專利名稱：一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種試劑盒，屬于乙型肝炎病毒核心抗體IgM化學發光免疫分析技術領域。
背景技術：
乙型肝炎核心抗體也叫抗-HBc，英文縮寫是HBcAb。包括乙型肝炎核心抗體IgM和乙型肝炎核心抗體IgG，常用競爭法檢測。HBV感染后，在多數人血清中能檢出此抗體，是一種敏感的血清學標志，也是乙型肝炎急性感染的早期標志，在血清中存在的時間很長，有些人滴度很高。在HBsAg和抗-HBs陰性時，能從血清中檢出乙肝核心抗體，高滴度的乙肝核心抗體也是一種傳染標志。抗-HBc可分為三型抗-HBcIgM、抗-HBcIgA、抗-HBcIgG，在HBV感染中這幾個型依次出現，也會依次消失，只有IgG這一型可長期存在。在化驗室報告的化驗單中，如果只標明“抗-HBc”，沒有分型，那么它應當是這三型的總和，不過大部分醫院化驗室報告的都分為IgM和IgG 二型。抗-HDc IgM型，叫做“乙型肝炎核心抗體IgM型”，常常提示為急性HBV感染，或者在慢性乙肝急性發作、慢性乙肝進入活動期，隨著病程的延長或者病情的好轉，IgM逐步消失，而由IgG取代。乙型肝炎病毒核心抗體IgM用于科學研究過程中，對于微量檢測要求較高。目前乙型肝炎病毒核心抗體IgM測定方法有膠體金免疫層析(GICA);蛋白印跡(WB);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，化學發光法免疫分析(CLIA);其中GICA、ELISA、WB的優點是相對成本低廉，缺點是靈敏度低，乙型肝炎病毒核心抗體IgM含量少的情況下檢測不出；而化學發光法CLIA試劑盒檢測靈敏度比上述方法試劑盒高，但還是不能滿足科研上對乙型肝炎病毒核心抗體IgM超微量檢測的需要。

實用新型內容本實用新型克服了當前化學發光法試劑盒不能滿足對乙型肝炎病毒核心抗體IgM超微量檢測的技術問題，提供了一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，解決目前乙型肝炎病毒核心抗體IgM蛋白超微量檢測的問題。本實用新型采用了以下技術方案來解決技術問題一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，包括盒體和盒蓋，盒體(I)上方連接盒蓋(2)，盒體(I)的底部放置有2cm厚與盒的尺寸大小相同的海綿托(3)，所述海綿托(3)的左半部設有11個第一凹槽、中間區域設有4個第二凹槽、右半部設有2個第三凹槽，第一凹槽內分別裝有11個對照品瓶(5)，第二凹槽內分別裝有磁性顆粒瓶(6)、生物素化合物瓶、標記物瓶(8)和濃縮樣本稀釋液瓶(9)，第三凹槽分別裝有化學發光底物瓶(10)和濃縮洗滌液瓶(11)。作為本實用新型進一步改進，所述的盒體(I)、盒蓋(2)均采用塑化防水紙質材料制成。作為本實用新型進一步改進，第一凹槽的截面形狀與所述對照品瓶(5)的截面形狀匹配。作為本實用新型進一步改進，4個第二凹槽的截面形狀分別與磁性顆粒瓶(6)、生物素化合物瓶(7)、標記物瓶(8)以及濃縮樣本稀釋液瓶(9)的截面形狀匹配。作為本實用新型進一步改進，2個第三凹槽的截面形狀分別與化學發光底物瓶
(10)和濃縮洗滌液瓶(11)的截面形狀匹配。作為本實用新型進一步改進，所述的對照品瓶(5)，磁性顆粒瓶(6)，生物素化合物瓶(7)，標記物瓶(8)，濃縮樣本稀釋液瓶(9)，化學發光底物瓶(10)和濃縮洗滌液瓶
(11)均采用玻璃瓶。與現有技術相比，本實用新型的有益效果是發光信號明顯提高，對超微量的乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測效果明顯優于現有化學發光免疫分析試劑盒，本實用新型試劑盒具有靈敏度高，穩定的特點。

圖1是本實用新型整體結構示意圖。圖中1盒體；2盒蓋；3海綿托；4第三凹槽；5對照品瓶；6磁性顆粒瓶；7生物素化合物瓶；8標記物瓶；9濃縮樣本稀釋液瓶；10化學發光底物瓶；11濃縮洗滌液瓶。
具體實施方式
如圖1所示，為本實用新型乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒的一種實施例。該乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒包括盒體I和盒蓋2，盒體1、盒蓋2均采用塑化防水紙質材料制成。盒體上方連接盒蓋，盒體的底部放置有2cm厚與盒的尺寸大小相同的海綿托3。所述海綿托3的左半部設有11個第一凹槽、中間區域設有4個第二凹槽、右半部設有2個第
三凹槽4。第一凹槽內分別裝有11個對照品瓶5，并且第一凹槽的截面形狀與所述對照品瓶5的截面形狀匹配。第二凹槽內分別裝有磁性顆粒瓶6、生物素化合物瓶7、標記物瓶8和濃縮樣本稀釋液瓶9，并且4個第二凹槽的截面形狀分別與磁性顆粒瓶6、生物素化合物瓶7、標記物瓶8以及濃縮樣本稀釋液瓶9的截面形狀匹配。第三凹槽4分別裝有化學發光底物瓶10和濃縮洗滌液瓶11，并且2個第三凹槽的截面形狀分別與化學發光底物瓶10和濃縮洗滌液瓶11的截面形狀匹配。在本實施例中，對照品瓶5，磁性顆粒瓶6，生物素化合物瓶7，標記物瓶8，濃縮樣本稀釋液瓶9，化學發光底物瓶10和濃縮洗滌液瓶11均采用玻璃瓶。制備本實用新型乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒一、對照品瓶的制備用對照品基質液及乙型肝炎病毒核心抗體IgM純品配制對照品，濃度分別為O、0. 01,0. 02,0. 05,0. 1,0. 2,0. 5、1、2、5、10ng/mL,(其中 Ong/mL 為對照品基質液，不含乙型肝炎病毒核心抗體IgM)，配制11種系列濃度對照品，各濃度對照品分別用3mL規格的西林玻璃瓶分裝ImL/瓶，凍干處理后，_20°C保存，得到本實用新型對照品瓶5。[0025]二、磁性顆粒瓶的制備(I)稱取250mg氨基末端磁性顆粒置于燒杯；(2)加入甲醇及丙酮各5mL反復清洗5遍；(3)磁性分離，棄去上清；(4)加入DMF溶解的IOmLO. 2%的1，4 一苯二異硫氰酸酯(PDITC)溶液，置于恒溫振蕩器，反應10h ；(5)將反應后的磁性顆粒用丙酮及超純水反復清洗6遍；(6)取新制備經PDITC活化的磁性顆粒置于30mL離心管中；(7)加入PBS 25mL,加入4mg鏈親和素，置于恒溫振蕩器中反應20min ；(8)磁性分離，測定反應前后溶液在280nm的OD值，以PBS清洗3次，收集，加入等量丙三醇，-20°C保存 通過實驗檢測效價，在根據最近效價稀釋比例配制鏈親和素化固相磁性顆粒工作液。用5mL規格西林玻璃瓶分裝ImL/瓶，凍干處理后，_20°C保存，得到本實用新型磁性顆粒瓶6。三、生物素化合物瓶的制備(I)將生物素-N-羥基磺酸基琥珀酰亞胺酯(Sulf0-NHS-Biotin)冰箱取出平衡至
室溫;(2) 0. OlM的PBS稀釋抗U鏈抗體至濃度2mg/mL ；(3)稱取Sulfo-NHS-Biotin 2mg于西林瓶中加超純水300 U L，輕輕搖勻活化。(4)立即將活化的生物素溶液54 ii L緩慢加入2mL抗y鏈抗體溶液中，室溫反應30min ；(5)反應液用0. OlM的PBS透析4°C 8h (換液4次)，收集，加入等量丙三醇，_20°C保存。通過實驗檢測效價，在根據最近效價稀釋比例配制抗U鏈抗體生物素化工作液。用5mL規格西林玻璃瓶分裝ImL/瓶，凍干處理后，_20°C保存，得到本實用新型生物素化合物瓶7。四、標記物瓶的制備(I)將1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)冰柜取出平衡至室溫；(2)取IOmg 5，10，15-三(4-吡啶基)-20-對苯乙酸卟啉和20mgEDC分別溶于Iml超純水中使其溶解；(3)將上述5，10，15-三(4-吡啶基)-20-對苯乙酸卟啉溶液和EDC溶液，在4°C混合攪拌反應30min ；(4)然后向此混合液中緩慢滴加入含30mg/mL乙型肝炎病毒核心重組抗原溶液，室溫攪拌反應2h，層析純化后，-20°C保存。通過實驗檢測效價，在根據最近效價稀釋比例配制5，10，15_三(4-吡啶基)-20-對苯乙酸卟啉偶聯標記乙型肝炎病毒核心重組抗原標記物工作液。用5mL規格西林玻璃瓶分裝ImL/瓶，凍干處理后，_20°C保存，得到本實用新型標記物瓶8。五、濃縮樣本稀釋液瓶的制備NaH2PO4 *2H204g
Na2HPO4 *12^058g
牛血清白蛋白20g
Proclin 300ImL
雙蒸水定容至IOOOmL用5mL規格西林玻璃瓶分裝5mL/瓶，得到本實用新型濃縮樣本稀釋液瓶9。六、化學發光底物瓶的制備
NaH2PO4*2H200 . 2g
Na2HPO4* 12H202 . 9g
吖啶酯0.1g
KCl1.5g
雙蒸水定容至IOOOmL用20mL規格西林玻璃瓶分裝20mL/瓶，得到本實用新型化學發光底物瓶10。七、濃縮洗滌液瓶的制備
NaH2PO4^H2O6g
Na2HPCV 12H2087g
NaCl9g
Tween-200. 2mL
雙蒸水定容至IOOOmL用30mL規格西林玻璃瓶分裝30mL/瓶，得到本實用新型濃縮洗滌液瓶11。八、半成品及成品組成上述步驟所得產品即為半成品。將盒體，盒蓋，海綿托，對照品瓶，磁性顆粒瓶，生物素化合物瓶，標記物瓶，濃縮樣本稀釋液瓶，化學發光底物瓶，濃縮洗滌液瓶組裝成品“乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒”。本實用新型乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒的使用方法(I)從冰箱取出乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒平衡至室溫；(2)將濃縮洗滌液瓶中得濃縮洗滌液稀釋30倍配制洗滌工作液；(3)將濃縮樣本稀釋液瓶中濃縮液稀釋20倍配制樣本稀釋液；(4)將11個對照品瓶(凍干狀態)，每瓶加入ImL純化水進行溶解；(5)向磁性顆粒瓶(凍干狀態)中加入5mL純化水進行溶解；(6)向生物素化合物瓶(凍干狀態)中加入5mL純化水進行溶解；(7)向標記物瓶(凍干狀態)中加入5mL純化水進行溶解；(8)用樣本稀釋液將對照品和待測樣本按1: 10進行稀釋；(9)在反應杯中分別加入對照品和待測樣本稀釋后液體，各50 ii L ;(10)在反應杯中依次加入磁性顆粒瓶復溶液各50 U L，生物素化合物瓶復溶液各50 u L ；[0070](11) 37°C溫育 30 分鐘；(12)磁場吸附,吸去上清液,用300 ii L洗漆緩沖液沖洗,再次磁場吸附，吸取上清
液，重復4遍；(13)在每個反應杯中依次加入標記物瓶復溶液各50 y L(14) 37°C溫育 30 分鐘；(15)磁場吸附，吸去上清液，用300 ii L洗滌緩沖液沖洗，再次磁場吸附，吸取上清
液，重復4遍；(16)在每個反應杯中依次加入化學發光底物瓶溶液200 ii L ;(17)在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)；(18)分別對對照品濃度和對應RLU值，在坐標圖上建立四參數標準曲線，以對照品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，以待測樣本的RLU值在標準曲線上查出該樣本的濃度值。
權利要求1.一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，包括盒體和盒蓋，其特征在于盒體(I)上方連接盒蓋(2)，盒體(I)的底部放置有2cm厚與盒的尺寸大小相同的海綿托(3)，所述海綿托(3)的左半部設有11個第一凹槽、中間區域設有4個第二凹槽、右半部設有2個第三凹槽，第一凹槽內分別裝有11個對照品瓶(5)，第二凹槽內分別裝有磁性顆粒瓶(6)、生物素化合物瓶(7)、標記物瓶(8)和濃縮樣本稀釋液瓶(9)，第三凹槽分別裝有化學發光底物瓶(10)和濃縮洗滌液瓶(11)。
2.根據權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，其特征在于所述的盒體(I)、盒蓋(2)均采用塑化防水紙質材料制成。
3.根據權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，其特征在于第一凹槽的截面形狀與所述對照品瓶(5)的截面形狀匹配。
4.根據權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，其特征在于4個第二凹槽的截面形狀分別與磁性顆粒瓶￠)、生物素化合物瓶(7)、標記物瓶(8)以及濃縮樣本稀釋液瓶(9)的截面形狀匹配。
5.根據權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，其特征在于2個第三凹槽的截面形狀分別與化學發光底物瓶(10)和濃縮洗滌液瓶(11)的截面形狀匹配。
6.根據權利要求1所述的一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，其特征在于所述的對照品瓶(5)，磁性顆粒瓶(6)，生物素化合物瓶(7)，標記物瓶(8)，濃縮樣本稀釋液瓶(9)，化學發光底物瓶(10)和濃縮洗滌液瓶(11)均采用玻璃瓶。
專利摘要本實用新型公開了一種乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，涉及化學發光免疫分析技術領域，解決目前乙型肝炎病毒核心抗體IgM超微量檢測的技術問題。本實用新型乙型肝炎病毒核心抗體IgM檢測試劑盒，包括盒體和盒蓋，盒體上方連接盒蓋，盒體的底部放置有2cm厚與盒的尺寸大小相同的海綿托，所述海綿托的左半部設有11個第一凹槽、中間區域設有4個第二凹槽、右半部設有2個第三凹槽，第一凹槽內分別裝有11個對照品瓶，第二凹槽內分別裝有磁性顆粒瓶、生物素化合物瓶和、記物瓶和濃縮樣本稀釋液瓶，第三凹槽分別裝有化學發光底物瓶和濃縮洗滌液瓶。本實用新型試劑盒主要用途為乙型肝炎病毒核心抗體IgM超微量檢測。
文檔編號G01N33/576GK202870097SQ20122036604
公開日2013年4月10日 申請日期2012年7月27日 優先權日2012年7月27日
發明者李勇, 胡慶鋒, 常立峻, 徐海偉, 陳秀發 申請人:蘇州長光華醫生物試劑有限公司