含gus報告基因的轉基因材料的pcr檢測引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學檢測技術，具體地說，涉及含⑶S報告基因的轉基因材料的 PCR檢測引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國的主要糧食作物。隨著人口增長 和社會的發展，可用于農產品生產的耕地越來越少，依靠傳統的育種技術已經很難滿足需 求，要想提高水稻產量、質量并解決全球糧食短缺問題，只有通過作物基因工程技術改良和 選育出高產作物品種。植物轉基因工程技術，是根據育種目標將人工分離和修飾過的優良 目的基因，通過遺傳轉化導入受體植物基因組中，使外源基因在受體植物中表達，從而快 速、直接獲得可遺傳的優良性狀的品種。在當今農業生產中，與常規育種相比，轉基因技術 具有不可比擬的優勢：1、拓寬可利用的基因資源，創造新種質資源;2、可對植物性狀進行定 向定點變異和選擇;3、為培育高產、優質、高抗優良品種提供新途徑(李文鳳，季靜(2010)提 高轉基因植物標記基因安全性策略的研究進展.中國農業科學09:1761-70)。
[0003] 盡管轉基因技術有著諸多的優點，然而在我國，大多數轉基因產品仍不能直接商 業化，需要接受嚴格的監管。因此就需要對產品進行檢測。隨著轉基因技術的發展，外源基 因的檢測方法也隨之增多，大致分為基于轉基因植物的核酸水平檢測和蛋白水平檢測兩類 手段（Querci M，Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6) :1991-2002)。其中蛋白水平的檢測實驗過程復雜，耗時較長，不利于 轉基因成分快速高效的檢測。雖然近年開發的轉基因試紙條是較為快速的蛋白水平檢測方 法，但僅能檢測有限數目的蛋白如Bt蛋白，EPSPS蛋白等。基于核酸水平的檢測由于其具有 檢測方便、體系成熟、可檢測范圍廣及通量高等特點，因此使用較為廣泛（Elenis D， Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3): 347-54)。基于核酸水平的檢測方法按具體應用又可以分為以下幾種：1、傳統定性PCR檢測 技術;2、熒光定量PCR檢測技術;3、多重PCR檢測技術;4、核酸雜交技術檢測，包括Southern 雜交和斑點雜交;5、基因芯片檢測技術等。其中傳統定性PCR檢測根據轉基因作物轉化時慣 用的啟動子如花椰菜花葉病毒啟動子(CAMV 35S啟動子）、胭脂堿合成酶終止子(N0S終止 子）、選擇標記新霉素轉移酶基因 （NPTII )、外源啟動子或終止子與作物基因組的交聯結構 基因以及報告基因如β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，⑶S)基因等設計特異性引物，用 體外擴增的方法定性檢測轉基因樣品。該方法操作簡便，耗時短，可以建立針對某種作物的 標準化檢測體系（Xu CJ,Yang L(2005)Development of a rapid,reliable and simple multiplex PCR assay for early detection of transgenic plant materials.Acta Physiol Plant 27(3) :283-8),是轉基因作物中最簡便、成熟的外源基因檢測方法。
[0004] 提取待檢測樣品的基因組DNA模板是進行PCR檢測的前導步驟，因此，獲得較高質 量的基因組DNA是保證PCR檢測的準確性和可靠性重要前提。通常需要對基因組DNA進行吸 光值檢測其濃度與純度或者瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性與降解程度。內參基因標記即是 內部參照，可以作為檢測DNA濃度與純度的參照物，指示實驗結果的準確性。如果設計的一 對引物既能檢測轉基因植株又能作為確定模板基因組來源及質量的內參基因標記，可大大 節約時間和操作成本，提尚轉基因樣品的檢測效率。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一對用于檢測含GUS報告基因的轉基因材料的PCR引物，所述 引物不僅能檢測到外源報告基因，而且能根據電泳結果中是否含有內參基因，進一步確定 模板基因組DNA是否來源于稻屬及其基因組DNA的質量。
[0006] 本發明的另一目的是提供基于上述引物建立的含GUS報告基因的轉基因材料的 PCR檢測方法。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明提供含GUS報告基因的轉基因材料的PCR檢測引物， 其包括：
[0008] 正向引物：5'-TCAGTGGCAGTGAAGGG-3'（SEQ ID N0:1)
[0009] 反向引物：5'-GAGCGTCGCAGAACATTA-3'（SEQ ID N0:2)
[0010] 該對引物是以⑶S基因序列為依據設計，利用SEQ ID N0:1及SEQ ID N0:2進行PCR 擴增，除了可以獲得部分GUS基因序列（擴增產物大小為538bp);還可用于擴增轉基因水稻 樣品中的內參基因（擴增產物大小為1491bp)，作為檢測樣品是否為水稻的依據，同時可指 示基因組DNA的質量。且該對引物沒有品種特異性，在秈稻、粳稻(例如水稻品種中花11、日 本晴、冬瑾、93-11、MH63等）中均適用。所述含⑶S報告基因的轉基因材料是攜帶⑶S報告基 因 （SEQ ID N0:3)的載體，如植物雙元表達載體DX2182;通過遺傳轉化獲得的含此GUS報告 基因的愈傷組織、幼苗、種子等。
[0011]本發明還提供含有上述引物的用于檢測含⑶S報告基因的轉基因材料的試劑盒。 [0012]所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液、標準陽性模板等 中的至少一種。
[0013] 本發明還提供所述試劑盒在檢測含GUS報告基因的轉基因材料中的應用。所述轉 基因材料包括轉基因水稻、玉米、小麥、大豆、棉花等轉基因作物。
[0014] 本發明還提供含⑶S報告基因的轉基因材料的PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0015] 1)提取待測樣品中的DNA;
[0016] 2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增反應；
[0017] 3)分析PCR產物。
[0018] PCR反應體系以 20μ1計為：10 X PCR反應緩沖液(Mg2+Plus) 2μ1; dNTPs (各2.5mM) 1μ 1;10μΜ正向引物 1μ1;10μΜ反向引物0·5μ1;模板DNA 2μ1;?υ/μ1 Taq DNA聚合酶0·5μ1; ddH20 補足至 20μ1。
[0019] PCR反應程序為:95°C5分鐘；94°C30-45秒，55°C30-45秒，72°C 1.5分鐘，共30-35個 循環;72°C10分鐘。
[0020] 利用上述方法可以快速檢測和鑒定轉基因樣品是否攜帶GUS報告基因及遺傳背景 是否為稻屬。
[0021] 步驟3)中對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如果只擴增出一條538bp(SEQ ID N0: 3)大小的條帶，則表明該樣品為含GUS報告基因的轉基因材料，但遺傳背景并非水稻;如果 同時擴增出538bp和149 lbp大小的兩條條帶，則表明待測樣品為含GUS報告基因的轉基因水 稻;如果只擴增出一條1491bp(SEQ ID N0:4)大小的條帶，則表明該樣品為非轉基因水稻。 [0022]本發明進一步提供一種水稻基因組檢測內參基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4 所示。
[0023] 用于擴增上述內參基因的特異性PCR引物，其包括：
[0024] 正向引物：5 ' -TCAGTGGCAGTGAAGGG-3 ' 和
[0025] 反向引物：5 ' -GAGCGTCGCAGAACATTA-3 '。
[0026] 本發明利用普通PCR方法即可檢測轉基因材料中外源GUS報告基因是否插入植物 基因組，同時利用本發明提供的引物可以擴增水稻基因組特有序列，直接對水稻基因組進 行標記，即PCR產物電泳時以此序列作為內參基因，可以直觀的分辨出基因組模板DNA是否 為水稻以及判斷模板DNA的質量，消除了普通PCR擴增時模板DNA質量的不確定性。因此，本 發明提供的PCR檢測引物及檢測方法，既可用于檢測含GUS報告基因的轉基因樣品，又可用 于確定模板基因組DNA是否來源于稻屬及其基因組DNA的質量。該方法簡單、快捷，成本低， 實驗結果直觀清晰。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明實施例2中含GUS報告基因的轉基因植株的PCR檢測結果;其中，左側 第一泳道-:H20(陰性對照）；左側第二泳道-:ZH11;左側第三泳道+: DX2182載體；1-12 : DX2182的不同轉基因株系;Ref:內參基因擴增片段;GUS:GUS基因擴增片段。
[0028] 圖2為本發明實施例3中不同水稻品種中內參基因的PCR檢測結果；其中，Μ : 2000marker; 1: Η20; 2 : ΖΗ11; 3 :日本晴；4: Dong jin; 5 :93-11; 6 :ΜΗ63 ; 7 : Η20; 8 : ΖΗ11; 9 : DX2182〇
[0029] 圖3為本發明實施例4中引物靈敏度檢測結果;其中，M:2000marker;l-8:轉基因水 稻材料DNA濃度稀釋倍數依次為ΙΟΜΟΛ
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊