殺蟲蛋白的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種殺蟲蛋白的用途，特別是涉及一種Vip3A蛋白質通過在植物中表 達來控制二化螟為害植物的用途。
【背景技術】
[0002] 二化螟Chilosuppressalis屬鱗翅目，螟蛾科，在我國南北稻區廣泛分布的常發 性害蟲之一。在分蘗期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白穗，一般年份減 產3% -5%，嚴重時減產在3成以上，給當前的水稻生產造成嚴重威脅。
[0003] 水稻是中國重要的糧食作物，隨著全球溫室效應的加強，近兩年溫度不斷上升，蟲 害發生種類及數量都有所提高。每年因二化螟造成的糧食損失巨大，更甚者影響到當地人 口的生存狀況。為了防治二化螟，人們通常采用的主要防治方法有：農業防治、化學防治和 物理防治。
[0004] 農業防治是把整個農田生態系統多因素的綜合協調管理，調控作物、害蟲、環境因 素、創造一個有利于作物生長而不利于二化螟發生的農田生態環境。可以采取調整水稻播 種期、處理稻茬、灌水滅蟲、拔出白穗等措施，以達到消滅一定數量害蟲的目的。因農業防治 必須服從作物布局和增產的要求，應用有一定的局限性，不能作為應急措施，在二化螟爆發 時就顯得無能為力。
[0005] 化學防治即農藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是二化螟綜合治理的重要 組成部分，它具有快速、方便、簡便和高經濟效益的特點，特別是二化螟大發生的情況下，是 必不可少的應急措施。二化螟作為蛀莖害蟲，對其的防治時期把握非常重要，用藥最佳時期 是卵孵盛期至幼蟲蛀莖之前，否則高齡幼蟲蛀入莖桿之后，將很難達到防治的目的。目前化 學防治方法主要是藥液噴霧。但化學防治也有其局限性，如使用不當往往會導致農作物發 生藥害、害蟲產生抗藥性，以及減少天敵、污染環境，使農田生態系統遭到破壞和農藥殘留 對人、畜的安全構成威脅等不良后果。
[0006] 物理防治主要根據害蟲對環境條件中各種物理因素的反應，利用各種物理因素如 光、電、色、溫濕度等以及機械設備進行誘殺、輻射不育等方法來防治害蟲。目前應用最廣泛 的是頻振式殺蟲燈誘殺，它利用害蟲成蟲的趨光性，近距離用光，遠距離用波，引誘害蟲靠 近，對二化螟成蟲的防治具有一定的效果；但是頻振式殺蟲燈需要每天及時清理高壓電網 上的污垢，否則會影響殺蟲效果；并且在雷雨天不能開燈，在操作上還有電擊傷人的危險； 此外安裝燈的一次性投入較大。
[0007] 為了解決農業防治、化學防治和物理防治在實際應用中的局限性，科學家們經過 研宄發現將來自于蘇云金芽孢桿菌的編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉入植物中，可獲得一些抗 蟲轉基因植物以防治植物蟲害。Vip3A殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蠟狀芽孢桿 菌產生的特異性蛋白質。
[0008] Vip3A蛋白通過激發凋亡類型的細胞程序性死亡對敏感性昆蟲具有毒殺效應。 Vip3A蛋白在昆蟲腸道內被水解為4種主要蛋白產物，其中只有一種蛋白水解產物（33KD) 為Vip3A蛋白的毒性核心結構。Vip3A蛋白結合敏感昆蟲的中腸上皮細胞，啟動細胞程序性 死亡，造成中腸上皮細胞的溶解導致昆蟲死亡。對非敏感昆蟲不產生任何病癥，不會導致中 腸上皮細胞的凋亡和溶解。
[0009] 已證明轉Vip3A基因的植株可以抵抗小地老虎、草地貪夜蛾、大螟、水稻夜蛾等鱗 翅目Lepidoptera害蟲的侵害，然而，至今尚無關于通過產生表達Vip3A蛋白的轉基因植株 來控制二化螟對植物危害的報道。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是提供一種殺蟲蛋白的用途，首次提供了通過產生表達Vip3A蛋白 的轉基因植株來控制二化螟對植物危害的方法，且有效克服現有技術農業防治、化學防治 和物理防治等技術缺陷。
[0011] 為實現上述目的，本發明提供了一種控制二化螟害蟲的方法，包括將二化螟害蟲 至少與Vip3A蛋白接觸。
[0012] 進一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少產生所述Vip3A蛋白的宿主細胞中，所述二 化螟害蟲通過攝食所述宿主細胞至少與所述Vip3A蛋白接觸。
[0013] 更進一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少產生所述Vip3A蛋白的細菌或轉基因植 物中，所述二化螟害蟲通過攝食所述細菌或所述轉基因植物的組織至少與所述Vip3A蛋白 接觸，接觸后所述二化螟害蟲生長受到抑制和/或導致死亡，以實現對二化螟危害植物的 控制。
[0014] 所述轉基因植物可以處于任意生育期。
[0015] 所述轉基因植物的組織為根、葉片、莖桿、果實、雄穗、雌穗、花藥或花絲。
[0016] 所述對二化螟危害植物的控制不因種植地點和/或種植時間的改變而改變。
[0017] 所述植物來自水稻、甘蔗、茭白、玉米、高粱、大豆、油菜、麥類、粟或稗。
[0018] 所述接觸步驟之前的步驟為種植含有編碼所述Vip3A蛋白的多核苷酸的植物。
[0019] 優選地，所述Vip3A蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的 氨基酸序列。所述Vip3A蛋白的核苷酸序列具有SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 4所示的核苷 酸序列。
[0020] 在上述技術方案的基礎上，所述植物還可以包括至少一種不同于編碼所述Vip3A 蛋白的核苷酸的第二種核苷酸。
[0021] 進一步地，所述第二種核苷酸編碼Cry類殺蟲蛋白質、Vip類殺蟲蛋白質、蛋白酶 抑制劑、凝集素、a-淀粉酶或過氧化物酶。
[0022] 優選地，所述第二種核苷酸編碼CrylAb蛋白。
[0023] 更進一步地，所述CrylAb蛋白的氨基酸序列具有SEQIDN0:5所示的氨基酸序 列，所述第二種核苷酸具有SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。
[0024] 可選擇地，所述第二種核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0025] 為實現上述目的，本發明還提供了一種Vip3A蛋白質控制二化螟害蟲的用途。
[0026] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制二化螟害蟲的植物的方法，包括 向所述植物的基因組中引入編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列。
[0027] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制二化螟害蟲的植物繁殖體的方 法，包括將由所述方法獲得的第一植株與第二植株雜交，和/或取下由權利要求18所述方 法獲得的植株上具有繁殖能力的組織進行培養，從而產生含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸 序列的植物繁殖體。
[0028] 為實現上述目的，本發明還提供了一種培養控制二化螟害蟲的植物的方法，包 括：
[0029] 種植至少一個植物繁殖體，所述植物繁殖體的基因組中包括編碼Vip3A蛋白的多 核苷酸序列；
[0030] 使所述植物繁殖體長成植株；
[0031] 使所述植株在人工接種二化螟害蟲和/或二化螟害蟲自然發生危害的條件下生 長，收獲與其他不具有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有減弱的植物損傷和 /或具有增加的植物產量的植株。
[0032] 本發明中所述的"植物繁殖體"包括但不限于植物有性繁殖體和植物無性繁殖體。 所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無性繁殖體是指植物體的營養器官 或某種特殊組織，其可以在離體條件下產生新植株；所述營養器官或某種特殊組織包括但 不限于根、莖和葉，例如：以根為無性繁殖體的植物包括草莓和甘薯等；以莖為無性繁殖體 的植物包括甘蔗和馬鈴薯（塊莖）等；以葉為無性繁殖體的植物包括蘆薈和秋海棠等。
[0033] 本發明中所述的"接觸"，是指昆蟲和/或害蟲觸碰、停留和/或攝食植物、植物器 官、植物組織或植物細胞，所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞既可以是其體內表達 殺蟲蛋白，還可以是所述植物、植物器官、植物組織或植物細胞的表面具有殺蟲蛋白和/或 具有產生殺蟲蛋白的微生物。
[0034] 本發明術語"控制"和/或"防治"是指二化螟害蟲至少與Vip3A蛋白接觸，接觸 后二化螟害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。進一步地，二化螟害蟲通過攝食植物組織至 少與Vip3A蛋白接觸，接觸后全部或部分二化螟害蟲生長受到抑制和/或導致死亡。抑制 是指亞致死，即尚未致死但能引起生長發育、行為、生理、生化和組織等方面的某種效應，如 生長發育緩慢和/或停止。同時，植物在形態上應是正常的，且可在常規方法下培養以用 于產物的消耗和/或生成。此外，含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列的控制二化螟害蟲 的植物和/或植物繁殖體，在人工接種二化螟害蟲和/或二化螟害蟲自然發生危害的條件 下，與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的植物損傷，具體表現包括但不限于改善的莖 桿抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增產等。Vip3A蛋白對二化螟的"控制"和/或"防 治"作用是可以獨立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"二化螟害蟲的物質的存在而 減弱和/或消失。具體地，轉基因植物（含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何組 織同時和/或不同步地，存在和/或產生，Vip3A蛋白和/或可控制二化螟害蟲的另一種物 質，則所述另一種物質的存在既不影響Vip3A蛋白對二化螟的"控制"和/或"防治"作用， 也不能導致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另一種物質實現，而與 Vip3A蛋白無關。通常情況下，在大田，二化螟害蟲攝食植物組織的過程短暫且很難用肉眼 觀察到，因此，在人工接種二化螟害蟲和/或二化螟害蟲自然發生危害的條件下，如轉基因 植物（含有編碼Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何組織存在死亡的二化螟害蟲、和/或 在其上停留生長受到抑制的二化螟害蟲、和/或與非轉基因的野生型植株相比具有減弱的 植物損傷，即為實現了本發明的方法和/或用途，即通過二化螟害蟲至少與Vip3A蛋白接觸 以實現控制二化螟害蟲的方法和/或用途。
[0035] 在本發明中，Vip3A蛋白在一種轉基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry 類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉基因 植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現。另外，一種植物 (第1親本）可以通過遺傳工程操作表達Vip3A蛋白質，第二種植物（第2親本）可以通過 遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質和/或Vip類殺蟲蛋白質。通過第1親本和第2親本 雜交獲得表達引入第1親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0036] RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。因此在本 發明中可以使用RNAi技術特異性剔除或關閉目標昆蟲害蟲中特定基因的表達。
[0037] 在分類系統上，一般主要根據成蟲翅的脈序、連鎖方式和觸角的類型等形態特征， 將鱗翅目分為亞目、總科、科等，而螟蛾科是鱗翅目中種類最多的科之一，全