中進行的遺傳多樣性分析與樓桃屬植物分類常識基本吻合，是穩定存在的新標 記，可W直接將本發明所提供的9個標記應用于更多中國樓桃甚至轉移至歐洲甜樓桃上， 進行種質資源遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建和分子標記輔助育種中。 W44] 0)本發明的9個微衛星標記來自于中國樓桃種品種"短柄樓桃"的休眠花芽組 織，運為研究運些標記所可能具有的功能奠定了良好的基礎。
【附圖說明】 W45] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發 明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可W 根據運些附圖獲得其他的附圖。
[0046] 圖1為標記化4400、Unigenel3394、Unigenel3887在部分樓桃屬材料中的PCR擴 增產物電泳結果。其中Μ為化500DNAmarkeraaKaRa，大連），D為短柄樓桃、W為烏皮樓 桃、4為高盆樓桃、10為迎春樓、11為浙閩樓、28為諸暨地方品種、36煙臺2號、38為朱砂紅、 41為仙居地方品種1、42為仙居地方品種2、47為早紅寶石1號、49為朱紅1。
[0047] 圖2為ABI3130基因分型結果。圖2-a及圖2-b表示USSR特異性引物（即表 1中的引物序列）為前30個循環的反應引物進行PCR擴增，然后分別W反向引物和經過 5'-Hex或5' -Fam巧光標記的M13通用引物為后面8個循環的引物進行PCR擴增，擴增 結束后對PCR產物進行基因分型得到的峰型圖。顯示標記化4698(圖2-a)和化2632(圖 2-b)在臨海地方品種1和龍泉地方品種1兩種樓桃材料中的擴增結果，圖中縱坐標分別表 示化x(圖2-a)和Fam(圖2-b)的巧光值，橫坐標下面對應的"al"表示基因分型軟件自動 對片段大小讀取整數的數值，"SZ"數字表示PCR產物大小，"ar"表示PCR產物的巧光值的 峰面積。
[0048] 圖3為基于9個微衛星標記構建的22份樓桃屬植物化i曲bour-joining聚類圖。
【具體實施方式】
[0049] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0050] 本發明9個由中國樓桃"短柄樓桃"轉錄組開發的SSR標記是通過下述方法得到 的：
[0051] (1)利用本課題組前期開發的中國樓桃"短柄樓桃"休眠花芽的轉錄組序列 (Genbank登錄號：SRX695147)和MISA軟件尋找SSR位點，每條SSR序列產生5條引物。使 用軟件BatchPrimerS設計引物，引物篩選條件如下：引物長度18-28bp，Tm值55-65°C，預 期擴增產物長度80-300bp。隨機挑選并合成160條引物，使用"短柄樓桃"對160條引物進 行PCR擴增驗證，選取條帶清晰、大小吻合的引物用作后續分析。在設計好的正向引物的5' 端統一加18bp的通用序列（M13-TGTAAAACGACGGCCAGT)，另外合成5'端使用Fam和Hex兩 種巧光基團修飾的Ml3引物（序列為5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3')。引物委托上海英濰捷 基貿易有限公司合成；
[0052] 似使用改良CTAB(十六烷基Ξ乙基漠化錠，Hexade巧trimeth}^ ammonium bromide)法提取中國樓桃材料的基因組DM (即后續具體做法中的DM提取）；
[0053] (3)對所選SSR進行初步篩選：W短柄樓桃和烏皮樓桃2個中國樓桃材料基因組 DNA為模板進行PCR擴增：在20μΙ反應體系中分別加入TaKaRaPremix化q? 10μ^正向 引物0. 1μL反向引物0. 5μL巧光修飾的Μ13引物0. 4μLlongDM模板。使用Eppendo計 Masteixycler進行PCR擴增，具體步驟為：94°C預變性4min;94°C變性40s，54°C退火40s， 72°C延伸40s，30個循環后，改變循環條件為94°C變性40s，53°C退火40s，72°C延伸40s，進 行8個循環，最后72°C延伸6min。將5μΙPCR產物與ΙμΙeXLoadingbuffer混勻后在 含有0. 5μg/μL邸的1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，紫外燈下拍照記錄結果。
[0054] (4)根據瓊脂糖凝膠電泳所得條帶的多少、片段大小、產物濃度，選擇多態性豐 富的9個標記在22個不同基因型中國樓桃上進行擴增，取1μLPCR產物將約l(K)ng的 PCR產物與12μL變性劑和0. 25μL內參混勻，使用化pendorfMastercyclerPCR儀在 95°C下變性5min，取出立即放置冰上5min，然后放入ABI3130遺傳分析儀進行分析，使 用GeneMapperversion4.0統計數據，使用GenA化X6. 501進行遺傳多樣性分析，利用 Den化oscope3繪制聚類樹。 陽〇5引 實施例1，
[0056] 本發明中，用中國樓桃"短柄樓桃"轉錄組開發的SSR標記的具體做法是：
[0057] 一、DNA提取
[0058] (1)配制DNA提取液：2%CTAB，0. 1MTris，20mMEDTA，1. 4MNaCl，P冊.0;DNA溶 解緩沖液（即TE緩沖液）：10mMTris;lmM邸ΤΑ;PH=8. 0。
[0059] 似對中國樓桃材料進行如下處理： W60] ①在10血離屯、管中加入4血的DM提取液和80μLβ-琉基乙醇，放置在65°C水 浴中預熱lOmin;
[0061] ②取Ig的新鮮葉片，在研鉢放入少許PVP，加入液氮充分研磨；將研磨好的葉片轉 移至含提取液的離屯、管中，混勻后放入65°C水浴鍋中水浴30min，每隔lOmin搖勻一次，使 葉片細胞充分裂解；
[0062] ③水浴結束后，取出離屯、管冷卻至室溫；加入等體積（4mL)預冷的氯仿/異戊醇混 合溶液（V:V= 24:1)，充分混勻后使用離屯、機在10 00化pm下離屯、15min;
[0063] ④用移液器小屯、吸取上清液，轉移至新的10血離屯、管中，加入與上清液等體積的 異丙醇（4mL)和1/10體積的3M的醋酸鋼溶液（400μL，抑=5. 2)，輕輕顛倒混勻，靜置 10~15min至產生絮狀沉淀，然后使用離屯、機在10 00化pm下離屯、lOmin;
[0064] ⑥離屯、后棄上清液，將底部白色沉淀值ΝΑ)小屯、取出，轉入1. 5血離屯、管中，加入 700μL70 %的乙醇洗涂兩次。 陽0化]⑧離屯、后棄上清液，用移液器吸干剩余酒精，將白色沉淀物收集在側管壁上，盡可 能鋪平打薄，放入37Γ保溫箱中烘干；
[0066] ⑦加入500μΙΤΕ溶液將烘干后的DNA重新溶解，完全溶解后加入ΙμΙRNase，用 移液器輕輕吸打DM溶液，將其混勻后將離屯、管放入37°C保溫箱中保溫Ih;
[0067] ⑨取4μΙ DM在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測其完整性。 W側⑨吸取一部分DNA稀釋至10-3化g·μL/用于后續的PCR反應，剩余部分置 于-20°C保存。 W例二、微衛星分析：
[0070] 1、PCR擴增
[0071] (1)20μL反應體系包含：
[0072]TaKaRaPremix Taq? 10μ1^、正向引物 0. 1μL反向引物 0.5 μL巧光修飾的Μ13 引物0. 4μLlongDNA模板（通過上述DNA提取方法提取的中國樓桃材料的DNA)和雙蒸 水。 陽〇7引似反應程序：
[0074] 94°(：預變性4111111;94°(：變性4〇3,54°(：退火4〇3,72°(：延伸4〇3,30個循環后，改變 循環條件為94°C變性40s，53°C退火40s，72°C延伸40s，進行8個循環，最后72°C延伸6min。陽〇7引 2、電泳檢測：
[0076] 取上述擴增產物5 μ L加入1 μ L 6 X Loading buffer ;在含有0. 5 μ g/ μ L邸的 1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下拍照記錄結果。
[0077] 3、SSR基因分型和GeneMa卵er軟件統計：
[0078] 選取上述在不同中國樓桃材料中電泳條帶粗細、明暗、片段長度變化不一的標記 的PCR產物進行基因分型。
[0079] 具體方法為：將約lOOng的PCR產物與12μL變性劑和0. 25μL內參混勻，使用 Eppendo;rfMaster巧clerPCR儀在95°C下變性5min，取出立即放置冰上5min，然后放入 ABI3130遺傳分析儀進行分析，同時使用GeneMa卵