殺蟲蛋白的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種殺蟲蛋白的用途，特別是設及一種&ylA蛋白質通過在植物中表 達來控制粟灰懼為害植物的用途。
【背景技術】
[0002] 栗灰懼煙lilo in化scatellus)又名甘庶二點懼，屬于鱗翅目懼蛾科，廣泛分布于 東南亞、南亞及中國，在中國主要為害禾本科作物，如玉米、高梁、谷子和甘庶等。粟灰懼為 蛙莖害蟲，植株受害后可造成枯屯、株。一般情況下，春谷區和春夏谷混播區發生重，夏谷區 為害輕。
[0003] 玉米是中國重要的糧食作物，隨著全球溫室效應的加強，近兩年溫度不斷上升，蟲 害發生種類及數量都有所提高。粟灰懼曾經是華北地區和華南地區的主要害蟲，主要為害 高梁、谷子和甘庶。但近年來，出現了大量關于粟灰懼為害玉米的報道，且該為害呈上升趨 勢。目前針對粟灰懼的為害，主要依靠農業防治、化學防治和物理防治。
[0004] 農業防治是對整個農田生態系統中多因素的綜合協調管理，調控作物、害蟲、環境 因素、創造一個有利于作物生長而不利于粟灰懼發生的農田生態環境。因粟灰懼一般在± 表下10cm的殘莖中越冬，因此可W通過及時清理收獲后的玉米、高梁、谷子和甘庶的枯葉、 殘莖，W達到消滅越冬蟲源的目的。同時可針對粟灰懼的食性較為單一，而采用輪作的方式 W降低蟲源密度，例如可與大豆、棉花、蔬菜等闊葉類作物進行輪種。但不同作物的經濟效 益的不同，輪作很可能造成農民收入的降低，而很難得到實行。
[0005] 化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是粟灰懼綜合治理的重要 組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是粟灰懼大發生的情況下，是 必不可少的應急措施。粟灰懼作為蛙莖害蟲，對其的防治時期把握非常重要，用藥最佳時期 是卵解盛期至幼蟲蛙莖之前，否則高齡幼蟲蛙入莖桿之后，將很難達到防治的目的。目前化 學防治方法主要是藥液噴霧和施撒毒±。但化學防治也有其局限性，如使用不當往往會導 致農作物發生藥害、害蟲產生抗藥性，W及殺傷天敵、污染環境，使農田生態系統遭到破壞 和農藥殘留對人、畜的安全構成威脅等不良后果。
[0006] 物理防治主要根據害蟲對環境條件中各種物理因素的反應，利用各種物理因素如 光、電、色、溫濕度等W及機械設備進行誘殺、福射不育等方法來防治害蟲。目前應用最廣泛 的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠距離用波，引誘害蟲靠 近，對粟灰懼成蟲的防治具有一定的效果；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時清理高壓電網 上的污垢，否則會影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危險； 此外安裝燈的一次性投入較大。
[0007] 為了解決農業防治、化學防治和物理防治在實際應用中的局限性，科學家們經過 研究發現將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗蟲轉基因植物W防治植 物蟲害。化ylA殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽抱桿菌庫斯塔基亞種 炬acillus thuringiensis subsp. kurstaki，B. t. k.)產生的不溶性伴抱結晶蛋白。
[0008] 化ylA蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性抑環境 下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸 上皮細胞膜上表面上受體結合，插入腸膜，導致細胞膜出現穿孔病灶，破壞細胞膜內外的滲 透壓變化及抑平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導致其死亡。
[0009] 已證明轉化ylA基因的植株可W抵抗玉米懼、棉鈴蟲、秋粘蟲等鱗翅目 (Lepidoptera)害蟲的侵害，然而，至今尚無關于通過產生表達化ylA蛋白的轉基因植株來 控制粟灰懼對植物危害的報道

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過產生表達化ylA蛋白 的轉基因植株來控制粟灰懼對植物危害的方法，且有效克服現有技術農業防治、化學防治 和物理防治等技術缺陷。
[0011] 為實現上述目的，本發明提供了一種控制粟灰懼害蟲的方法，包括將粟灰懼害蟲 至少與化ylA蛋白接觸。
[0012] 進一步地，所述化ylA蛋白存在于至少產生所述化ylA蛋白的宿主細胞中，所述粟 灰懼害蟲通過攝食所述宿主細胞至少與所述化ylA蛋白接觸。
[0013] 更進一步地，所述&ylA蛋白存在于至少產生所述&ylA蛋白的細菌或轉基因植 物中，所述粟灰懼害蟲通過攝食所述細菌或轉基因植物的組織至少與所述化ylA蛋白接 觸，接觸后所述粟灰懼害蟲生長受到抑制和/或導致死亡，W實現對粟灰懼危害植物的控 制。
[0014] 所述轉基因植物可W處于任意生育期。
[0015] 所述轉基因植物的組織為葉片、莖桿、果實、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0016] 所述對粟灰懼危害植物的控制不因種植地點和/或種植時間的改變而改變。
[0017] 所述植物為玉米、高梁、谷子、甘庶、水稻、小麥、大麥或燕麥。
[0018] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述&ylA蛋白的多核巧酸的植物。
[0019] 在上述技術方案的基礎上，所述化ylA蛋白為化ylAb蛋白、化ylAc蛋白或 CrylAb/Ac 蛋白。
[0020] 優選地，所述CrylA蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列。所述化ylA蛋白的核巧酸序列具 有569 10側:2、569 10側:4、569 10側:6、569 10側:8或569 10側：10所示的核巧酸 序列。
[0021] 在上述技術方案的基礎上，編碼所述化ylA蛋白的核巧酸序列與至少一種不同于 所述&ylA蛋白編碼序列的第二種核巧酸進行重組。
[0022] 進一步地，所述第二種核巧酸編碼化y類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶 抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過氧化物酶。
[0023] 優選地，所述第二種核巧酸編碼Vip3A蛋白或化ylle蛋白。
[0024] 進一步地，所述Vip3A蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列， 所述化ylle蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。
[0025] 更進一步地，所述第二種核巧酸具有SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 16所示的核巧 酸序列。
[0026] 可選擇地，所述第二種核巧酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0027] 為實現上述目的，本發明還提供了一種&ylA蛋白質控制粟灰懼害蟲的用途。
[002引為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制粟灰懼害蟲的植物的方法，包括 向所述植物的基因組中引入編碼&ylA蛋白的多核巧酸序列。
[0029] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制粟灰懼害蟲的植物繁殖體的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，和/或取下由所述方法獲得的植 株上具有繁殖能力的組織進行培養，從而產生含有編碼化ylA蛋白的多核巧酸序列的繁殖 體。
[0030] 為實現上述目的，本發明還提供了一種培養控制粟灰懼害蟲的植物的方法，包 括：
[0031] 種植至少一個植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼化ylA蛋白的多 核巧酸序列；
[0032] 使所述植物繁殖體長成植株；
[0033] 使所述植株在人工接種粟灰懼害蟲和/或粟灰懼害蟲自然發生危害的條件下生 長，收獲與其他不具有編碼化ylA蛋白的多核巧酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷和 /或具有增加的植物產量的植株。
[0034] 本發明中所述的"植物繁殖體"包括但不限于植物有性繁殖體和植物無性繁殖體。 所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無性繁殖體是指植物體的營養器官 或某種特殊組織，其可W在離體條件下產生新植株；所述營養器官或某種特殊組織包括但 不限于根、莖和葉，例如根為無性繁殖體的植物包括草替和甘馨等；W莖為無性繁殖體 的植物包括甘庶和馬鈴馨（塊莖）等；W葉為無性繁殖體的植物包括蘆菩和秋海棠等。
[0035] 本發明中所述的"重組"是指通常不能在自然界中發現并且因此通過人工干預產 生的DNA和/或蛋白和/或生物體的形式。該種人工干預可產生重組DNA分子和/或重組 植物。所述"重組DNA分子"是通過人工組合兩種在其它情況下是分離的序列區段而獲得 的，例如通過化學合成或通過遺傳工程技術操作分離的核酸區段。進行核酸操作的技術是 眾所周知的。
[0036] 本發明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞既可W是其體內表達 殺蟲蛋白，還可W是所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產生殺蟲蛋白的微生物。
[0037] 本發明術語"控制"和/或"防治"是指粟灰懼害蟲至少與化ylA蛋白接觸，接觸后 粟灰懼害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。進一步地，粟灰懼害蟲通過攝食植物組織至少 與Cry 1A蛋白接觸，接觸后全部或部分粟灰懼害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。抑制是指 亞致死，即尚未致死但能引起生長發育、行為、生理、生化和組織等方面的某種效應，如生長 發育緩慢和/或停止。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方法下培養W用于產物 的消耗和/或生成。此外，含有編碼&ylA蛋白的多核巧酸序列的控制粟灰懼害蟲的植物 和/或植物種子，在人工接種粟灰懼害蟲和/或粟灰懼害蟲自然發生危害的條件下，與非轉 基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現包括但不限于改善的莖桿抗性、和/ 或提高的巧粒重量、和/或增產等。CrylA蛋白對粟灰懼的"控制"和/或"防治"作用是可 W獨立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"粟灰懼害蟲的物質的存在而減弱和/或消 失。具體地，轉基因植物（含有編碼&ylA蛋白的多核巧酸序列）的任何組織同時和/或 不同步地，存在和/或產生，化ylA蛋白和/或可控制粟灰懼害蟲的另一種物質，則所述另 一種物質的存在既不影響CrylA蛋白對粟灰懼的"控制"和/或"防治"作用，也不能導致 所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另一種物質實現，而與化ylA蛋白 無關。通常情況下，在大田，粟灰懼害蟲攝食植物組織的過程短暫且很難用肉眼觀察到，因 此，在人工接種粟灰懼害蟲和/或粟灰懼害蟲自然發生危害的條件下，如轉基因植物（含有 編碼&ylA蛋白的多核巧酸序列）的任何組織存在死亡的粟灰懼害蟲、和/或在其上停留 生長受到抑制的粟灰懼害蟲、和/或與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷， 即為實現了本發明的方法和/或用途，即通過粟灰懼害蟲至少與化ylA蛋白接觸W實現控 制粟灰懼害蟲的方法和/或用途。
[003引在本發明中，&ylA蛋白在一種轉基因植物中的表達可W伴隨著一個或多個 類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的融合表達。該種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉 基因植物中共同表達可W通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種 植物（第1親本）可W通過遺傳工程操作表達化ylA蛋白質，第二種植物（第2親本）可 W通過遺傳工程操作表達類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第1親本和第 2親本雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0039] RNA干擾（RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此在本 發明中可W使用RNAi技術特異性剔除或關閉目標昆蟲害蟲中特定基因的表達。
[0040] 在分類系統上，一般主要根據成蟲翅的脈序、連鎖方式和觸角的類型等形態特征， 將鱗翅目分為亞目、總科、科等，而懼蛾科是鱗翅目中種類最多的科之一，全世界已發現1 萬種W上，僅中國記錄就有幾千條。大部分懼蛾科