乙型肝炎病毒核酸(dna)快速定量檢測試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學技術領域，利用實時熒光定量PCR反應原理，采用微量核酸釋放劑提取、擴增HBV病毒基核酸(DNA)的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]實時熒光定量PCR (Real-time PCR)是在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離；實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。Real-time PCR可快速、靈敏的檢測病毒RNA和DNA以及細菌DNA ;該方法廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量，在動物病原體基因的檢測，畜禽產品的檢驗檢疫，生物制品的鑒定等領域。
[0003]實時熒光定量PCR技術，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法；熒光擴增曲線可分三個階段:熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期；在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據最終的PCR產物量也不能計算出起始DNA拷貝數；只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

【發明內容】

[0004]本發明是采用一種微量核酸釋放劑一步法操作完成血清、血漿中HBV-DNA的快速釋放，獲得的核酸適用于熒光定量PCR等下游檢測，具有操作簡便、使用安全、成本低廉的優點，適合在臨床基因檢測中推廣應用。
[0005]根據本發明的一個優選實施方案，試劑盒組分如下:核酸釋放劑、促釋放劑、酶混合液、HBV-PCR反應液、內標、陰性質控品、陽性質控品、定量參考品A?D ；HBV微量核酸釋放劑含有 5 ?500mM 的 KC1、0.5 ?20% Triton X-100、I ?100mg/ml 的蛋白酶 K、I ?20mM的NaOH ;促釋放劑含有pH值5?8的DMS0、終濃度0.5?10%的BSA ;酶混合液含有Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N糖基化酶；HBV_PCR反應液含有HBV保守區域引物探針、內標探針、MgCl2、脫氧核糖核苷酸。
[0006]HBV 上游引物序列:5Λ -AGAGTCTAGACTCGTGGTGGAC-3〃。
[0007]HBV 下游引物序列:5r-GAA AAA GTT RCA TGG TGC TGG TG-3,。
[0008]HBV熒光探針物序列及熒光素標記物:
FAM-S^-ACCAATTTA TGC CTA CAG CCT ART ACA AAG-3'BHQ-1。
[0009]內標上游引物序列:5、AATTGGTCAACATGTGAAAGC-3\
[0010]內標下游引物序列:5、GAATGTGGCCAAGGTTCCGTCATTTGG-3\
[0011]內標熒光探針物序列及熒光素標記物:
CY5—5' -AATCTTCTAATTACTGTATATGGAAG-3' BHQ-2。
[0012]在優選的情況下，微量核酸釋放劑配制方法為:在滅菌去離子水中加入KCl終濃度為5?500mM，終濃度0.5?20% Triton X-100、終濃度I?100mg/ml的蛋白酶K、終濃度I?20mM的NaOH ;促釋放劑:在滅菌去離子水中加入終濃度10%，pH值5?8的DMS0、終濃度0.5?10%的BSA ;質量或體積百分比以提取試劑體積為計算基準；配制的試劑長期保存需-20 °C凍存。
[0013]具體的，在一個優選的實施方案中，本發明所述方法包括如下步驟:
O取微量核酸釋放劑5 μ I加入等體積的血清或血漿樣本，用移液器吹打混勻10次；
2)每管加30μ I封閉劑，蓋好管蓋置于普通PCR儀中反應，具體參數如下:
第一步:95°C,10分鐘;第二步:4°C，2分鐘；
3)將經過裂解處理的PCR反應管從普通PCR儀中取出，小心打開管蓋，每管加入2.5 μ I促釋放劑并用移液器反復吹打混勻10次；
4)每管加入35μ I的PCR-mix，瞬時離心，置于熒光定量PCR儀擴增。
[0014]根據本發明的一個優選實施方案，本試劑盒的最低檢出限可達30IU/ml。
[0015]本發明的微量核酸釋放劑采用蛋白變性劑，能快速破壞HBV病毒顆粒外殼蛋白結構釋放HBV DNA,與傳統的熱裂解方式結合同步進行，更有效的保證樣本中核酸裂解效率，微量核酸釋放劑在完全釋放核酸的同時，還具有封閉樣本中對PCR擴增具有干擾作用的蛋白質、藥物及溶血等各種因素物質的功能，避免檢測過程的假陰性；且微量核酸釋放劑中含有抑制核酸酶的組分，對PCR后續實驗不會產生影響。
【附圖說明】
[0016]圖1為定量參考品A?D擴增曲線。
[0017]圖2為國家參盤靈敏度參考品LO?L5擴增曲線。
[0018]圖3為國家參盤靈敏度參考品L6擴增曲線。
【具體實施方式】
[0019]參照一下實施例可以對本發明作進一步詳細說明；但是，以下實施例僅僅是例證，本發明并不局限于這些實施例。
[0020]實施例1:用本發明方法對國家參盤靈敏度參考品LO?L6進行提取。
[0021]將試劑盒各組分恢復室溫，震蕩、瞬時離心；根據待測樣本的數量，按比例(HBV-PCR反應液33 μ I/人份+內標I μ I/人份+酶混合液I μ I/人份)取相應量的HBV- PCR反應液、內標及酶混合液，充分混勻成PCR- mix,瞬時離心后備用。
[0022]取國家參盤靈敏度參考品LO?L6備用。
[0023]準備相應數量200 μ I無核酸酶PCR反應管，每管加入5 μ I微量核酸釋放劑，加入國家參盤靈敏度參考品LO?L6不同濃度樣本各5 μ 1，用移液器反復吹打10次。
[0024]加入30 μ I封閉劑，蓋好管蓋置于普通PCR儀中裂解，具體參數如下:
第一步:95°C，10分鐘；第二步:4°C，2分鐘。
[0025]將經過裂解處理的PCR反應管從普通PCR儀中取出，小心打開管蓋，每管加入2.5 μ I促釋放劑并用移液器反復吹打混勻10次。
[0026]每管加入35 μ I的PCR-mix(33 μ I反應液、I μ I酶混合液、I μ I內標)，瞬時離心，置于熒光定量PCR儀擴增；
第一步:UNG酶反應，500C 2分鐘，I個循環；
第二步:預變性，95°C 5分鐘，I個循環；
第三步:包括變性、退火、延伸及熒光采集；變性，95°C 15秒，45個循環；
退火、延伸及熒光采集，60°C 45秒，45個循環；
第四步:儀器冷卻，25°C 10秒，I個循環。
[0027]結果分析條件設定
反應結束后，根據PCR儀說明書及熒光曲線進行手動或自動調整基線和閾值；手動調整時，基線(Baseline)的起始點(Start)設定在3?8之間，終止點(Stop)設定在12?15之間，閾值線(Threshold)通常設定在1000?5000之間(視具體情況而定)。
[0028]檢驗結果的解釋
1)若靶基因FAM通道沒有出現標準擴增曲線，同時內標HEX(VIC)通道出現標準擴增曲線，且16彡Ct彡35之間，判為HBV DNA檢測陰性；
2)對于測定值在300?2.5X109IU/ml之間的樣本，靶基因FAM通道出現標準擴增曲線，同時內標HEX (VIC)通道出現標準擴增曲線，且16彡Ct彡35之間，則報告相應的測定結果；
3)對于測定值>2.5X109IU/ml的樣本，靶基因FAM通道出現標準擴增曲線，同時內標HEX通道出現標準擴增曲線，且16彡Ct彡35之間，報告注明> 2.5X109IU/ml ;若需精確定量，可根據結果將樣本稀釋至2.5 X 109IU/ml以下再復測，并根據以下公式計算樣本濃度，結果注明可報告數值；
4)對于測定值在30?300IU/ml的樣本，靶基因FAM通道出現標準擴增曲線，同時內標HEX (VIC)通道出現標準擴增曲線，且16 < Ct < 35，表明病毒載量低，測定值僅供參考；
5)對于測定值<30IU/ml的樣本，內標HEX (VIC)通道出現標準擴增曲線，且16 ^ Ct ^ 35之間，則報告HBV-DNA含量低于試劑盒檢測下限，應結合其他臨床診斷指標進行判斷；
6)若內標HEX(VIC)通道Ct值> 35或無擴增曲線出現，則該樣本檢測結果無效，應查找并排除原因，并對此樣本進行重復檢測。
[0029]結果判斷
O從附圖1可以看出，定量參考品A~D均有標準擴增曲線；且標準曲線相關系數r彡0.980，內標有標準擴增曲線，且16 < Ct < 35 ;
2)從附圖2可以看出國家盤靈敏度參考品L0-L5各提取3次，均有標準擴增曲線，且內標有標準擴增曲線，且16 < Ct < 35 ;
3 )從附圖3可以看出最低檢出限L6 8次提取擴增均有擴增曲線，且內標有標準擴增曲線，且16 < Ct彡35。
[0030]實施例2:提供本試劑盒的臨床應用。
[0031]使用本發明的試劑盒在3家臨床試驗機構共完成了 520例血清、50例同一人份血漿樣本檢測，其中陽性414例，陰性106例，與已獲批的同類試劑盒參比，參比試劑檢測為陽性的樣本414例，陰性樣本106例；考核試劑對HBV核酸定性檢測的陽性符合率為100%，陰性符合率為100%，總符合率為100%，Kappa為I ;本發明提供一種乙型肝炎病毒核酸(DNA)定量檢測試劑盒(熒光PCR “一管法”)與對照試劑檢測結果一致性較好，為病人的診斷、治療提供臨床輔助證明；如樣本中檢測HBV病毒的存在，建議立即采取必要措施。
【主權項】
1.一種乙型肝炎病毒核酸(DNA)定量檢測試劑盒(熒光PCR"—管法”)，利用針對HBV核酸保守區設計的一對特異性引物、一條特異性熒光探針，配以PCR反應液，在熒光定量PCR儀上，應用實時熒光定量PCR檢測技術，通過熒光信號的變化實現乙型肝炎病毒DNA的定量檢測，具有操作簡便、使用安全、成本低廉的優點。2.該試劑盒含有核酸釋放劑、促釋放劑、封閉劑、酶混合液、HBV-PCR反應液、內標、陰性質控品、陽性質控品、定量參考品A?D ;核酸釋放劑含有KCl、Triton X-100、蛋白酶K、NaOH ;促釋放劑含有DMSO、BSA ;酶混合液含有Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N糖基化酶；HBV-PCR反應液含有HBV保守區域引物探針、內標探針、MgCl2、脫氧核糖核苷酸。3.該技術采用微量核酸釋放劑(MNRR)，可在一管中進行HBVDNA核酸提取與擴增，取5 μ I的微量核酸釋放劑加入等體積血清或血漿樣本，反復吹打混勻10次，置于PCR儀94°C裂解10分鐘，然后迅速降至4°C，小心打開管蓋加入2.5 μ I促釋放劑并混勻，加入35 μ IPCR反應液進行熒光定量檢測。4.采用中檢所HBV國家參考品中四個濃度梯度的原病毒血清標準品作為熒光定量PCR的標準品A?D，加陰陽性對照與待測樣本同步提取、擴增，實現從樣本提取到擴增全程監控。
【專利摘要】本發明公開了一種利用微量核酸釋放劑提取HBV病毒DNA的試劑盒以及使用方法，屬于分子生物學技術領域，利用實時熒光定量PCR反應原理，采用微量核酸釋放劑提取、擴增HBV病毒基核酸（DNA）的試劑盒及其使用方法；試劑盒提取方法包括以下步驟：裂解、促釋放、擴增；本試劑盒的優點在于采用微量核酸釋放劑提取擴增，簡便、靈敏、快速、準確，最低檢出限為30IU/ml；微量核酸釋放劑在完全釋放核酸的同時，還具有封閉樣本中對PCR擴增具有干擾作用的蛋白質、藥物及溶血等各種因素物質的功能，避免檢測過程的假陰性；在擴增的過程中加入了內標質控品，能有效的監控樣本的提取、擴增效率。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公開號】CN105063235
【申請號】CN201510452653
【發明人】郭冬冬, 遲磊, 呂翔, 張美娜, 楊海俠
【申請人】寶瑞源生物技術(北京)有限公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月28日