洗涂并經無水Na2S〇4干燥。濃縮溶液得到ISgm的粗制物料。
[0156] 實施例7. 8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基)醋的合 成 「01571
123 將8，8'-((叔下氧基幾基）氮燒二基）二辛酸溶解于無水DCM中。向該溶液添加 HATU。在室溫下，向反應混合物緩慢地添加二-異丙基乙基胺。使內部溫度升高至40°C并且 形成淺黃色溶液。向反應混合物添加 DMAP，之后添加無水DCM中的順式-2-壬締-1-醇溶液。 反應變成褐色。將反應在室溫下攬拌5小時。 2 在完成之后，通過薄層色譜檢查反應。向反應產物添加水，并用DCM萃取。將DCM層 用水洗涂，之后用鹽水溶液洗涂。將有機層經無水化2S化干燥并濃縮得到35gm的粗制化合 物。 3 實施例8. ATX-OOl的合成 「01621
[0163] 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-I-基）醋(0.023mol， 15g)溶解于無水二氯甲燒(DCM) (200ml)中。在(TC下添加立氣乙酸(TFA似起始反應。在攬 拌下，經30分鐘使反應溫度緩慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下 濃縮反應產物，將粗制殘余物用DCM稀釋并用10 %化肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，并將 合并的有機層用鹽水溶液洗涂，經化2S化干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗制產物（12克） 溶解于無水DCM(85ml)中。添加 S光氣并將反應混合物冷卻至(TC,并且逐滴添加化3N。將反 應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。在化下通過蒸饋從反應物料中除去 DCM溶劑。將反應產物冷卻至(TC，用DCM( 50ml) W及2-((2-(二甲基氨基）乙基）硫基）乙酸 (0.039mol，6.4g)和碳二亞胺化DC ?肥1) (0.054mol，10.4g)稀釋。然后，將反應混合物在室 溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。用0.3M肥1溶液(75ml)稀釋反應產物并分離有機 層。用DCM再萃取水層，并將合并的有機層用10 %K2C03水溶液(75ml)洗涂并經無水化2S〇4干 燥。濃縮溶劑得到10克的粗制物料。通過硅膠柱（100至200目）使用3 %MeOH/DCM純化粗制化 合物。產量為l〇.5g(68%)。
[0164] 實施例9.ATX-002的合成
[01 化]
[0166] 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基)醋（13.85mmol， 9克)溶解于無水DCM(ISOml)中。在0°C下添力日TFAW起始反應。在攬拌下，經30分鐘使反應溫 度緩慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下濃縮反應產物，將粗制殘 余物用DCM稀釋并用10 %化肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，將合并的有機層用鹽水溶液 洗涂，經化2S〇4干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗制產物溶解于無水DCM(85ml)中。添加 S 光氣并將反應混合物冷卻至(TC,并且逐滴添加化3N。將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄 層色譜顯示反應完成。在化下通過蒸饋從反應物料中除去DCM溶劑。將反應產物冷卻至(TC, 用DCM(SOml)稀釋，并添加2-(二甲基氨基）乙燒硫醇HCl(0.063mol，8.3g)，之后添加 Et3N (無水）。然后，將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。用0.3M HCl溶液 (75ml)稀釋反應產物并分離有機層。用DCM再萃取水層，并將合并的有機層用10%拉〇)3水溶 液(75ml)洗涂并經無水化2S〇4干燥。濃縮溶劑得到10克的粗制物料。通過硅膠柱（100至200 目）使用3%Me0H/DCM純化粗制化合物。產量為3. Ig。
[0167] 實施例10.ATX-003的合成 「01AR1
[0169] 將8，8'（（叔下氧基幾基）氮燒二基）二辛酸二（（Z)-壬-2-締-I-基）醋 (0.00337mo 1，2.2g)溶解于無水DCM( 20ml)中。在(TC下添加 TFA W起始反應。在攬拌下，經30 分鐘使反應溫度緩慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下濃縮反應 產物，將粗制殘余物用DCM稀釋并用10 %NaHO)3溶液洗涂。用DCM再萃取水層，將合并的有機 層用鹽水溶液洗涂，經化2S04干燥并在減壓下濃縮。在氮氣下，將收集的粗制產物溶解于無 水DCM( IOml)中。添加 S光氣(0.0182mol，5.4g)并將反應混合物冷卻至(TC，并且逐滴添加 Et3N。將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。在化下通過蒸饋從反應物 料中除去DCM溶劑。將反應產物冷卻至(TC,用DCM(ISml)稀釋，并添力日2-(二甲基氨基）丙烷 硫醇?肥1 (0.0182mol，2.82g)，之后添加化3N(無水）。然后，將反應混合物在室溫下攬拌過 夜。薄層色譜顯示反應完成。用0.3M HCl水溶液(20ml)稀釋反應產物并分離有機層。用DCM 再萃取水層，將合并的有機層用10%K2C03水溶液(50ml)洗涂并經無水化2S〇4干燥。濃縮溶 劑得到5克的粗制物料。通過硅膠柱（100至200目）使用3%Me0H/DCM純化粗制化合物。產量 為0.9克。
[0170] 實施例11.ATX-004的合成 [01711
12 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基）醋(0.023mol， 15g)溶解于DCM(200ml)中。在(TC下添加 TFAW起始反應。在攬拌下，經30分鐘使反應溫度緩 慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下濃縮反應產物，將粗制殘余物 用DCM稀釋并用10 % Na肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，將合并的有機層用鹽水溶液洗涂， 經NasS化干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗制產物8，8 氮燒二基二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基)醋(5.853mmol ,3.2g)溶解于無水二甲基甲酯胺(DMF)中，并添加2-((3-(二甲基氨基） 丙基)硫基）乙酸（10.48mmol，1.85g)和邸C ?肥1 (14.56mmol，2.78g)。將反應混合物在室溫 下攬拌過夜。將反應用水(30ml)澤滅并用DCM( 30ml)稀釋，分離有機層。用DCM再萃取水層， 將合并的有機層用10%K2C03水溶液洗涂并經無水化2S化干燥。通過硅膠柱（100至200目）使 用3%Me0H/DCM純化粗制化合物。產量為lg(24.2% )。 2 實施例12.ATX-005的合成
[0174]
[0175] 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-I-基）醋(0.023mol， 15g)溶解于無水DCM( 200ml)中。在(TC下添加 TFA W起始反應。在攬拌下，經30分鐘使反應溫 度緩慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下濃縮反應產物，將粗制殘 余物用DCM稀釋并用10 %化肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，將合并的有機層用鹽水溶液 洗涂，經NasS化干燥并濃縮。在氮氣下，將粗制反應產物8,8'-氮燒二基二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基）醋（5.853mmol，3.2g)溶解于DMF中。2-((3-(二甲基氨基）丙基）硫基）乙酸 (10.48mmol，1.85g)和抓C ? HCl (14.56mmol，2.78g)并將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄 層色譜顯不反應元成。將反應廣物用水(30ml W竿滅并用DCM (30ml)稀釋。用DCM再卒取水層， 將合并的有機層用10 % K2CO3水溶液(75ml)洗涂并經無水化2S化干燥。濃縮溶劑得到5克的 粗制物料。通過硅膠柱（10 0至2 0 0目）使用3 % M e 0 H / D C M純化粗制化合物。產量為1 g (24.2%)。
[0176] 實施例13.ATX-006的合成
[0177]
[0178] 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基)醋溶解于無水 DCM(ISOml)中。在(TC下添加 TFAW起始反應。在攬拌下，經30分鐘使反應溫度緩慢地溫熱至 室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下濃縮反應產物，將粗制殘余物用DCM稀釋 并用10 %化肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，并將合并的有機層用鹽水溶液洗涂，經化2S化 干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗制產物溶解于無水DCM(85ml)中。添加 S光氣并將反應 混合物冷卻至(TC,并且逐滴添加 Et3N。將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反 應完成。在氮氣氛下，將粗制反應產物溶解于無水DMF中并添加2-((2-(二乙基氨基）乙基） 硫基）乙酸(3.93mmol，751mg)和抓C ?肥1(5.45臟〇1，1.0旨）。將反應混合物在室溫下攬拌過 夜。用水（3ml)澤滅反應并在25°C下于真空下除去過量的DMF。用水稀釋反應產物并用DCM (20ml)萃取水層S次。將合并的有機層用鹽水溶液洗涂并經無水化2S〇4干燥。濃縮溶劑得到 2克的粗制物料。在通過硅膠柱（100至200目）使用3%Me0H/DCM純化之后，產量為1.2g (76%)。
[0179] 實施例14.ATX-009的合成 「01801
[0181] 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-I-基)醋（13.85mmol， 9克）溶解于無水DCM(20ml)中。在(TC下添加 TFAW起始反應。在攬拌下，經30分鐘使反應溫 度緩慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在4(TC下于真空下濃縮反應產物，并將粗制 殘余物用DCM稀釋并用10%化肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，并將合并的有機層用鹽水 溶液洗涂，經化2S04干燥并濃縮。在氮氣氛下，將8,8'-氮燒二基二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基）醋（0.909mmol，500mg)溶解于無水DCM(20ml)中。添加 S光氣并將反應混合物冷卻至0 °C，并且逐滴添加化3N。將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。在氮氣 氛下，通過蒸饋從反應物料中除去DCM溶劑。將2-(乙基（甲基）氨基）乙燒-1-硫醇鹽酸鹽 (4.575111111〇1，715111邑)溶解于01。(71111)和四氨巧喃(1'冊）（51111)中，并在0°(：下逐滴添加至1'冊 中的氨化鋼混懸液。然后，將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。用乙 酸乙醋和冷水稀釋反應產物。用5%HCl(9ml)中和反應，并分離有機層。將水層用乙酸乙醋 化t0Ac)(20ml)再萃取，在冷水和鹽水中洗涂，并將合并的有機層洗涂，經無水化2S〇4干燥。 濃縮溶劑得到1克的粗制產物。通過硅膠柱（100至200目）使用3%Me0H/DCM純化化合物得到 IOOmgo
[0182] 實施例15.ATX-OlO的合成
[0183]
12 將8,8'（（叔下氧基幾基)氮燒二基)二辛酸二（（Z)-壬-2-締-1-基)醋(3.079mmol， 2g)溶解于無水DCM(20ml)中。在(TC下添加 TFAW起始反應。在攬拌下，經30分鐘使反應溫度 緩慢地溫熱至室溫。薄層色譜顯示反應完成。在40°C下于真空下濃縮反應產物，并將粗制殘 余物用DCM稀釋并用10 %化肥化溶液洗涂。用DCM再萃取水層，并將合并的有機層用鹽水溶 液洗涂，經化2S化干燥并濃縮。在氮氣下，將收集的粗制產物溶解于無水DCM( 20ml)中。添加 S光氣（14.55mmol，4.32g)并將反應混合物冷卻至(TC，并且逐滴添加化3N。將反應混合物 在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完成。在化下，通過蒸饋從反應物料中除去DCM溶劑。 將反應產物冷卻至(TC，用DCM(20ml)稀釋并添加2-(二甲基氨基）乙燒硫醇HCl (0.063mol， 8.3g)，之后添加化3N(無水）。然后，將反應混合物在室溫下攬拌過夜。薄層色譜顯示反應完 成。用0.3M HCl溶液(20ml)稀釋反應產物，并分離有機層。用DCM再萃取水層，將合并的有機 層用10 %K2C03水溶液(20ml)洗涂并經無水化2S(k干燥。濃縮溶劑得到10克的粗制物料。通 過硅膠柱（100至200目）使用3%Me0H/DCM純化粗制化合物。產量為1.4g(75% )。 2 實施例 16.41乂-011至41乂-030和41乂-32的合成
[0186] ATX-Oll至ATX-030的合成遵循實施例1至15的合成，通過用適當的起始成分替換 用于其中所述的合成反應。
[0187] 實施例17.ATX-031的合成 [018 引
[0189 ]實施例19.體內小鼠因子Vn沉默
[0190]使用脂質體文庫的肝定向體內篩選，測試有利于肝細胞(所述細胞包含肝實質的 細胞）中的高水平SiRNA介導的基因沉默的一系列化合物。因子VII(-種凝血因子)是用于 測定向肝的功能性SiRNA遞送的合適祀基因。與向網狀內皮系統之細胞（例如，枯否細胞 化UPffer cell))的遞送相對，由于該因子特異性地在肝細胞中產生，因此基因沉默指示成 功遞送至實質。另外，因子VII是可在血清中容易地測量的分泌蛋白，避免了對動物實施安 樂死的需要。mRNA水平的沉默可通過測量蛋白質的水平來容易地確定。運是由于蛋白質的 短半衰期（2至5小時）。W〇.006ml/g的體積經尾靜脈注射使C57BL/6小鼠（化arles River Labs)接受鹽水或在脂質體制劑中的siRNA。在施用后48小時時，通過異氣燒(isofiuorane) 吸入麻醉動物，并通過眶后出血將血液收集到血清分離管中。使用生色測定（Biophen FVII ,Aniara Co巧oration)根據生產商的方案在樣品中確定因子VII蛋白的血清水平。使 用從經鹽水處理的動物收集的血清產生標準曲線。
[0191] 具有針對因子 VIII 之 SiRNA 的組合物用 ATX-001、ATX-002、ATX-003 和 ATX-547W 及 比較物樣品NC巧日MCS(Alnylam)配制而成。將運些Wo.3mg/kg和Img/kg注射到動物中。在將 SiRNA制劑施用于C57BL6小鼠之后，測量經MC3(0.3mg/kg)、NC1 (0.3mg/kg)、ATX-547 (0.3mg/kg)、ATX-OOI (0.3和I.Omg/kg)、ATX-002(0.巧PI.Omg/kg)和ATX-003(0.巧PI.Omg/ kg)包封之SiRNA在小鼠血漿中敲減因子Vn的能力。結果顯示，與對照相比，ATX-OOI和ATX-002在0.3mg/kg下最有效（圖1和2)。
[0192] 在將SiRNA制劑施用于C57BL6小鼠之后，測量經MC3(0.3和1.5mg/kg)、NC1 (0.3mg/ kg)、ATX-547(0.1和0.3mg/kg)、ATX-004(0.3)、ATX-006(0.3和I.Omg/kg)、ATX-010(0.3mg/ kg)和ATX-OOI(0.3和1.5mg/kg)包封之SiRNA在小鼠血漿中的因子VII敲減。結果顯示，ATX-00巧PATX-OlO最有效（圖3和4)。示出了示例性化合物ATX-018、ATX-019和ATX-020在0.3mg/ kg或0.05mg/kg下的敲減活性(表1)。
【主權項】
1. 式I的化合物或其可藥用鹽：其中 RjPR2相同或不同，各自是具有1至9個碳的直鏈或支鏈烷基，或者具有2至11個碳原子 的烯基或炔基， LjPL2相同或不同，各自是具有5至18個碳原子的直鏈烷基，或者與N形成雜環， Χι是鍵，或者是-CCH)-，由此形成L2-COH2， Χ2是S或0， L3是鍵或低級烷基，或者與N形成雜環， R3是低級烷基，并且 R4PR5相同或不同，各自是低級烷基。2. 權利要求1所述的化合物，其中L3不存在。3. 權利要求1所述的化合物，其中L3是亞甲基。4. 權利要求1所述的化合物，其中X2是S。5. 權利要求1所述的化合物，其中R3是亞乙基。6. 權利要求1所述的化合物，其中R3是亞正丙基或亞異丁基。7. 權利要求1所述的化合物，其中R4PR5獨立地是甲基、乙基或異丙基。8. 權利要求1所述的化合物，其中Li和L2相同。9. 權利要求1所述的化合物，其中Li和L2不同。10. 權利要求1所述的化合物，其中L^L2由具有7個碳原子的直鏈烷基組成。11. 權利要求1所述的化合物，其中L^L2由具有9個碳原子的直鏈烷基組成。12. 權利要求1所述的化合物，其中Ri和R2相同。13. 權利要求1所述的化合物，其中RjPR2不同。14. 權利要求12所述的化合物，其中辦和辦由亞烷基組成。15. 權利要求12所述的化合物，其中RjPR2由烷基組成。16. 權利要求14所述的化合物，其中所述亞烷基由單個雙鍵組成。17. 權利要求12所述的化合物，其中辦或1?2由9個碳原子組成。18. 權利要求12所述的化合物，其中辦或1?2由11個碳原子組成。19. 權利要求12所述的化合物，其中辦或辦由7個碳原子組成。20. 權利要求1所述的化合物，其中L3是亞甲基，R3是亞乙基，X2是S，并且R4和R5各自是甲 基。21. 權利要求1所述的化合物，其中L3是鍵，R3是亞乙基，X2是S，并且R4PR 5各自是甲基。22. 權利要求1所述的化合物，其中L3是鍵，R3是亞正丙基，X2是S，并且R4和R5各自是甲 基。23. 權利要求1所述的化合物，其中L3是鍵，R3是亞乙基，X2是S，并且R4PR 5各自是乙基。24. 權利要求1所述的化合物，其選自式ATX-001至ATX-028、ATX-031和ATX-032的化合 物：ο25. 式I的化合物或其可藥用鹽： 其中RjPR2相同或不同，各自是具有1至11個碳的直鏈或支鏈烷基，或者具有2至13個碳原子 的烯基或炔基， LjPL2相同或不同，各自是具有3或4個碳原子的直鏈烷基， Χι是鍵，或者是-CCH)-，由此形成L2-COH2， Χ2是S或0， L3是鍵或低級烷基，或者與N形成雜環， R3是低級烷基，并且 R4PR5相同或不同，各自是低級烷基。26. 權利要求25所述的化合物，其由式ATX-0029或0030的化合物組成：
【文檔編號】C07C333/04GK105873902SQ201480063077
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月18日
【發明人】約瑟夫·E·佩恩, 帕德馬納巴·希武庫拉
【申請人】阿克丘勒斯治療公司