br>[0029] 保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；
[0030] 保藏日期：2014年8月22日；
[0031] 保藏編號：CGMCC No. 9574。
【附圖說明】
[0032] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0033] 圖1示實施例3Ki67單克隆抗體UMAB107的Western blot檢測結果；其中泳道 HT-29為以人結腸癌細胞HT-29細胞系裂解物為抗原的檢測結果、泳道NCI-H322M為以細支 氣管肺泡腺癌NCI-H322M細胞系裂解物為抗原的檢測結果、泳道M0LT4為以人急性淋巴細 胞白血病Mo 114細胞系裂解物為抗原的檢測結果、泳道MDA-MB231為以人乳腺癌MDA-MB231 細胞系裂解物為抗原的檢測結果；
[0034] 圖2示實施例4乳腺癌組織免疫組化結果圖（一抗為Ki67單克隆抗體UMAB107);
[0035] 圖3示實施例4人扁桃體組織免疫組化結果圖（一抗為Ki67單克隆抗體 UMAB107)；
[0036] 圖4示實施例4人結腸組織免疫組化結果圖（一抗為Ki67單克隆抗體UMAB107);
[0037] 圖5示實施例4鼠結腸組織免疫組化結果圖（一抗為Ki67單克隆抗體UMAB107);
[0038] 圖6示實施例6分別采用UMAB107和MIB1作為一抗檢測人源扁桃體、乳腺癌和直 腸組織中Ki-67的表達的免疫組化結果圖，其中a、d為人源扁桃體的結果圖，b、e為人源扁 桃體的結果圖，c、f為人源扁桃體的結果圖；a、b、c為一抗為UMAB107的結果圖（1:1000)， d、e、f為一抗為MIB1的結果圖（1:1000);
[0039] 圖7示實施例6用UMAB107和MIB1作為一抗檢測鼠源直腸組織中Ki-67的表達 的免疫組化結果圖，其中3為一抗為1]獻8107的結果圖（1:500)，13為一抗為[81的結果圖 (1:500)0
【具體實施方式】
[0040] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0041] 實施例1、Ki67免疫原的制備
[0042] 一、Ki67重組表達質粒的構建
[0043] 選擇Ki67的第1160-1493位氨基酸共334個氨基酸（核苷酸序列：SEQ ID N0:1， 氨基酸序列：SEQ ID N0:2)作為免疫原來生產抗體。通過基因合成的方式合成相應的序 列，并引入酶切位點Sgfl、Mlul，通過Sgfl和Mlul兩個酶切位點將目的序列連接到載體 pET23a-N-His上，構建Ki67重組表達質粒。
[0044] 二、Ki67重組蛋白的表達與純化
[0045] 將Ki67重組表達質粒轉化大腸桿菌Rosetta PlysS，表達純化獲得相應的重組蛋 白。
[0046] 實施例2、Ki67單克隆抗體的制備與篩選
[0047] 根據標準方法用大腸桿菌重組產生的純化的Ki67第1160-1493位氨基酸的334 個氨基酸的蛋白片段用于對B6/C57小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）進行免 疫。具體方法如下：
[0048] 1、動物免疫：經過純化的Ki67第1160-1493位氨基酸共334個氨基酸的蛋白片 段作為抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡B6/C57小鼠， 免疫劑量為50 μ g/只，間隔兩周后進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為 50 μ g/只。免疫兩次后取尾血以ELISA法梯度稀釋測定血清效價；根據結果確定是否加強 免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。
[0049] 2、細胞融合：骨髓瘤細胞采用B6/C57來源的SP2/0,融合時處于對數生長期；取 已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細胞單細胞懸液；小鼠脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞以1:5-1:10混 合，滴加37°C的50 % PEG (PH8. 0) lml，加入不完全培養基及其余終止液，離心棄上清后加入 HAT培養基懸浮混勻，MC定容到50ml，分裝到3. 5cm培養皿中，放于濕盒中，置于37°C、5% C02恒溫培養箱中進行培養。
[0050] 3、篩選和克隆：融合7-10天內挑選細胞克隆，使用Ki67純化重組蛋白進行ELISA 測試。標記細胞株號。對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定ELISA值， 挑取0D280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至ELISA測定96孔板全板結果為陽 性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應融合板細胞株為UMAB107。
[0051] 4、腹水單克隆抗體的制備與純化：10-12周齡的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5ml 降植烷，一周后每只小鼠用lml注射器腹腔注射經PBS洗滌重懸的單克隆細胞懸液，細胞用 量為5X 106/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層 析法進行腹水純化，根據抗體壓型選擇相應柱料，單克隆抗體UMAB107亞型為IgG2a，采用 protein G進行純化。純化后的單克隆抗體濃度測定、分裝、凍存在-20°C。
[0052] 實施例3、Ki67單克隆抗體的Western blot檢測
[0053] 分別以人結腸癌細胞HT-29細胞系裂解物、細支氣管肺泡腺癌NCI-H322M細胞系 裂解物、人急性淋巴細胞白血病Molt4細胞系裂解物和人乳腺癌MDA-MB231細胞系裂解物 為抗原，以實施例2制備的Ki67單克隆抗體UMAB107作為一抗，進行Western blot檢測， 結果見圖1。
[0054] 由圖1結果可見，Ki67蛋白在HT-29、NCI-H322M、M0LT4和MDA-MB231中均有表達， 表明實施例2制備的單克隆抗體UMAB107能夠識別HT-29、NCI-H322M、M0LT4和MDA-MB231 的Ki67蛋白。但各泳道中均有ladder的形式存在，分析原因認為由于Ki67包含有40個 弱的和10個強的PGST區（富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）。PGST區很不穩定，故 Ki67對蛋白酶非常敏感，所以Ki67檢測到WB的條帶會是ladder的形式。實施例4、單克 隆抗體UMAB107為一抗的免疫組化檢測
[0055] (1)、實驗方法：
[0056] 1、分別取乳腺癌癌變組織塊、人扁桃體組織塊、人結腸組織塊和小鼠結腸組織塊 進行石蠟包埋，使用Finesse組織切片機進行切片，組織厚度為6 μ m。
[0057] 2、脫錯與水化：分析純二甲苯3X lOmin，無水乙醇3X lOmin，95%乙醇5min，85% 乙醇5min，75%乙醇5min，去離子水浸泡3minX 3次
[0058] 3、加入抗原修復液（0· 01M，ρΗ6· 0枸櫞酸鈉緩沖液）高壓鍋高壓熱修復2min，待 高壓鍋溫度降至約90°C時，打開高壓鍋，取出標本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡 3minX 3 次。
[0059] 4、使用3%過氧化氫滅活組織內源性過氧化物酶，室溫靜置lOmin。去離子水浸泡 5minX 3 次。
[0060] 5、加上封閉液$83+5%脫脂奶粉+5%正常山羊血清），37°(：孵育6〇1^11。
[0061] 6、去除封閉液，勿沖洗，加入Ki67單克隆抗體（UMAB107)，稀釋比：1:150,使用封 閉液進行稀釋。置于濕盒中，37°C孵育60min。PBST(0. 1% Tween-20)洗滌2次，每次洗滌 5min。PBST(0. 02% Tween-20)洗滌 1 次，每次洗滌 5min。
[0062] 7、滴加 Polink-試劑盒 2(Catlog No. D37-15)試劑