微流體細胞培養系統的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年7月29日提交的題為"微流體室"的美國臨時專利序列號61/ 859318和2014年6月18日提交的題為"微流體室"的美國臨時專利申請序列號62/013746的 優先權權益。
技術領域
[0003] 本發明設及一種細胞培養系統，更具體地，設及一種用于神經研究的微制造的微 流體培養系統。
【背景技術】
[0004] 生物系統從非常簡單變化到極其復雜。在動物與人類的許多神經系統中，神經系 統是協調其自愿和非自愿行動的部分，并且在其身體的不同部分之間傳送信號。它包括兩 個主要部分，中樞神經系統(CNS)和外周神經系統(PNS)dCNS包含腦和脊髓，而PNS主要包括 神經，它們圍成長纖維或軸突束，其將CNS連接到身體的每個其它部分。PNS包括:運動神經 元，調解自愿運動；自主神經系統，包括交感神經系統和副交感神經系統，從而調節非自愿 功能，和腸神經系統，其用于控制胃腸系統。
[000引在細胞水平，神經系統由存在的神經元（也被稱為"神經細胞"）限定。神經元具有 特殊結構，使它們能夠將信號W沿細纖維(稱為軸突)行進的電化學波的形式迅速和精確地 發送到其它細胞，運些細纖維引起化學品（稱為神經遞質)在結點、突觸釋放。是神經元之間 的連接形成神經回路，W及是神經網絡產生世界的生物體感知并確定其行為。人類的CNS估 計包括大約850億個神經元，在大腦皮層和小腦之間分裂約20 %和80 %。
[0006] 正如對于許多人類生理系統來說，CNS中的問題可能會對個人出現，導致各種神經 病癥，包括但不限于進行性神經性脾骨肌萎縮癥、老年癡呆癥、帕金森氏病、多發性硬化、重 癥肌無力、脫髓銷和軸突變性。在許多情況下，運些神經系統問題出現在老年人中，我們在 過去兩百年間增加的壽命已經使運種問題更加明顯，并且越來越普遍。即使在1950年至 2010年期間，歐洲和北美的預期壽命從65歲提高到了將近80歲。在亞洲已經從40歲提高到 了將近70歲。據估計，到2050年，在全球范圍內每85個人中將有一個人會患上阿爾茨海默氏 癥，或者采用聯合國對2050年的世界人口估計將會約有1.1億人患上該病。相比之下，估計 在每300個人中將有一個人患上帕金森病，到2050年又將增加近3000萬患者。
[0007] 因此，神經學研究極其重要，W便為患者建立醫療和/或藥物治療方案，來減輕/延 緩其影響，從而對國家健康預算減少財政負擔，和/或尋求減少、延遲或移除其對個人的出 現和影響的生活方式、環境、和/或藥物因素或調整。解離細胞的培養使得研究人員能夠更 具體地描述所研究的神經系統及因此目前許多實驗室進行神經元培養。傳統上，運些神經 元培養物在培養皿或培養阱內進行，并且已經允許在神經變性疾病比如阿爾茨海默氏病、 亨廷頓氏病、亞急性海綿狀腦病等的研究而且在用于理解神經元分化的分子和細胞機理的 發育生物學取得顯著研究成果。
[0008] 然而，在運些系統中，神經元連接被隨機制成，并且不可能在其中重建類似于在體 內發現的那些的架構。因此，雖然細胞培養方法是一種常用的研究方法來提供生長條件細 胞的系統控制操作，在許多情況下具有神經元、突觸和軸突，將整個細胞暴露于相同條件的 主要現有技術方法并不總是有益的。一些細胞可W是不對稱的，并且具有專口的區域。例 如，神經元被極化，并且具有在相對長的距離（例如軸突）上延伸的許多過程。因此，在細胞 水平上向研究人員、醫生等提供微環境將會是有益的。
[0009] 通過使用微制造過程，在微米級(適于細胞生物學)控制流體和表面特性的能力還 提供了用于調查基本生物過程的新機會。例如，研究人員可能有選擇地隔離和治療細胞的 專業部分或領域。研究人員可W通過圖案化技術比如微接觸印刷指示神經元附著的位點和 神經突增生的定向和長度。其次，通過將流體隔離域保持在培養區域內，研究人員可W將一 系列正負刺激輸送到胞體、軸突或樹突。由于神經元代表優異的細胞類型來說明運些概念 并且將作為許多運種實驗的基礎，所W本發明人因此用它們作為其微制造的微流體細胞培 養概念的實驗驗證的基礎。然而，本領域普通技術人員要認識到的是，根據本發明實施例的 方法和系統將適用于其它類型的細胞或生物類型的應用。
[0010] 因此，本發明的實施例有利地設及一種微制造的微流體細胞系統，其結合了用于 低成本、高容量、占地面積小的系統的微制造技術連同低體積微流體和表面微圖案化技術 來創建多室神經元培養設備。微流體正逐漸成為細胞生物學特別是用于神經科學的選擇工 具。在Jeon等人的W0/2004/034016"用于神經研究的微流體多隔室裝置(Microfluidic Multi-Compartment Device for 化uroscience Research)"和題為。在裝置中的相互連接 的隔室之間實現流體隔絕的微流體裝置W及方法(A Microfluidic Device for Enabling Fluidic Isolation among Interconnected Compartments within the Apparatus and Methods relating to the same)"的美國專利7419822中；微流體回路結構使得能夠將神 經元的胞體與它們的軸突隔離。運些結構由Campenot在"神經生長因子對軸突發展的局部 控審lJ(Local Control of Neurite Development by Nerve Growth Factor)" (Proc. Natl. Acad. Sci.，Vol. 74( 10)，pp. 4516-4519])中從更早的研究得出。雖然適于體外 的中樞神經系統(CNS)的神經元的研究，但該方法依賴于的事實是微通道中的擴散時間很 長，運使得能夠分開處理遠端和體細胞室。
[0011] 為了在現有技術內解決此，通過施加很容易實現的壓力差來提供補償。例如，將較 大量的液體放入室之一的儲存器中W便在不同的室之間產生流體靜壓力差僅足W。運種現 有技術的實例包括在Jeon等人的題為"(用于實現細胞控制生長的微流體裝置^11(3'〇- Fluidic Device for Enabling 1:he Controlled Growth of Cells"的W0/2006/037033中 和題為"(用于實現細胞控制生長的微流體裝置W及相關方法)Microfluidic Device for Enabling the Controlled Growth of Cells and Methods Relating to same"的 US2008/0257735中。Viovy等人的題為"(用于細胞培養的裝置)Device for Cell CulUire" 的US2011/0306041尋求將運些概念擴展到神經網絡和更復雜的結構。根據美國專利 7419822的裝置目前在商業上由W聚二甲基硅氧烷(PMDS)制造的Xona微流體提供。
[0012] 然而，運些裝置仍然向研究人員表現出局限性，因此本發明的目的特別是為了解 決運些各種限制，并且允許研究、方法和篩選可不采用目前的現有技術裝置進行。運些包括 降低制造的復雜性、所需的藥物和細胞的量，允許用于神經生物學之外的領域，改進在該裝 置的所需微通道區域內的粘合性，與標準顯微鏡兼容，使得軸突能夠生長超過1mm，神經存 活達超過14天的延長時間，允許突觸成像，并且采用生物相關的材料包覆結構。
[0013] 對于本領域普通技術人員而言，結合附圖并參照本發明的具體實施方案的W下描 述，本發明的其它方面和特征將變得顯而易見。

【發明內容】

[0014] 本發明的目的是減輕與細胞培養系統更具體的是用于神經研究的微制造的微流 體培養系統有關的現有技術中的局限性。
[0015] 根據本發明的實施例，提供了一種微流體裝置，包括由微通道連接的第一和第二 隔室，每個隔室包括連接到第一和第二輔助室的主室。
[0016] 根據本發明的實施例，提供了一種制造微流體裝置的方法，該微流體裝置包括由 微通道連接的第一和第二隔室，每個隔室包括連接到第一和第二輔助室的主室。
[0017] 根據本發明的實施例，提供了 一種培養細胞的方法，包括：
[0018] 提供一種微流體裝置，其包括由微通道連接的第一和第二隔室，所述第一和第二 隔室包括主室，所述主室連接到具有所述主室的第一和第二輔助室，其中，
[0019] 至少一個每個主室在沿著主室側壁的最接近微通道陣列的端壁的每個端部包括 角，其中，所述主室在所述端壁的其他角具有所述第一和第二輔助室，并且在所述角具有相 對于具有微通道的主室的側壁的高角度；W及
[0020] 至少一個主室具有基本上相對于具有沿其布置的微通道的側壁的第二側壁，其 中，所述第二側壁具有的輪廓選自包括楠圓、拋物線、雙曲線、圓、W及預定數學函數中的至 少一個的預定部分的組，并且所述輪廓沿所述微流體裝置從其中間至所述第一輔助室在所 述第一輔助室與所述第二輔助室之間的預定點達到其最接近于另一側壁;W及
[0021 ]將要被培養的細胞引入到所述第一輔助室和所述第二輔助室之一中。
[0022] 根據本發明的實施例，提供了一種執行醫療測試的方法，包括：
[0023] 提供一種微流體裝置，其包括由微通道連接的第一和第二隔室，所述第一和第二 隔室包括主室，所述主室連接到具有所述主室的第一和第二輔助室，其中，
[0024] 至少一個每個主室在沿著主室側壁的最接近微通道陣列的端壁的每個端部包括 角，其中，所述主室在所述端壁的其他角具有所述第一和第二輔助室，并且在所述角具有相 對于具有微通道的主室的側壁的高角度；W及
[0025] 至少一個主室具有基本上相對于具有沿其布置的微通道的側壁的第二側壁，其 中，所述第二側壁具有的輪廓選自包括楠圓、拋物線、雙曲線、圓、W及預定數學函數中的至 少一個的預定部分的組，并且所述輪廓沿所述微流體裝置從其中間至所述第一輔助室在所 述第一輔助室與所述第二輔助室之間的預定點達到其最接近于另一側壁;W及
[0026] 將生物樣品引入到所述第一輔助室和所述第二輔助室之一中。
[0027] 根據本發明的實施例，提供了一種微流體裝置，包括：
[0028] 第一和第二隔室，每個隔室包括連接到第一和第二輔助室的主室；
[0029] 多個微通道，其互連該對主室，其中，
[0030] 至少一個每個主室在沿著主室側壁的最接近微通道陣列的端壁的每個端部包括 角，其中，所述主室在所述端壁的其他角具有所述第一和第二輔助室，并且在所述角具有相 對于具有微通道的主室的側壁的高角度；w及
[0031] 至少一個主室具有基本上相對于具有沿其布置的微通道的側壁的第二側壁，其 中，所述第二側壁具有的輪廓選自包括楠圓、拋物線、雙曲線、圓、W及預定數學函數中的至 少一個的預定部分的組，并且所述輪廓沿所述微流體裝置從其中間至所述第一輔助室在所 述第一輔助室與所述第二輔助室之間的預定點達到其最接近于另一側壁。
[0032] 對于本領域普通技術人員而言，結合附圖并參照本發明的具體實施方案的W下描 述，本發明的其它方面和特征將變得顯而易見。
【附圖說明】
[0033] 下面參照附圖，僅通過示例，對本發明的實施例進行說明，其中：
[0034] 圖1示出了在拆卸根據本發明實施例的微流體室之前和之后W納米級重現神經元 損傷的體外模型連同解離大鼠 DRG和海馬神經元的光學顯微鏡圖像；
[0035] 圖2A至2D示出了通過使用在根據本發明實施例的微流體室中生長和培養的軸突 所進行的DRG軸突測量；
[0036] 圖3A至3D分別示出了在軸突壓縮圖3期間聚焦軸突腫脹的逐漸形成和用于海馬和 DRG軸突的相應體積變化；
[0037] 圖4A至4C示出了在由化學誘導的損傷引起的軸突運輸的逐漸損害過程中的FAS的 逐漸形成；
[003引圖5A至5B示出了 DRG和海馬軸突的彈性；
[0039] 圖5C示出了在附連到AFM懸臂的20毫米珠之下的軸突壓縮的模型；
[0040] 圖6示出了根據本發明實施例的微流體結構的效率；
[0041] 圖7示出了根據本發明實施例的設計、單個掩模和裝置；
[0042] 圖8示意性地示出了將細胞加入根據本發明實施例的微流體結構，示出了壁至通 道相交的設計特點，W增強靠近微通道的細胞保留；
[0043] 圖9示出了根據本發明實施例的微流體結構應用至克氏錐蟲短膜蟲期的分析和對 特定人類蛋白質的吸引；
[0044] 圖10示出了具有根據本發明實施例的第一和第二代微流體裝置的現有技術微流 體結構；
[004引圖11示出了根據本發明實施例的第Ξ代微流體裝置；
[0046] 圖12示出了根據本發明實施例的第Ξ代微流體裝置的細胞接種(plate)連同使用 中的該裝置的光學顯微照片；
[0047] 圖13示出了具有染料加載的示意性的被制造的裝置；
[0048] 圖14和15示出了根據本發明實施例的第Ξ代微流體裝置；
[0049] 圖16示出了在初始細胞加載和培養后的根據本發明實施例的第Ξ代微流體裝置 的橫截面；
[0050] 圖17示出了根據本發明實施例的第Ξ代微流體裝置的橫截面，示出了相對于細胞 的各種微通道幾何形狀；
[0051] 圖18示出了根據本發明實施例的第Ξ代微流體裝置的透視圖，部分組裝和組裝；
[0052] 圖19示出了用于制造主模具且隨后模制根據本發明實施例的用于結構的微流體 裝置的示例性過程流程；
[0053] 圖20示出了根據本發明實施例的微流體裝置和排列的培養結構；W及
[0054] 圖21和22示出了采用根據本發明實施例的微流體裝置和結構生長的培養物的細 胞分析。
【具體實施方式】
[0055] 本發明設及細胞培養系統，更具體地設及用于神經研究的微制造的微流體培養系 統。
[0056] 隨后的描述僅提供示例性實施例，且不旨在限制本公開的范圍、適用性或配置。相 反，示例性實施例的隨后描述將為本領域技術人員提供用于實現示例性實施例的有利描 述。應當理解的是，可W在不脫離由所附權利要求闡述的精神和范圍的情況下對元件的功 能和布置進行各種變化。
[0057] A.材料和方法 [005引 A1:微流體室
[0059] 參照圖7和10-18,在D部分中對根據本發明實施例的微流體室的設計和討論進行 描述和示出。
[0060] 用于根據本發明實施例的微流體室的主要部分被制造于McGill Nanotools Microfabrication Facility，并且通過使用聚二甲基硅氧烷（PDMS)制備，使用道康寧 ?Sylgard?l84硅氧烷彈性體套件，例如參見化rk等人的參考文獻[7]。將PDMS模式組裝到 35毫米玻璃底培養皿上或在涂覆有聚-D-賴氨酸的25毫米玻璃蓋玻片上，W便促進細胞的 粘附/附著。
[006。 A2:神經元培養
[0062] 參見參考文獻[引和[9]，來自任一性別的大鼠胚胎的海馬和DRG神經元被制備，并 加入到微流體室中。通過分別在接種之后Ξ天和八天從DRG和海馬培養移除PDMS來拆卸運 些室。由于在通道之間沒有物理PDMS屏障，海馬和DRG軸突移動并延伸神經突朝向其他軸 突，重塑培養架構并失去并行模式。在DRG培養中，運些變化更加突出，并且在PDMS去除后一 天很明顯，而在海馬軸突中，在不同通道中生長的軸突之間的接觸僅在PDMS去除后3-4天被 觀察。為了盡量減少重塑并保持軸突的并聯組織在培養物中，DRG神經元W比海馬神經元低 四倍的密度被培養，并且在培養中的7-10天內進行測試，而海馬軸突在培養中的14-18天之 后進行測試。培養物密度和年齡的運些變化沒有導致對采用該模型所施加的損傷的軸突回 應的顯著差異。如果指示的話，細胞采用在neurobasal培養基中稀釋達1小時的硫酸長春堿 鹽（C45也8抓〇9 :此S〇4)處理，洗涂并且立即采用AFM測試，或者采用4 %多聚甲醒固定，用于免 疫組織化學分析或原子力顯微鏡(AFM)成像。線粒體被巧光標記有MitoTracker?綠色FM和 具有微管追蹤器?的微管蛋白。
[0063] A3:免疫細胞化學
[0064] 免疫細胞化學被執行為如在參考文獻[引中所述，采用小鼠抗微管蛋白、兔抗神經 絲、兔多克隆抗Tom20(外膜化-145的線粒體前蛋白轉位酶）；W及Alexa Fluor?488共輛毒 傘。所用的次級抗體是羅丹明紅抗小鼠 IgG和Alexa Fluor?647抗兔IgG。采用在倒置的顯微 鏡上的60X PlanApo油浸物鏡，使用激光掃描共聚焦顯微鏡對樣品成像。
[006引 A4:原子力顯微鏡(AFM)
[0066] 使用100X物鏡（1.45NA)和化電荷禪合器件相機，單軸突的同時壓縮和實時成像被 執行在放映機AFM上，其安裝在倒置的光學顯微鏡上。進行兩種不同的壓縮實驗。在第一種 中，參見參考文獻[引，20毫米的聚苯乙締珠被固定到氮化娃探針(標稱彈黃常數k = 0.01N/ m)的末端，并且，用于采用對于不同時間段的范圍為0.1nN^F^4nN的受控力壓縮軸突。在 第二種中，標稱彈黃常數為k = 0.03N/m的無末端η型娃探針用來施加恒定力到軸突。細胞被 安裝到加熱級上并且保持在37Γ，恒定的C02供應達實驗的持續時間。AFM用來W亞微米精 度定位和按壓珠或無末端懸臂到軸突的頂部上。在壓縮之前每30秒對培養物的圖像進行拍 照達5至10分鐘來檢測線粒體運動和軸突生存能力，在壓縮過程中檢測可能表明損傷的軸 突的任何變化，并且在壓縮釋放之后達10至30分鐘W分析軸突恢復。對于模型壓縮來說，在 每個軸突上W30秒間隔獲取靜態模式下的一系列15個力-距離曲線。在數據采集過程中，采 用0.化N的加載力。
[0067] 采用兩個不同的儀器在固定的軸突上進行AFM成像，得到類似的結果。為了達到最 好的分辨率并且采用最低的力對最薄的軸突成像，Asylum Research MFP-3D-BI0 AFM安裝 至化lympus倒置的