專利名稱：：前列腺癌的生物標記的制作方法
技術領域：
：本發明提供對于檢測前列腺癌來說是重要的生物標記。此生物標記的識別是通過使用SELDI分析區別前列腺癌患者與健康個體的血清蛋白圖譜。本發明提供與生物標記相關的系統和方法，其中，生物標記用于鑒別前列腺癌的狀態。本發明也確認所述生物標記為公知的蛋白C抑制劑(ProteinCInhibitor,簡稱PCI)。
背景技術：
：前列腺癌是男性最常見的癌癥類型。在2002年，預計在男性中將有189，000件的新癌癥病例，并有30，200例將死于此疾病。早期檢測出被限定在前列腺的前列腺癌，并通過前列腺癌根治術(手術)具有最佳的治愈可能。盡管PSA被認為是一種有效的腫瘤標記，并實際上具器官特異性，但是并不具癌癥特異性。PSA濃度在患有前列腺癌與患有良性前列腺疾病的男性中有相當大的重疊。PSA不能從患有非器官限定的前列腺癌男性(不會受益于手術)中區分出患有器官限定的前列腺癌男性(會受益于手術)。因此，PSA對于選擇適合前列腺根治術的病人并不具有功效。當前，前列腺癌的早期檢測和診斷是依靠直腸指檢(digitalrectalexamination，簡稱DRE)、前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen,簡稱PSA)測量、經直腸超聲術(transrectalultrasonography,簡稱TRUS)和經直腸針刺活檢(transrectalneedlebi叩sy，簡稱TRNB)。目前，血清PSA測量與DRE的組合為檢測和診斷前列腺癌的主要方法。商業上可得到的PSA分析通常以試劑盒出售，此分析在區域性或地方性的實驗室中進行。然而，前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(prostaticacidphosphatase,簡稱PAP)具有局限的治療和診斷可能性。舉例來說，PSA的水平與前列腺癌的存在經常沒有很好的關聯，在部分包括良性前歹關泉增生癥(benignprostatichyperplasia,簡稱BPH)的非前列腺癌病例呈陽性反應。此外，PSA的測量與前列腺的體積相關，并且無法指明轉移的水平。這些試劑盒在現行早期檢測前列腺癌的方案上扮演部分角色。然而，當陰性直腸指檢(DRE)遇到適度地非正常PSA值(4-10ng/ml)時將產生問題。僅有20-30%具有這些發現的個體在活檢中證明為癌癥(Kantoff禾口Talcott，8(3)Hematol.Oncol.ClinicsNAmer555(1994))。因此，發展提高PSA測試陽性預測值的方案是重要的。這樣的方案包括建立經年齡調整的正常范圍、確定游離與全部PSA的比例、修正前列mmt^噴h-^a計算PSA值變化的速率(Kantoff和Talcott，8(3)Hematol.Oncol.ClinicsNAmer555(1994)以及Brawer，45CA-ACancerJClinicians148(1995))。盡管每種方案均有一定作用，關于如何處理PSA陽性和DRE陰性的病人仍存在相當大的不確定性。另外，PSA并不是一種疾病特異性標記，因為在大部分患有BPH和前列腺炎的病人中可檢測到提高的PSA水平(25-86%)(Gaoetal.，1997，Prostate31:264-281)，并且在其它非惡性疾病和一些正常男性中，它是顯著局限標記的診斷特異性的因素。舉例來說，在BPH中可觀察到血清PSA提升為4到10ng/ml，甚至在前列腺炎中可觀察到更高的數值，尤其是急性前列腺炎。BPH是男性中極為常見的疾病。進一步混淆此情況的事實為血清PSA的提升可在沒有任何指明為DRE疾病下被檢測，反之亦然。另外，目前PSA已被認為不具前列腺特異性(Gaoetal.如前，重新檢閱)。對于晚期前列腺癌的處理更可靠和有益的階段發展以及預防方法也是需要的。臨床確定前列腺腫瘤的階段是依靠直腸檢查，確定腫瘤是否在前列腺囊的區域內(局部限定)或超出其區域(局部晚期)，并且搭配血清PSA測定和經直腸超聲引導活檢。然而，這些技術中沒有一7種在預測疾病的進程上被證明為可靠的。因此，有需要可特異性識別前列腺癌、可從良性增生癥中區分出前列腺癌、可在即使低PSA水平下識別前列腺癌，以及識別疾病進程的階段的方法。
發明內容本發明通過測量特異性的生物標記提供用于確定前列腺癌狀態的敏感且快速的方法和試劑盒。在病人樣本中測量標記，提供診斷者可能的人類癌癥診斷或陰性診斷(例如正常或非疾病)相關聯的信息。標記的特征在于它的分子量和已知的蛋白質特性，蛋白C抑制劑("PCI")。通過使用多種分離技術可將標記從樣本的其它蛋白質中分辨出，例如通過層析分離搭配質譜分析、利用固定抗體的蛋白質捕捉或是通過傳統的免疫分析。在優選的具體實施例中，分離的方法包含表面增強激光角軍吸/離子化(Surface—EnhancedLaserDesorption/Ionization，簡稱"SELDI")質譜分析，其中，質譜分析探針的表面包括結合標記的吸附劑。本發明提供鑒別受測對象前列腺癌狀態的方法，其包括(a)測量來自受測對象樣本的PCI生物標記，以及(b)將測量與前列腺癌的狀態相關聯化，特別是經由Gleason評分。在特定的方法中，測量的步驟包括檢測樣本中生物標記的存在或不存在。在其它方法中，測量的步驟包括量化樣本中標記的含量。在其它的方法中，測定的步驟包括鑒別樣本中生物標記的類型。在特定的具體實施例中，本發明可在血清PSA水平提高的男性中確定患有前列腺癌的病人和患有良性前列腺疾病的病人的區別。絕大多數此類病患的血清游離和總PSA的比例范圍為10-20%(或復合物和總PSA比例的相當范圍)，此為診斷的灰色區域。所揭示的生物標記具有在此范圍內增進癌癥檢測的可能性。本發明也有關于方法，其中測量的步驟包括提供受測對象的血液或尿液或血液/尿液衍生物的樣本；利用陰離子交換樹脂分離樣本中的蛋白質，收集含有PCI的餾分，PCI則收集自包含結合此蛋白質生物標記的捕捉劑的基材表面。血液的衍生物如血清或血漿。在優選的具體實施例中，基材是包括IMAC銅表面的SELDI探針，并且其中蛋白質標記通過SELDI檢測。在其它的具體實施例中，基材為包括結合PCI的生物特異親和性試劑的SELDI探針，并且其中蛋白質生物標記通過SELDI檢測。在其它的具體實施例中，基材是包括結合PCI的生物特異親和性試劑的微孔板，并且蛋白質生物標記通過免疫分析檢測。在特定的具體實施例中，此方法進一步包括基于通過此方法所確定的狀態來處理受測對象的治療。舉例來說，若本發明方法的結果為不確定的或有必要進行狀態的確認，醫生可安排更多的測試。或者，若狀態指明手術是合適的，醫生可為病患進行手術的排期。同樣地，若測試的結果為陽性，例如狀態為晚期前列腺癌或狀態為急性，則沒有進一步的行動可被保證。此外，若結果顯示治療成功，則無進一步處理的必要。本發明也提供在處理受測對象后再次測定PCI生物標記的方法。在這些實例中，處理治療受測對象的方法依據所獲得的結果隨后重復或變更。在優選的具體實施例中，PCI在治療后單獨或與C4a組合測定，以確定復發的可能性。"前列腺癌狀態"一詞是指病人疾病的狀態。前列腺癌狀態的類型實例，包括但不局限于，受測對象罹癌的風險、疾病的存在或不存在、病人疾病的階段，以及疾病治療的效果。其它狀態與每一狀態的程度為本領域所已知。在特定的優選具體實施例中，此方法進一步包括測量來自受測對象的樣本中至少一種先前已知的標記(這里以"標記X"表示)，并將至少一種標記X和PCI的測量與前列腺癌的狀態進行關聯化。在特定的具體實施例中，除PCI標記外，僅有一種標記X被測量，而在其它的具體實施例中，則一種以上的標記X被測定。公知的標記X實例包含前列腺癌的生物標記，包括但不局限于C4a、AP0C1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、C0L1A1、C0L6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGFIO、FGFll、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、G醒l、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、1112A、IllA、IllB、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLKIO、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、畫4、0DZ1、PAP、P副、PRL、PSAP、SERP皿3、SHBG、TGFA、T頂P3、VEGF和標記的蛋白質變形(例如斷裂形式、異構體)。本發明的PCI標記以多種態樣的一種或一種以上為特征。特別地在一種態樣中，標記以在本文明確指示條件下的分子量為特征，特別是指經質譜分析確定。在另一種態樣中，此標記以標記質譜特性的特色為特征，例如標記譜峰的尺寸(包括面積)和/或形狀，其特色則包含相鄰峰的鄰近度、尺寸和形狀等。在又另一個態樣中，標記以親和性的結合特性為特征，尤其是于特定的情況下結合至IMAC銅吸附劑的能力，然而，其它如鎳的金屬也可使用。在優選的具體實施例中，本發明的標記可以這些態樣中的每一個為特征，也就是分子量、質譜特性和與頂AC-Cu吸收劑的結合。就本文所揭示的標記質量值來說，光譜儀的質量精確度被認為是所揭示分子量值的約正負O.15百分比內。另外，這些被認知為儀器的精確度變化，所確定的質譜可于約400至1000m/dm的分辨率限制范圍內變化，其中m為質量，dm為0.5峰高處的質譜峰寬。與質譜儀及其操作相關的這些質量精確度與分辨率變化會使用「約」字在揭示標記質量時。這些質量精確度與分辨率變化是可預期的，因此與本文所揭示標記的「約」字相關的意義包括由于受測對象的性別、基因型和/或種族，以及特定癌癥或起源或其階段而存在的標記變形。本發明進一步提供一種鑒別受測對象前列腺癌狀態的方法，包括(a)測定來自受測對象樣本的PCI生物標記，以及(b)將此測定與前列腺的狀態相關聯化。在特定的方法中，測定的步驟包括檢測樣本中標記存在或不存在。在其它的方法中，測定的步驟包括量化樣本中標記的含量。診斷測試的精確度以接收者操作特征曲線(ReceiverOperatingCharacteristiccurve,簡稱ROC曲線)為特征。ROC是診斷測試中不同可能性切點的真陽性率相對假陽性率的圖式。ROC曲線顯示敏感度與特異性間的關系，也就是，敏感度的增加將伴隨特異性的減少。曲線沿著左軸且隨后與ROC空間頂部邊緣越接近，測試越精確。相反地，曲線越靠近R0C圖45度對角線，測試則越不精確。ROC下的區域為測試精確度的方法。測試的精確度取決于測試能將待測群區分為患有及未患有所考慮疾病的程度。曲線下的區域(也就是areaunderthecurve,簡稱AUC)為1時表示為理想的測試，而區域為0.5則表示為較無用的測試。因此，本發明的生物標記與診斷方法具有大于0.5的AUC，優選的測試具有大于0.6的AUC，更優選的測試具有大于0.7的AUC。測定PCI生物標記的優選方法包含使用生物芯片數組。適用于本發明的生物芯片數組包含蛋白質與核酸數組。一種或多種標記被捕捉于生物芯片數組上，并且通過激光離子化檢測標記的分子量。標記的分析是通過如標記分子量相對于根據總離子電流標準化的闊值強度。優選地，使用對數轉換來降低峰強度范圍，從而限制被檢測標記的數在本發明優選的方法中，將PCI生物標記的測定與前列腺癌狀況相關聯化的步驟是通過軟件分類算法完成。優選地，從生物芯片數組上固定的受測對象樣本所產生的數據是將所述生物芯片數組通過激光離子化，并檢測質/荷比率的信號強度；以及將數據轉換成計算機可讀取的形式；然后，根據使用者輸入參數執行用以分類數據的算法，作為檢測表明標記存在于前列腺癌病患中卻于無癌癥的受測對象控制組內不存在的信號。優選的生物芯片表面例如離子性、陰離子性、由固定的鎳離子所組成、由陰、陽離子的混合物所組成、由一種或多種抗體所組成、單鏈或雙鏈核酸、蛋白質、肽或其片段、氨基酸探針、或噬菌體展示庫(phagedisplaylibraries)所組成。在其它優選的方法中，一種或多種標記是使用激光解吸/離子化質譜分析測定，包括提供適用于含有吸附劑附著的質譜儀探針，以及使受測對象樣本與吸附劑接觸；然后，從探針上解吸與離子化標記，并用質譜儀檢測經解吸/離子化的標記。優選地，激光解吸/離子化質譜分析提供包括吸附劑附著其上的基質；將受測對象樣本與吸附劑接觸；將基質放置于適用于含有吸附劑附著的質譜儀探針上，以及從探針上解吸和離子化標記，并用質譜儀檢測經解吸/離子化的標記。吸附劑可例如為疏水性、親水性、離子性或金屬螯合吸附劑，例如鎳或抗體、單或雙鏈寡核苷酸、氨基酸、蛋白質、肽或其片段。本發明的方法可在經得起所述方法試驗的任何類型的病患樣本中進行，如血液、血清和血漿。本發明也提供試劑盒，包括(a)—種結合PCI生物標記的捕捉劑；以及(b)包括生物標記的容器。在優選的具體實施例中，捕捉劑結合生物標記。捕捉劑可為任何類型的試劑，優選的試劑為SELDI探針。捕捉劑也可結合其它公知的生物標記，如標記X。在特定的優選具體實施例中，所述試劑盒進一歩包括可與第一捕捉劑未結合的生物標記結合的第二捕捉劑。在本發明特定的試劑盒中，捕捉劑包括固定的金屬螯合物("皿C，，)。本發明的特定試劑盒進一歩包括清洗溶液，在洗滌后相對于其它生物標記可選擇性地保留結合到捕捉劑的生物標記。本發明也提供試劑盒，包括(a)結合PCI生物標記的第一捕捉劑，及(b)使用捕捉劑測定生物標記的指導說明。在這些特定的試劑盒中，捕捉劑包括抗體。另外，一些試劑盒進一步包括捕捉劑附著或可附著的MS探針。在一些試劑盒中，捕捉劑包括IMAC。試劑盒也可包含清洗溶液，在洗滌后相對于其它生物標記可選擇性地保留結合捕捉劑的生物標記。優選地，所述試劑盒包括使用試劑盒確定前列腺癌狀態的書面指導說明，以及提供將捕捉劑與測試樣本接觸和測定一種或多種由捕捉劑保留的生物標記的指導說明。所述試劑盒也提供為抗體、單或雙鏈寡核苷酸、氨基酸、蛋白質、肽或其片段的捕捉劑。使用所述試劑盒測定蛋白質生物標記，是通過質譜分析或如ELISA的免疫分析。本發明也提供用于檢測前列腺癌和/或用于為進一步診斷檢測分析而產生抗體的純化蛋白質。純化的蛋白質包含純化的PCI肽。本發明也提供進一步包括可檢測巻標的純化蛋白質。在另一個具體實施例中，非侵入性的醫療成像技術，如經陰道超聲、正電子方夂身寸斷層掃描(positronemissiontomography,簡稱PET)或單光子發身寸計算機斷層掃描(singlephotonemissioncomputerizedtomography,簡稱SPECT)成像于檢測癌癥、冠心病和腦疾病尤為有效。多普勒血流超聲、PET和SPECT成像顯示器官與組織的化學功能，而其它如X射線、CT和MRI的成像技術主要則顯示結構。血流超聲、PET和SPECT成像的使用對于鑒別與監控如前列腺癌的疾病發展變得日益有用。本文所述的PCI生物標記或其片段可用于前文所述PET與SPECT成像的應用。在以合適的追蹤剩余物修飾PET或SPECT的應用后，與腫瘤蛋白質反應的PCI生物標記可用于在前列腺癌病患體內成像生物標記的沉積。本發明的其它態樣將于下文中描述。圖1顯示PCI生物標記的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖2顯示商業血清PCI生物標記的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖3顯示使用Q餾分6的RPC分餾的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖4顯示使用RPC40。/。餾分、YM30過濾和NP20數組的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖5顯示使用Q分餾的商業血清和CM10數組的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖6顯示Q流出液的RPC分餾和CM10數組的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖7顯示使用重復的Q-FT的RPC分餾、RPC-40。/。的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖8顯示用于3890Da蛋白質Q-TOF光譜的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖9顯示具有3889m/z的離子的MS/MS光譜的代表性質譜圖譜。在這些圖式中，特定標記的質譜峰在描述的光譜中以分子量標明。圖io是蛋白質探測者搜索輸入的代表性實例。圖11是數據庫搜索結果的代表性實例。圖12是MS/MS數據的代表性解釋。圖13是PCI氨基酸序列的圖式。圖14是PCI的理論分子量的圖式。圖15是使用全血清和山羊抗PCI抗體的以珠為基礎的免疫分析結果的圖式。圖16顯示用于發現和確認的多中心樣本組(MulticenterSampleSetsforDiscoveryandValidation)所得至lj的數據。圖17是通過相關網絡分析發現的圖式。圖18是與Gleason評分相關聯化的數據以及從良性前列腺疾病分離前列腺癌的圖式。圖19是與前列腺癌復發相關聯化數據的圖式。圖20是復發研究數據組PCI獨立確認的圖式。圖21是使用部分復發樣本作為訓練組的Pre-RRPPSA、PCI和C4a的組合的圖式。圖22是使用部分復發樣本作為訓練組的測試組的Pre-RRPPSA、PCI和C4a的組合的圖式。圖23是表示PCI峰的ROC分析的圖式，將Gleason評分5_7的前列腺癌病人與Gleason評分為8或更高的病人予以區分。圖24是表示PCI峰的ROC分析的圖式，將患有良性前列腺疾病的病人與前列腺癌病人予以區分。具體實施方式1.引言生物標記是一種有機分子，其差異性地存在于具有一種表現狀態(例如患有疾病)和另一種表現狀態(例如未患有疾病)的受測對象樣本中。當于不同的組群中，一種生物標記的平均或中值表達水平的計算具有統計上顯著的意義時，此生物標記是差異性地存在于不同的表現狀態間。于其它的測試中，計算統計上具顯著意義的通常測試包括T-測定(t-test)、A麗A、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney14及比數比。單獨或組合的生物標記提供對受測對象屬于一種或其它表現狀態相對風險的測定。因此，生物標記對于疾病(診斷)、藥物的治療效果(治療診斷學)及藥物毒性皆為有用的標記。定義除非另行定義，于本發明所用的所有技術和科學術語通常可被
技術領域：
的人員所理解。以下參考文獻提供技術人員用于本發明許多術語的一般定義Singletonetal.，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2ntled.1994);TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.，1988);TheGlossaryofGenetics,5thEd.，R.Riegeretal.(eds.)，SpringerVerlag(1991);以及Hale&Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。除非另行指明，于此所用的以下術語具有其所屬的含意，。于此所使用的"前列腺疾病"或"前列腺狀態"是指任何前列腺疾病或狀態，包括但不局限于，良性前列腺增生癥(BPH)、前列腺炎、前歹Ll月泉上皮內瘤(prostaticintra印ithelialneoplasia,簡稱PIN)禾口癌癥。于此所使用的"前列腺癌"是指任何前列腺惡性疾病，包括但不局限于，腺癌、小細胞未分化癌和粘液腺(膠質)癌。于此所使用的"轉移性前列腺癌"和"轉移性疾病"是指前列腺癌擴散至局部的淋巴結或至更遠的位置，并包含在AUA系統下的D階段疾病和在T麗系統下的TxNxM+階段。如同局部的晚期前列腺癌情況，手術通常不用于具有轉移性疾病的病人，而激素(雄激素阻斷)治療是優選的治療形式。在治療初始的12-18個月內，患有轉移性前列腺癌的病人最終發展為雄激素非依賴性階段(addrogen-refractorystate),并且約一半的此類病人在此后的6個月內死亡。最常見的前列腺癌轉移位置是骨。總而言之，前列腺癌骨轉移典型地為成骨性而非溶骨性(也就是導致網狀骨的形成)。骨轉移最常發生于脊椎，之后為大腿骨、骨盆、胸肋、頭骨和肱骨。其它常見的轉移位置包括淋巴結、肺、肝和腦。轉移性前列腺癌典型地通過開放或腹腔鏡骨盆淋巴結切除術、全身放射性核素掃描、骨胳放射線照相術和/或骨損傷活檢。于此所使用的"局部晚期前列腺癌"和"局部晚期疾病"是指前列腺癌延伸通過前列腺囊，并且包含在美國泌尿協會(AmericanUrologicalAssociation,簡稱AUA)系統下的C階段疾病、在Whitmore-Jewett系統下的Cl-C2階段疾病，以及在T麗(腫瘤、瘤、轉移瘤)系統下的T3-T4和N+疾病。通常，患有局部晚期疾病的病人并不建議進行手術，并且相較于患有臨床局部(器官限定)的前列腺癌病人，這些病人實質上得到較少有利的結果。局部晚期疾病通過前列腺側部邊緣外明顯的硬化跡象或前列腺主要部分上的不對稱或硬化在臨床上識別。在前列腺根治術后，病理性地診斷局部晚期前列腺癌，是否腫瘤侵入或滲透前列腺囊、擴散至手術邊緣或侵入精囊。于此所使用的"腫瘤階段"或"腫瘤進程"是指腫瘤的不同臨床階段。腫瘤的臨床階段通過在醫學界已完善建立的不同參數定義。一些參數包含形態學、腫瘤大小、通過病人身體的轉移程度及其相似者。"Gleason分級系統"是定前列腺癌等級的系統。Gleason分級系統是在組織樣本中兩個最大癌癥區域的每一個指定級別。級別的范圍從1至5，l為最無侵犯性，而5為最具侵犯性。舉例來說，3級的腫瘤很少轉移，但轉移則通常為4級或5級。兩個等級隨后相加以產生Gleason評分。2-4的評分為低級；5_7為中級，以及8-10為高級。具有低Gleason評分的腫瘤通常生長緩慢，在病人的一生當中并不造成重大的威脅。"蛋白C抑制劑"(PCI)是血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制數種包含抗凝血酶、活化蛋白C(APC)以及凝血酶和Xa因子的凝血酵素的蛋白酶，并且在精液中存在有高濃度。"C4a"是在Cls分裂C4為C4a和C4b時所形成的較小片段。如同過敏毒素，C4a造成立即的過敏性癥狀，但其活性較C3a或C5a為弱。"氣相離子譜儀"是指檢測氣相離子的裝置。氣相離子譜儀包括提供氣相離子的離子源。舉例來說，氣相離子譜儀包括質譜儀、離子遷移譜儀和總離子電流測量裝置。"氣相離子譜分析"是指使用氣相離子譜儀檢測氣相離子。"質譜儀"是指可將測量的參數轉換為氣相離子的質荷比的氣相離子譜儀。質譜儀一般包括離子源和質量分析儀。質譜儀的實例是飛行時間式、扇形磁場式、四極濾質器式、離子阱式、離子回旋共振式、扇形靜電分析式及這些的混合。"質譜分析"是指使用質譜儀檢測氣相離子。"激光解吸質譜儀"是指使用激光能作為解吸、揮發和離子化分析物的質譜儀。"串聯質譜儀"是指任何能夠進行兩個連續階段基于m/z的區分或離子的測量的質譜儀，包括離子混合物中的離子。此用語包括具有兩個質量分析儀的質譜儀，其能夠進行兩個連續階段基于m/z的區分或空間串聯的離子測量。此用語進一步包括具有單一質量分析儀的質譜儀，其能夠進行兩個連續階段基于m/z的區分或時間串聯的離子測量。此用語因此明確地包括Qq-T0F質譜儀、離子阱質譜儀、離子阱-T0F質譜儀、T0F-T0F質譜儀、傅立葉轉換離子回旋共振質譜儀、扇形靜電-扇形磁場質譜儀和其組合。"質量分析儀"是指質譜儀的組件，包括測量可轉換為氣相離子質荷比的參數的工具。在飛行時間質譜儀中，質量分析儀包括光離子組件、飛行管和離子檢測儀。"離子源"是指提供氣相離子的氣相離子譜儀組件。在一個具體實施例中，離子源提供通過解吸/離子化過程的離子。所述的具體實施例一般包括探針接口，其以可詢問的關系將探針定位于離子化能量源(例如激光解吸/離子化源)，并且在大氣壓或次大氣壓下與氣相離子譜儀的檢測器協同傳遞。用于解吸/離子化固相分析物的離子化能形式，舉例來說包括(1)激光能；(2)快速原子(用于快速原子轟擊)；(3)通過放射性核素P衰變產生的高能粒子(用于等離子體解吸)；以及(4)初級離子產生二級離子(用于二級離子質譜分析)。優選用于固相分析物的離子化能形式是激光(用于激光解吸/離子化)，特別地為氮激光、Nd-Yag激光和其它脈沖激光源。"注量"是指詢問圖像每單位面積傳送的能量，如激光的高注量源傳送約lmj/皿2至50mj/mm2。通常，樣本放置于探針表面，探針與探針接口接合，并且探針表面被擊以離子化能。能量將來自表面的分析物分子解吸形成氣相，并將其離子化。用于分析物的其它形式離子化能包括，例如(l)離子化氣相中性粒子的電子；(2)強電場以誘導來自氣相、固相或液相中性粒子的離子化；以及(3)應用具有離子化顆粒或中性化合物電場組合的來源，以誘導固相、氣相和液相中性粒子的化學離子化。"固相載體"是指可被捕捉劑誘導或附著于捕捉劑的固態物質。代表性的固相載體包括探針、微孔板和層析樹脂。本
發明內容的"探針"是指適用于接合氣相離子譜儀(例如質譜儀)的探針接口，并且引起分析物離子化能以進行離子化，以及引入如質譜儀的氣相離子譜儀的裝置。"探針"一般包括固體基質(彈性或堅硬)，表現分析物呈現給離子化能量源的表面的樣本。"表面增強激光解吸/離子化"或"SELDI"是指如質譜儀解析/離子化氣相離子譜儀的方法，其中分析物被捕捉于SELDI探針表面，而探針則接合于氣相離子譜儀的探針接口。在"SELDIMS"中，氣相離子譜儀是質譜儀。SELD工技術描述于例如美國第5，719，060號專利(Hutchens和Yip)以及美國第6,225，047號專利(Hutchens和Yip)。"表面增強親和捕捉"或"SEAC"是一種涉及使用包含吸附性表面的探針("SEAC探針")的SELDI型式。"吸附性表面"是指結合吸附劑(也稱為"捕捉劑"或"親和劑")的表面。吸附劑是任何能結合分析物(例如目標多肽或核酸)的物質。"層析吸附劑"是指典型用于層析的物質。層析吸附劑舉例來說包含離子交換物質、金屬螯合劑(例如次氮基乙酸和亞氨基二乙酸)、固定化金屬螯合劑、疏水作用吸附劑、親水作用吸附劑、染料、簡單生物分子(例如核苷酸、氨基酸、簡單糖和脂肪酸)及混合型吸附劑(例如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)。"生物特異性吸附劑"是指包括生物分子的吸附劑，生物分子例如核酸分子(如適體)、多肽、多糖、脂質、類固醇或這些的偶聯物(如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(如DNA)-蛋白質偶聯物)。在特定的實例中，生物特異性吸附劑可為大分子結構，例如多蛋白質復合物、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的實例是抗體、受體蛋白質和核酸。生物特異性吸附劑典型地相對于層析吸附劑，對目標分析物具有較高的特異性。進一步用于SELDI的吸附劑實例可在美國第6，225，047號專利(Hutchens禾口Yip，"Useofretentatechromatographytogeneratedifferencemaps",May1，2001)中找到。在一些具體實施例中，SEAC探針提供作為預活化的表面，而預活化的表面可被修飾以提供吸附劑的選擇。舉例來說，特定探針提供有可通過共價鍵結合生物分子的反應基團。環氧化物和酰基咪唑是可用于共價結合如抗體或細胞受體的生物特異性吸附劑的反應基團。"吸附"是指可檢測分析物非共價結合至吸附劑或捕捉劑。"表面增強凈解吸"或"SEND"是一種涉及使用探針的SELDI形式，所述探針包括化學結合于探針表面的能量吸收分子("SEND探針")。"能量吸收分子"("EAM")是指能夠從激光解吸/離子化源吸收能量，隨后促成與其接觸的分析物分子解吸和離子化的分子。此用語包括用于MALDI的分子，通常是指"基質"，并且明確地包括肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰氧-羥基-肉桂酸("CHCA")和二羥基苯甲酸、阿魏酸和羥苯乙酮衍生物以及其它。也包含用于SELDI的EAM。SEND進一歩描述于美國第5，179，060號專利和于2002年9月4日申請的美國第60/408,255號專利(Kitagawa，"MonomersAndPolymersHavingEnergyAbsorbingMoietiesOfUseInDesorption/IonizationOfAnalytes，，)."表面增強光不穩定附著和釋放"或"SEPAR"是一種涉及使用具有基團的探針的SELDI形式，所述基團附著于可共價結合分析物的表面，隨后暴露于如激光光束的光下，通過打斷基團內的光不穩定鍵而釋放分析物。SEPAR進一步描述于美國第5，719，060號專利。"洗提液"或"清洗溶液"是指典型為溶液的試劑，用于影響或修飾分析物吸附至吸附劑的表面和/或從表面移除未結合的物質。洗提液的洗提特性取決于如PH、離子強度、疏水性、混亂度、清潔劑強度和溫度。"分析物"是指任何需要被檢測的樣本成分。此用語可指樣本中的單一成分或復數成分。吸附于親和捕捉探針的吸附表面的樣本"復雜性"是指所吸附的不同蛋白質種類的數目。"分子結合伙伴"和"特異性結合伙伴"是指數對分子，典型為展示特異性結合的數對生物分子。分子結合伙伴包括但不局限于受體和配體、抗體和抗原、生物素和抗生物素蛋白以及生物素和鏈霉抗生"監控"是指以連續變化的參數記錄變化。"生物芯片"是指一般具有吸附劑附著平面的固體基材。經常地，生物芯片的表面包括復數可尋址的位置，其各自的位置具有吸附劑結合其上。生物芯片可用于結合探針接口，并因此如同探針般作用。"蛋白質生物芯片"是指適用于捕捉多肽的生物芯片。許多蛋白質生物芯片被描述于
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中。這些包括如CiphergenBiosystems(Fremont,CA)、PackardBioscienceCompany(MeridenCT)，Zyomyx(Hayward，CA)和Phylos(Lexington,MA)。這些蛋白質生物芯片的實施例揭露于以下專利或專利申請中美國第6，255，047號專利(Hutchens禾口Yip，"Useofretentatechromatographytogeneratedifferencemaps",May1，2001)、第W099/51773號國際公開(Kuimelis禾口Wagner，"Addressableproteinarrays"，October14，1999);美國第6，329，209號專利(Wagneretal.,"Aaarysofprotein—captureagentsandmethodsofusethereof"，December11，2001)以及第W000/56934號國際公開(Englertetal.，"Continuousporousmatrixarrays"，September28，2000)。CiphergenBiosystems制造的蛋白質生物芯片包含具有層析或生物特異性吸附劑在可尋址位置附著其上的表面。CiphergenProteinChip⑧數組包括NP20、H4、H50、SAX-2、WCX-2、CM-10、皿03、IMAC-30、LSAX-30、LWCX-30、皿C-40、PS-10、PS-20和PG-20。這些蛋白質生物芯片包含帶狀鋁基材。帶的表面涂覆二氧化硅。在NP-20生物芯片的案例中，二氧化硅的作用為捕捉親水蛋白質的親水吸附劑。H4、H50、SAX-2、WCX-2、CM_10、IMAC_3、IMAC-30、PS-10和PS-20生物芯片進一步包括功能化、交聯的聚合體，以水凝膠形式物理性地結合于生物芯片的表面或共價地通過硅烷結合于生物芯片的表面。H4生物芯片具有疏水結合的異丙基官能基。H50生物芯片具有疏水結合的壬基苯氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯。SAX-2生物芯片具有陰離子交換的四級銨官能團。WCX-2和CM-10生物芯片具有陽離子交換的羧酸官能團。IMAC-3和頂AC-30生物芯片具有通過螯合吸收如01++和Ni++過渡金屬離子的次氮基乙酸官能團。這些固定的金屬離子允許通過配位鍵結吸附的肽和蛋白質。PS-10生物芯片具有可與蛋白質上的基團反應用以共價結合的酰基咪唑官能基團。PS-20生物芯片具有用于共價結合蛋白質的環氧官能基團。PS系列的生物芯片適用于結合生物特異性吸附劑至芯片表面，用于特異性地從樣本中捕捉分析物，其中生物特異性吸附劑例如抗體、受體、植物凝集素、肝磷脂、蛋白A、生物素/鏈霉抗生物素和其相似者。PG-20生物芯片是蛋白G結合的PS-20芯片。LSAX-30(陰離子交換)、LWCX-30(陽離子交換)和BIAC-40(金屬螯合)生物芯片在其表面具有功能性的乳膠珠。這樣的生物芯片進一步描述于WO00/66265(Richetal.，"ProbesforaGasPhaseIonSpectrometer",November9，2000);W000/67293(Beecheretal.，"SampleHolderwithHydrophobicCoatingforGasPhaseMassSpectrometer",November9，2000);美國第US20030032043A1號專利申請(PohlandP即anu，"LatexBasedAdsorbentChip"，July16，2002)和美國第60/350,110號專利申請(Umetal.，"HydrophobicSurfaceChip"，November8，2001)。一旦在生物芯片上被捕捉，分析物可通過不同的檢測方法測得，檢測方法選自如氣相離子譜分析方法、光學方法、電化學方法、原子力顯微鏡和射頻方法。氣相離子譜分析方法在此描述。尤其感興趣的為質譜分析的使用，特別是SELDI。光學方法包括如熒光、冷光、化學冷光、吸光、反射、穿透和雙折射或折射率(例如表面等離子共振、橢圓偏光法、共振鏡法、光柵耦合波導法或干涉測量分析)。光學方法包括顯微鏡(共軛焦和非共軛焦)、成像方法和非成像方法。不同形式的免疫分析(如ELISA)為普遍檢測捕捉于固相的分析物的方法。電化學方法包括伏安法和電流測定法。射頻方法包括多極共振光譜分析。本發明文中的"標記"是指在得自患有人類癌癥的病人樣本相對于控制組受測對象(例如具有陰性診斷或未檢測出癌癥、正常或健康的受測對象)的樣本中差異表現的多肽(具有特別明顯的分子量)。所使用的"生物標記"可與"標記"交替使用。"測量"一詞是指包括檢測樣本中標記的存在或不存在、確定樣本中標記的量和/或鑒別生物標記類型的方法。測量可通過技藝中所公知的方法和進一步在此描述的方法完成，包括但不局限于SELDI和免疫分析。任何合適的方法可用于檢測和測量一種或更多在此所描述的標記。這些方法包括但不局限于質譜分析(例如激光解吸/離子化質譜分析)、熒光(例如雙抗體夾心免疫分析)、表面等離子體共振法、橢圓偏光法和原子力顯微鏡。"檢測"是指鑒別被測對象的存在、不存在或量。"差異性地存在"一詞是指在得自患有人類癌癥的病人樣本相對于控制組受測對象(例如具有陰性診斷或未檢測出癌癥、正常或健康的受測對象)存在標記量和/或頻率的差異。例如一些在此描述的標記，相較于來自控制組受測對象的樣本，在癌癥病人的樣本中存在有提高的水平。相對地，其它在此描述的標記，相較于來自控制組受測對象的樣本，在癌癥病人的樣本中存在有降低的水平。此外，標記可為多肽，相對于控制組受測對象的樣本，在患有人類癌癥病人的樣本中被檢測存在較高或較低的頻率。標記可以量、頻率或兩者差異性地存在。若一個樣本中的多肽量統計上顯著不同于另一個樣本中的多肽量，則多肽為差異性地存在于兩個樣本中。舉例來說，若多肽存在至少約120%、至少約130%、至少約150%、至少約180%、至少約200%、至少約300%、至少約500%、至少約700%、至少約900%或至少約1000%大于存在于另一個樣本中，或若其在一個樣本中為可檢測到的，而在另一個樣本中為不可檢測到的，則多肽是差異性地存在于兩個樣本中。可選擇地或額外地，若在前列腺癌病人的樣本中檢測到多肽的頻率統計上顯著地高于或低于控制組的樣本，則多肽是差異性地存在于兩組樣本中。舉例來說，若在一組樣本中被檢測至少約120%、至少約130%、至少約150%、至少約180%、至少約200%、至少約300%、至少約500%、至少約700%、至少約900%或至少約1000%更高頻率或更低頻率在另一組樣本中，則多肽是差異性地存在于兩組樣本中。"診斷"是指鑒別病理狀態，也就是前列腺癌的存在或性質。診斷方法在其敏感度和特異性上不同。診斷分析的"敏感度"是測試為陽性("真陽性"的百分比)的患病個體的百分比。患病的個體未被檢測到是"假陰性"。在未患病的受測對象測試為陰性稱為"真陰性"。診斷分析的"特異性"是1減去假陽性率，其中"假陽性"率被定義為無疾病卻被測試為陽性的比率。特定的診斷方法可不提供確定的狀態診斷，若方法提供輔助診斷的陽性指示則為足夠的。標記的"測試量"是指存在被測試樣本中標記的量。測試量可為絕對量(如Ug/ml)或相對量(如信號的相對強度)。標記的"診斷量"是指受測對象樣本中的標記量與前列腺癌的診斷一致。診斷量可為絕對量(如ug/ml)或相對量(如信號的相對強度)。標記的"控制量"可為任何量或量的范圍，用于比較標記的測試量。例如，標記的控制量可為在無前列腺癌的人中的標記量。控制量可為絕對量(如yg/ml)或相對量(如信號的相對強度)。于此所使用的"敏感度"一詞是具有特定疾病病人的百分比。例如，在PCa/HC組中，本發明的生物標記具有約98%的敏感度。生物標記的評判為正確地從103個前列腺癌病人區分出101個，也就是101/103=98%。于此所使用的"特異性"一詞是正確地識別為患有特定疾病，也就是正常或健康受測對象的百分比。例如，特異性以患有特定疾病的受測對象數量和正常健康受測對象的比較計算得到。"多肽"、"肽"和"蛋白質"在這里可替換使用，是指氨基酸殘基的聚合體。此用語應用于氨基酸的聚合體，其中一個或更多氨基酸殘基是對應于自然出現的氨基酸以及天然出現的氨基酸聚合體的類似物或仿真物。多肽可被修飾，例如通過糖殘基的加成形成糖蛋白。"多肽"、"肽"和"蛋白質"包含糖蛋白以及非糖蛋白。"免疫分析"是使用抗體特異性結合抗原(如標記)的分析。免疫分析以使用特定抗體的特異性結合性質分離、標定和/或定量抗原為特征。"抗體"是指由單一免疫球蛋白基因或多數免疫球蛋白基因或其片段實質上編碼的多肽配體，特異性地結合并識別抗原決定簇(例如抗原)。已知的免疫球蛋白基因包括K和A輕鏈恒定區基因，ct、Y、S、e和P重鏈恒定區基因，以及眾多免疫球蛋白可變區域基因。抗體例如以完整的免疫球蛋白或以一些被不同肽酶消化所產生的特征化片段存在。這包括如Fab'和F(ab)，2的片段。這里所使用的"抗體"一詞也包括由完整抗體修飾或使用重組DNA方法重新合成所產生的抗體片段。也包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合式抗體、人類化抗體或單鏈抗體。抗體的"Fc"部分是指免疫球蛋白的重鏈部分，包括一個或更多重鏈恒定區、CH,、CH2和CH3，但不包括重鏈的可變區。當提到蛋白質或肽時，"特異性(或選擇性)結合"于抗體或"特異性(或選擇性)免疫反應"是指在蛋白質或其它生物制品的異種群中確定蛋白質存在的結合反應。因此，在指定的免疫分析條件下，特定抗體結合特定蛋白質至少兩倍于背景值，并且不會與存在樣本中的其它蛋白質大量實質地結合。在這些條件下特異性地結合抗體需要選擇對特定蛋白質具有特異性的抗體。例如，來自如大鼠、小鼠或人類的特定物種所產生標記"x"的多克隆抗體，可選擇地為以僅特異性地與標記X，而不與其它除標記X的多形態變化體和等位基因外的蛋白質免疫反應的多克隆抗體。選擇可通過減去與來自其它物種的標記x交叉反應的抗體來完成。不同的免疫分析形式可用于選擇與特定蛋白質特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫分析為常規用于選擇與蛋白質特異性免疫反應的抗體(參閱如Harlow&Lane，Antibodies,ALaboratoryManual(1988)，可用于決定特異性免疫反應的免疫分析形式和條件的說明)。通常特異性或選擇性的反應產生至少兩倍于背景信號或干擾，并且更典型地為大于10-100倍的背景值。"處理受測對象的治療"是指臨床醫生或醫生后續為確定前列腺癌狀態的行為。舉例來說，若本發明方法的結果為不確定或有必要進行狀態的確認時，醫生可安排更多測試。另外，若狀態表明手術為合適的，醫生可為病患進行手術排期。同樣地，若狀態為陰性，例如為晚期前列腺癌，或狀態為急性，則沒有進一步的行動可被保證。此外，若結果顯示治療成功，則不必要進一步處理。2.前列腺癌的生物標記2.1.生物標記本發明提供以多肽為基礎的生物標記PCI，其差異性地存在于患有前列腺癌的受測對象中，尤其是前列腺癌相對于正常狀態(非前列腺癌)。生物標記以分子量、通過質譜分析測得的質荷比、在飛行時間質譜分析的質譜峰形、以及對吸附劑表面的結合特性為特征。這些特征24提供確定特定被檢測的生物分子是否為本發明生物標記的方法。這些特征顯示生物分子的固有特性，但并非作為區分生物分子的局限。生物標記通過使用來自CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA)("Ciphergen")的ProteinChip數組以SELDI技術來發現。搜集的血清樣本收集自被診斷為前列腺癌的受測對象及被診斷為正常的受測對象。這些樣本通過陰離子交換層析進行分餾。分餾的樣本涂覆于SELDI生物芯片上，并且樣本中多肽的圖譜經由CiphergenPBSII質譜儀以飛行時間質譜分析產生。所得到的圖譜以CiphergenExpressDataManagerSoftware禾卩BiomarkerWizard,以及耳又自CiphergenBiosystems,Inc.的BiomarkerPatternSoftware分析。每個組的質譜通過散布圖分析。以Mann-Whitney測試分析比較前列腺癌與控制組在散布圖中的每一個蛋白質群集，并且選取于兩組中具有顯著差異(p〈0.0001)的蛋白質。此方法更詳細描述于下文實施例的段落。生物標記因此被發現為PCI。？1^^6化(]^@分析"欄是指發現生物標記的層析分餾，生物標記結合的生物芯片類型以及清洗條件。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>本發明的生物標記以通過質譜分析決定的質荷比為特征。質荷比是通過CiphergenBiosystems,Inc.PBSII質譜儀上所產生的質譜確定。此儀器具有約正/負0.15百分比的質量精確度。另外，此儀器具有約400至1000m/dm的質量分辨率，其中m為質量和dm為于0.5峰高處的質譜峰寬。生物標記的質荷比使用BiomarkerWizard軟件(CiphergenBiocystems，Inc.)石角定。BiomarkerWizard通過群集所有由PBSII確定的分析光譜中相同峰的質荷比，取群集內極大與極小的質荷比并除以二，并指定一個質荷比給所述生物標記。因此，所提供的質量反映這些說明。本發明的生物標記進一步以其在飛行時間質譜分析中的質譜峰的形狀為特征。圖8顯示代表生物標記的質譜譜峰。本發明的生物標記進一步以其在層析表面的結合性質為特征。大多數生物標記在以100mMpH4的醋酸鈉清洗后結合于陽離子交換吸附劑(例如CiphergenWCXProteinChip⑧數組)。由于本發明的生物標記通過質荷比、結合性質和圖譜形狀為特征，他們可通過質譜分析檢測，而不需知道其特定特性。然而，若需要，未確定特性的生物標記可通過如確定多肽的氨基酸序列來識別。舉例來說，生物標記可以一些如胰島素或V8蛋白酶的酶繪制肽圖，以及消化片段的分子量可用來搜索數據庫的序列，所述的序列與通過不同酶所產生消化片段的分子量相匹配。可選擇地，蛋白質生物標記可使用串聯MS技術測序。在這個方法中，蛋白質通過例如凝膠電泳來分離。含有生物標記的帶被切下，并使蛋白質通過蛋白酶消化。特定的蛋白質片段通過第一質譜儀分離。此片段隨后經過碰撞誘導冷卻，將肽片段化并產生多肽階梯。多肽階梯然后通過串聯MS的第二質譜儀分析。以多肽階梯成分的質量差異識別序列中的氨基酸。完整的蛋白質可以此方式測序，或序列片段可通過數據庫挖掘尋找相同的候選序列。檢測生物標記的優選生物來源是血清。然而，在其它的具體實施例中，可于血漿或尿液中偵測生物標記。本發明的生物標記是多肽。因此，本發明提供分離形式的多肽。生物標記可從如尿液或血清的生物體液中分離。其可通過任何技藝領域所已知基于質量和結合特性的方法分離。例如，將包括多肽的樣本進行如本文所描述的層析分餾，并進一步通過如丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。生物標記特性的知識也允許其通過免疫親和層析進行分離。3.生物標記與蛋白質的不同形式蛋白質通常以復數不同的形式存在于樣本中。這些形式可由翻譯前、后修飾的其中一者或兩者產生。翻譯前的修飾形式包括等位基因變體、剪接變體和RNA編輯形式。翻譯后的修飾形式包括由蛋白質裂解(例如信號序列的裂解或母蛋白質的片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、半胱胺酸化、磺化及乙酰化產生的形式。在檢測與測定樣本中的蛋白質時，區分蛋白質不同形式的能力取決于差異的性質以及所使用檢測或測定的方法。例如使用單株抗體的免疫分析將檢測所有含有抗原決定簇(印tiope)的蛋白質形式而無法進行區分。然而，利用二個抗體直接針對蛋白質上不同抗原決定簇的雙抗體夾心免疫分析將會檢測所有包含此二種抗原決定簇的蛋白質形式，而不會檢測僅含有其中一種抗原決定簇的形式。在診斷分析中，當使用特定方法所檢測到的形式與任何特定的形式同樣為好的生物標記時，則無法區別蛋白質不同形式所造成的影響將很小。然而，當蛋白質的特定形式(或特定形式的亞群)比通過特定方法共同檢測到的不同形式的集合體為較好的生物標記時，此分析能力將受到影響。在此種情況下，采用一種能區別蛋白質不同形式，并且能特異地檢測與測定所需蛋白質的單一或多種形式的分析是有用的。區別分析物的不同形式或特異地檢測分析物的特定形式是指"分辨"所述分析物。質譜分析是一種分辨蛋白質不同形式特別有效的方法，因為不同的形式通常具有可由質譜分析分辨的不同質量。因此，若蛋白質的一種形式相對其他形式對一種疾病為較好的生物標記時，質譜分析可特異性地檢測和測定有效的形式，而傳統免疫分析卻無法區分各種形式，并且無法特異性地檢測有效的生物標記。一種有用的方法結合質譜分析與免疫分析。首先，使用一種生物特異性捕捉劑(例如能辨識生物標記及它的其它形式的抗體、適體或親和體)捕捉感興趣的生物標記。優選地，生物特異性捕捉劑結合至如珠、盤、膜或芯片的固相。在洗去未結合的物質后，通過質譜分析檢測和/或測定所捕捉的分析物(此方法也會捕捉到結合至蛋白質、或可由抗體和其本身為生物標記所識別的蛋白質交互反應物)。不同形式的質譜分析可用于檢測蛋白質的形式，包括如傳統的MALDI或SELDI與電噴射離子化的激光解析法。因此，當本文提到檢測特定蛋白質或測定特定蛋白質的量時，其意指在有或沒有分辨不同形式的蛋白質檢測和測定蛋白質。舉例來說，"測定PCI"的歩驟包含通過在蛋白質樣本中不區分不同蛋白質形式的方法，以及通過從其它形式中區分一些形式或測定蛋白質的特定形式的方法測定PCI。274.前列腺癌生物標記的檢測本發明的生物標記可通過任何適當的方法檢測。為達此目的，可使用的檢測范例包含光學方法、電化學方法(伏安法和電流測定法技術)、原子力顯微鏡和如多極共振譜分析的射頻方法。光學方法的例子除顯微鏡外，共軛焦和非共軛焦可檢測熒光、冷光、化學冷光、吸光、反射、穿透和雙折射或折射率(例如表面等離子共振、橢圓偏光分析、共振鏡法、光柵耦合波導法或干涉測量分析)。在一個具體實施例中，通過生物芯片分析樣本。生物芯片一般包括固體基質以及具有供捕捉劑附著(也稱吸附劑或親和劑)的通常為平面的表面。通常，生物芯片的表面包括復數個分別具有捕捉劑結合的可尋址位置。蛋白質生物芯片為適合捕捉多肽的生物芯片。許多蛋白質生物芯片已記述于本
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中，其中包括如CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA)、Zyomyx(Hayward，CA)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Biacore(Uppsala，Sweden)禾口Procognia(Berkshire,UK)等公司制造的蛋白質生物芯片。這些蛋白質生物芯片的實施例揭露于以下的專利或公開的專利申請中美國第6，255，047號專利(Hutchens和Yip)、美國第6,537,749號專利(Kuimelis和Wagner)、美國第6，329,209號專禾lj(Wagneretal.)、PCT第WO00/56934號國際公開案(Englertetal.)、PCT第WO03/048768號國際公開案(Boutelletal.)以及美國第5，242，828號專利(Bergstrometal.)。4.1.通過質譜分析檢測在一個優選的具體實施例中，本發明的生物標記通過質譜分析檢測，為使用質譜儀檢測氣相離子的方法。質譜儀的實例是飛行時間式、扇形磁場式、四極濾質器式、離子阱式、離子回旋共振式、扇形靜電分析式及這些的混合。在更優選的具體實施例中，質譜儀為激光解吸/離子化質譜儀。在激光解吸/離子化質譜分析中，分析物置于質譜分析探針的表面，探針為適合接合于質譜儀的探針接口，并且把分析物呈現于離子化能量以離子化及引入質譜儀內的裝置。激光解吸質譜儀利用典型為紫外線激光但也可為紅外線激光的激光能，將分析物從表面釋出，并且將其揮發和離子化，使其可為質譜儀的離子光學儀器所利用。SELDI本發明所使用優選的質譜分析技術為"表面增強激光解吸和離子化"或"SELDI"，如美國第5,719,060號與第6,255,047號皆屬于Hutchens與Yip的專利所記載。這是指解析/離子化氣相離子譜分析(例如質譜分析)的方法，其中分析物(于此指一種或多種的生物標記)經捕捉于SELDI質譜分析探針的表面。有多種形式的SELD工。一種形式的SELDI被稱為"親和捕捉質譜分析"，也被稱為"表面增強親和捕捉"或"SEAC"。此方法包括使用在探針的表面具有通過物質與分析物間非共價親和作用(吸附)捕捉分析物的探針。此物質不同地稱為"吸附物"、"捕捉劑"、"親和劑"或者"結合基團"。這些探針可為"親和捕捉探針"以及具有"吸附表面"。捕捉劑可為任何能結合分析物的物質。捕捉劑通過物理吸附或化學吸附而黏附于探針表面。在特定的具體實施例中，探針具有已附著于表面的捕捉劑。在其它的具體實施例中，探針經預活化，并且包含能結合捕捉劑的反應基團，例如通過形成共價或配位鍵的反應。環氧化物和酰基咪唑為可用于共價結合如抗體或細胞受體的多肽捕捉劑的反應基團。次氮基三乙酸和亞氨基二乙酸是可用于作為與金屬離子結合的螯合劑的反應基團，所述金屬離子非共價地與含組氨酸的肽反應。吸附劑一般分為層析吸附劑與生物特異性吸附劑。"層析吸附劑"是指典型使用于層析的吸附材料。層析吸附劑包含如離子交換物質、金屬螯合劑(例如次氮基三乙酸和亞氨基二乙酸)、固定化金屬螯合劑、疏水性作用吸附劑、親水性作用吸附劑、染料、簡單生物分子(如核苷酸、氨基酸、簡單糖和脂肪酸)及混合型吸附劑(如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)。"生物特異性吸附劑"是指包括生物分子的吸附劑，其中生物分子如核酸分子(如適體)、多肽、多糖、脂質、類固醇或其偶聯物(如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(如DNA)-蛋白質偶聯物)。在特定的實施例中，生物特異性吸附劑可為大分子結構，如多蛋白復合物、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的實例是抗體、受體蛋白質和核酸。生物特異性吸收劑典型地較層析吸附劑對目標分析物具有更高的特異性。進一步用于SELDI的吸附劑實例可于美國第6，225，047號專利中査到。"生物選擇性吸附劑"是指與分析物具有至少10—8M親和性的吸附劑。由CiphergenBiosystems，Inc.制造的蛋白質生物芯片包括具有層析或生物特異性吸附劑于可尋址的位置附著其上的蛋白質芯片。Ciphergen的ProteinChip⑧數組包含NP20(親水性);H4和H50(疏水性)；SAX-2、Q-10和LSAX-30(陰離子交換)；WCX-2、CM-10和LWCX-30(陽離子交換)；IMAC-3、皿C-30和IMAC-40(金屬螯合)；以及PS-10、PS-20(具有醯基咪唑、環氧化物的反應表面)和PG-20(通過酰基咪唑耦合的蛋白質G)。疏水性蛋白質芯片(ProteinChip)數組含有異丙基或壬基苯氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的官能團。陰離子交換蛋白質芯片(ProteinChip)數組含有四級銨的官能團。陽離子交換蛋白質芯片(ProteinChip)數組含有羧酸的官能團。固定化金屬螯合蛋白質芯片(ProteinChip)數組含有通過螯合吸附如銅、鎳、鋅和鎵過渡金屬的次氮基三乙酸官能團。預活化蛋白質芯片(ProteinChip)數組含有可與蛋白質上的基團共價結合的酰基咪唑或環氧化物的官能團。這些生物芯片進一步記述于美國第6，579，719號專利(Hutchens禾口Yip，"RetentateChromatography,"June17，2003)、美國第6,897,072號專利(Richetal.，"ProbesforaGasPhaseIonSpectrometer,"May24，2005)、美國第6，555，813號專利(Beecheretal.，"SampleHolderwithHydrophobicCoatingforGasPhaseMassSpectrometer,"April29，2003)、美國第U.S.2003—0032043Al號專利公開案(Pohl和Papanu，"LatexBasedAdsorbentChip,July16,2002)、PCT第W003/040700號國際公開案(Umetal.，"HydrophobicSurfaceChip,"May15，2003)、美國第US2003/-0218130Al號專利申請公開案(Boschettietal.，"BiochipsWithSurfacesCoatedWithPolysaccharide-BasedHydrogels，，，April14，2003)以及美國第7，045，366號專利(Huangetal.，"PhotocrosslinkedHydrogelBlendSurfaceCoatings,，，May16，2006)。一般來說，具有吸附性表面的探針與樣本接觸一段時間，足以允許生物標記或可能存在于樣本中的生物標記結合至吸附劑。在反應一段時間后，清洗基質以除去未結合的物質。可使用任何適合的清洗溶液，優選地可使用水性溶液。通過調整清洗的力度可控制仍保持結合的分子范圍。清洗溶液的洗提特性可取決于如pH、離子強度、疏水性、混亂度、清潔劑強度和溫度。除非探針同時具有SEAC與SEND的性質(如同本文所述)，接著施加能量吸收分子至具有結合生物標記的基質上。通過如飛行時間質譜儀的氣相離子譜儀檢測結合于基質的生物標記。生物標記通過如激光的離子化源而離子化，產生的離子由離子光學裝置收集，然后通過質量分析器分散和分析通過的離子。檢測器隨后將檢測離子的數據轉換為質荷比。生物標記的檢測通常將涉及信號強度的檢測。因此，生物標記的量與質量皆可被測定。另一種形式的SELDI為表面增強凈解吸("SEND")，涉及使用包括化學結合到探針表面("SEND探針")的能量吸收分子的探針。"能量吸收分子"(EAM)—詞表示能從激光解吸/離子化源吸收能量，然后提供與其接觸的分析物分子解吸和離子化。EAM的范疇包括使用于MALDI的分子，通常是指"基質"，并且以肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰氧-羥基-肉桂酸(CHCA)和二羥基苯甲酸、阿魏酸和羥苯乙酮衍生物作為例示。在特定的具體實施例中，能量吸收分子并入線性或交聯的聚合物中，如聚甲基丙烯酸酯。舉例來說，組合物可為a-氰基-4-異丁烯酰基氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一個具體實施例中，組合物為a-氰基-4-異丁烯酰基氧基肉桂酸、丙烯酸脂和3-(三乙氧基)硅垸基丙基甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一個具體實施例中，組合物為a-氰基-4-異丁烯酰基氧基肉桂酸和十八烷基甲基丙烯酸酯("C18SEND")的共聚物。SEND進一步記述于美國第6，124，137號專利及PCT第W003/64594號國際公開案(Kitagawa，"MonomersAndPolymersHavingEnergyAbsorbingMoietiesOfUseInDesorption/IonizationOfAnalytes，"August7，2003)。SEAC/SEND為捕捉劑和能量吸收分子皆附著于樣本表現表面的一種SELDI變化形式。因此，SEAC/SEND探針允許通過親和捕捉和離子化/解吸捕捉分析物而不需使用外界基質。C18SEND生物芯片是一種SEAC/SEND的變化形式，包括作為捕捉劑的C18基團和作為能量吸收基團的CHCA基團。另一種變化形式的SELDI稱為表面增強光不穩定附著和釋放("SEPAR")，涉及使用具有基團的探針，所述基團附著于表面，并且可共價結合分析物，隨后通過暴露于如激光光束的光打斷基團中光不穩定鍵而釋放分析物(參閱美國第5，719，060號專利)。依照本發明，SEPAR和其它形式的SELDI很快地適合于檢測生物標記或生物標記的形態。其它質譜分析方法在另一種質譜分析中，生物標記可先被具有結合生物標記層析性質的層析樹脂捕捉。在本實施例中，可包括多種方法。例如，可于如CMCeramicHyperDF樹脂的陽離子交換樹脂上捕捉生物標記，清洗樹脂，洗提生物標記，并以MALDI檢測。另外，此方法可在利用陽離子交換樹脂前先通過陰離子交換樹脂分餾樣本。在另外的方法，可通過陰離子交換樹脂分餾，并以MALDI直接檢測。在又另一個方法中，可于含有與生物標記結合的抗體的免疫層析樹脂上捕捉生物標記，清洗樹脂以除去未結合的物質，從樹脂上洗提生物標記，并以MALD工或SELDI檢測洗提出的生物標記。數據分析通過飛行時間質譜分析進行分析物的分析，產生飛行時間光譜。最終分析的飛行時間光譜通常并不代表樣本對離子化能單一脈沖的信號，而是許多脈沖的信號的總和。這將降低噪聲并增加動態范圍。隨后對飛行時間的數據進行數據處理。在Ciphergen的？1"(^6:1110^。@軟件中，數據處理通常包含TOF至M/Z的轉換以產生質譜、基線的減運算以消除儀器偏差及高頻噪聲的過濾以降低高頻噪聲。藉由生物標記的解吸和檢測所產生的數據可使用可編程的數字計算機分析。計算機程序分析數據指明被檢測生物標記的數量，以及可選擇地每一個被檢測生物標記的信號強度和測定的分子量。數據分析的步驟可包括確定生物標記信號強度以及移除偏離預定統計分布的數據。例如，可通過計算相對一些參考物的每一個譜峰高度標準化所觀測到的峰值。參考物可為通過裝置或如能量吸收物質的化學品所產生的背景噪聲，并在標度中被設為零。計算機可轉換結果的數據為不同顯示的形式。可顯示的標準光譜，但在有用的形式中從光譜的角度來看僅保留峰高和質量的數據，產生更清晰的畫面，使分子量幾乎相等的生物標記更容易被觀測到。在另一個有用的形式中，比較二個或更多個光譜，方便地突顯獨特的生物標記以及于樣本中上或下調控的生物標記。利用任何一種所述的形式，將可立即確定在樣本中是否存在特定的生物標記。分析一般包括識別表示來自分析物的信號的譜峰。譜峰的選擇可通過直接觀察完成，但也可使用軟件，如Ciphergen的ProteinChip軟件套件的部分可自動檢測譜峰。一般而言，軟件的運作是通過識別信號-噪聲比高于所選閥值的信號，以及在譜峰信號的中心標記譜峰的質量。在一個有效的應用中，比較許多光譜，以識別在選定的質譜百分比中所呈現相同的譜峰。一種變化形式的軟件群集所有在指定的質量范圍內出現在不同光譜的譜峰，并在臨近質量(M/Z)群集的中點為所有譜峰指派一個質量(M/Z)。用于分析數據的軟件可包含應用算法于信號分析的編碼，以確定在信號中表示的譜峰信號是否對應于本發明的生物標記。軟件也可將關于所觀察生物標記譜峰的數據進行分類樹或ANN分析處理，以確定于檢查中指示特定臨床參數狀態的生物標記的譜峰或多個生物標記譜峰的組合是否存在。數據的分析對于不論直接或間接從樣本的質譜分析所獲得的多種參數可能是「關鍵的」。這些參數包含但不局限于一個或多個譜峰的存在或不存在、一個譜峰或一群譜峰的形狀、一個或多個譜峰的高度、一個或多個譜峰的高度對數以及其它峰高數據的算法運算。SELDI檢測前列腺癌生物標記的一般操作步驟優選用于檢測本發明生物標記的操作步驟如下文描述。用于測試的樣本如尿液，優選地于SELDI分析前經過預分餾。這使樣本單純化并提高敏感度。優選預分餾的方法包括使樣本接觸陰離子交換層析材料，例如QHyperD(BioS印ra，SA)。結合物質隨后通過使用pH9、pH7、pH5和pH4的緩沖液以分步pH洗提(參閱實施例l-緩沖液列表)(生物標記被洗提的餾分也表示于表1中)。多種包含生物標記的分餾被收被測試的樣本(優選地經預分餾)隨后與包括陽離子交換吸附劑(優選為WCXProteinChip數組(CiphergenBiosystems,Inc.))或皿C吸附劑(優選為頂AC3ProteinChip數組(CiphergenBiosystems,Inc.))的親和捕捉探針接觸，再一次如表l所示。以緩沖液清洗探針，洗去未結合的分子而保留生物標記。適合每一個生物標記的清洗液于表1中所示。通過激光解吸/離子化質譜分析檢測生物標記。另外，若可取得辨識生物標記的抗體，例如P2微球蛋白、半胱氨酸蛋白酶、轉鐵蛋白、轉甲狀腺素蛋白或血清蛋白，可被附著于探針的表面，如預活化的PS10或PS20ProteinChip數組(CiphergenBiosystems,Inc.)。這些抗體能從樣本中將生物標記捕捉到探針的表面。然后，可通過如激光解吸/離子化質譜分析檢測生物標記。4.2.通過免疫分析進行檢測在另一個具體的實施例中，本發明的生物標記通過免疫分析測定。免疫分析需要如抗體的生物特異性捕捉劑捕捉生物標記。抗體可由本
技術領域：
所公知的方法制造，例如用生物標記免疫動物。生物標記可基于其結合特征從樣本中分離。另外，若已知多肽生物標記的氨基酸序列，則多肽可經由合成，并通過本
技術領域：
所公知的方法產生抗體。本發明可考慮傳統的免疫分析，包括如包含ELISA或基于熒光的免疫分析的雙抗體夾心免疫分析，以及其它酵素免疫分析。濁度分析是可于液相實施的分析法，其中抗體是在溶液中。而抗體與抗原的結合使所測定的吸光度產生變化。在基于SELDI的免疫分析中，生物標記的生物特異性捕捉劑附著于MS探針的表面，例如預活化蛋白質芯片(ProteinChip)數組。生物標記隨后通過反應劑特異性地被捕捉于生物芯片上，并且被捕捉的生物標記通過質譜分析檢測。5.確定受測對象前列腺癌的狀態5.1.單一標記本發明的生物標記可用于評估診斷測試中受測對象的前列腺癌狀態，例如診斷前列腺癌。"前列腺癌狀態"一詞包含任何可區別疾病的表現，包括非疾病。舉例來說，疾病的狀態包括但不局限于疾病的存在或不存在(例如前列腺癌相對于非前列腺癌)、患病的風險、疾病的階段、疾病的進程(例如隨時間的疾病進展或疾病緩解)和疾病治療的效果或反應。基于這個狀態，可進一步表示包含額外診斷測試或治療程序或療法的程序。正確預測狀態的診斷測試力度通常通過分析的敏感度、分析的特異性或接收工作特征("ROC")曲線下的面積而測定。敏感度為通過測試預測為陽性的真陽性百分比，而特異性為通過測試預測為陰性的真陰性百分比。ROC曲線提供測試的敏感度作為1-特異性的函數。ROC曲線下的區域越大，測試的預測值則越有效力。其它利用測試的有用測定為陽性的預測值和陰性的預測值。陽性的預測值為測試為陽性且確實為陽性的人的百分比。陰性的預測值為測試為陰性且確實為陰性的人的百分比。本發明的生物標記顯示至少pSO.05、pS10—2、p^lO—3、p^10—4或10—5的不同前列腺癌狀態的統計差異。單獨或組合使用這些生物標記進行診斷測試，顯示至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%及約100%的敏感度和特異性。PCI差異性地存在于前列腺癌中，因此，每一個可個別地有助于確定前列腺癌的狀態。此方法首先包括使用本文所述的方法在受測對象的樣本中測定所選定的生物標記，例如在SELDI生物芯片上捕捉后以質譜分析檢測，其次是將測定與診斷量或區分陽性前列腺癌狀態與陰性前列腺癌狀態的切點進行比較。診斷量代表測定的生物標記量高于或低于受測對象被分類為患有特定前列腺癌的狀態。舉例來說，若生物標記于前列腺癌中相較于正常為上調控，則測定量高于診斷的切點提供前列腺癌的診斷。另外，若生物標記于前列腺癌中為下調控，則測定的量低于診斷的切點提供前列腺癌的診斷。如同本
技術領域：
所已知，通過調整分析中特定診斷的切點，可依照診斷者的偏好增強診斷分析的敏感度或特異性。特定診斷的切點可通過如在來自多個含有不同前列腺癌狀態的受測對象具統計上顯著意義數量的樣本中測定生物標記的含量，如同本文所實施的，可依診斷者所要求的特異性與敏感度水平取得切點。5.2.確定患病的風險在一個具體實施例中，本發明提供確定受測對象患病風險的方法。生物標記的含量或型態是不同風險狀況的特征，例如高、中或低。患病的風險通過測定相關的生物標記或復數生物標記確定，隨后可進行分類算法或與特定風險水平相關的生物標記的參考量和/或型態進行比較。5.3.確定疾病的階段在一個具體實施例中，本發明提供確定受測對象疾病階段的方法。疾病的每一個階段具有生物標記的特征性含量或一組生物標記(一種模式)的相對含量。疾病的階段通過測定相關的生物標記或復數生物標記確定，隨后可進行分類演算或與特定階段相關的生物標記的參考量和/或型態進行比較。5.4.確定疾病的進程(進展/緩解)在一個具體實施例中，本發明提供確定受測對象疾病進程的方法。疾病進程是指疾病狀態隨時間的變化，包含疾病的進展(惡化)和疾病的轉好(改善)。生物標記的含量或相對含量(例如型態)隨著時間而變化。舉例來說，生物標記PCI隨著疾病增加，而生物標記"Z"卻在疾病中減少。因此，這些生物標記的趨勢，不論是隨著時間增加或降低而朝著疾病或是非疾病的方向，皆表示疾病的進程。因此，此方法涉及在至少二個不同的時間點測定受測對象的一種或多種生物標記，例如第一時間和第二時間，以及若有含量的變化時，則比較含量的變化。疾病的進程基于這些比較而確定。5.5.受測對象的處理在特定鑒別前列腺癌狀態的方法具體實施例中，此方法進一步包括基于狀態而處理受測對象的治療。這種處理包含醫生或臨床醫生在確定前列腺癌狀態后的行為。例如，若醫生作出前列腺癌的診斷，隨后可進行如開處方或施加治療劑的特定治療療法。另外，非前列腺癌的診斷或非前列腺癌可伴隨進一步的測試以確定病人所可能遭受的特定疾病。同樣地，若診斷測試作出對前列腺癌的狀態不確定的結果，則可進行進一步的測試。本發明的其它具體實施例為有關于對如技術人員、醫生或病患傳達檢測結果或診斷或二者。在特定的具體實施例中，計算機用于將檢測結果或診斷或二者傳達給有興趣的一方，如醫生及其病患。在一些具體實施例中，檢測或檢測的結果將在不同于結果或診斷被傳達的國家或管轄區域中被完成或被分析。在本發明優選的具體實施例中，基于在測試的受測對象中存在或不存在生物標記進行診斷，在取得診斷后立即傳達給受測對象。此診斷可由受測對象的治療醫生傳達于受測對象。另外，診斷可通過電子郵件傳送或通過電話傳達給測試的受測對象。計算機可用于以電子郵件或電話傳達此診斷。在特定的具體實施例中，使用電信
技術領域：
的人員所熟知的計算機硬件與軟件的組合可產生并自動將含有診斷測試結果的訊息傳達于受測對象。保健取向的通信系統實例已描述于美國第6，283，761號專利，然而，本發明并不局限于使用特定通信系統的方法。在本發明方法的特定具體實施例中，所有或一些方法的步驟，包含樣本檢測、疾病診斷，以及檢測結果或診斷的傳達，可在不同的(例如外國的)管轄區域中實行。5.6.確定醫藥藥物的療效在另一個具體實施例中，本發明提供確定醫藥藥物療效的方法。這些方法適用于實施藥物的臨床試驗與監控病患對于藥物的進程。治療或臨床試驗包括在特別療法中施加藥物。此療法包括藥物的單一劑量或經過一段時間藥物的多數劑量。醫生或臨床研究者在施加的過程中監控藥物對病患或受測對象的影響。若藥物對于病癥具有醫藥的影響，則本發明生物標記的含量或相對含量(例如型態或圖譜)會朝非疾病圖譜的方向變化。因此，可追蹤在治療過程中受測對象體內這些生物標記含量的進程。因此，此方法包括在接受藥物治療的受測對象體內測定一種或多種生物標記，以及將生物標記的量與受測對象的疾病狀態相關聯化。一個本方法的具體實施例包括在藥物治療過程中的至少二個不同的時間點測定生物標記的水平，例如第一時間和第二時間，若有變化，則比較生物標記量的變化。舉例來說，可在施加藥物前后或藥物施加期間二個不同的時間點測定生物標記。治療的效果基于這些比較而確定。若治療為有效的，生物標記將趨于正常，若治療為無效的，則生物標記趨向疾病的跡象。若治療為有效的，生物標記將趨于正常，若治療為無效的，則生物標記趨向疾病的跡象。6.產生鑒別前列腺癌狀態的分類算法在一些具體實施例中，使用如"已知樣本"的樣本產生的光譜(例如質譜或飛行時間光譜)所得到的數據可用來"訓練"分類模型。"已知樣本"是已預分類的樣本。得自光譜和用于形成分類模型的數據稱作"訓練數據組"。一旦被訓練，分類模型可識別由使用未知樣本所產生的光譜所得到數據的型態。分類模型可隨后用于將未知的樣本分類。這將適用于如預測特定生物樣本是否與特定生物病癥(例如疾病相對于非疾病)相關。用于形成分類模型的訓練數據組可包括原始數據或預處理數據。在一些具體實施例中，原始數據可直接由飛行時間光譜或質譜中得到，并且其隨后視需要地如前所述進行"預處理"。可使用任何適合的統計分類(或"學習")方法形成分類模型，此方法試圖基于存在于數據中的目標參數將數據本體分離歸類。分類方法可被監督或未被監督。監督或未監督的分類過程的實例記述于Jain，，，StatisticalPatternRecognition:AReview"，IEEETransactionsonPatternAnalysisandMachineIntelligence,Vol.22，No.1，January2000，其所教導的內容并入本文作為參考。在監督的分類中，包含已知類別實例的訓練數據被呈現于學習機制，其學習一組或多組定義己知類別中每一個的關系。新數據可隨后用于學習機制，隨后使用經學習的關系分類新數據。監督分類方法的實例包含線性回歸方法(例如多元線性回歸(MLR)、偏最小二乘(PLS)回歸及主成分回歸(PCR))、二進制判定樹(例如遞歸分化方法，如CART-分類和回歸樹)、如反向傳播網絡的人工神經網絡、辨別分析(例如貝葉斯分類器或費希爾分析)、邏輯分類器及支持向量分析器(支持向量機)。優選的監督分類方法是遞歸分化方法。遞歸分化方法使用遞歸分化樹將從未知樣本取得的光譜分類。進一步關于遞歸分化過程的細節描述于美國第20020138208Al號專利申請案，Paulseetal.，"Methodsforanalyzingmassspectra.，，。在其它的具體實施例中，所建構的分類模型可使用無監督的學習方法形成。無監督的分類試圖基于在訓練數據組中的相似性學習分類，而不用由光譜得到的訓練數據組預分類光譜。無監督的學習方法包括群集分析(clusteranalysis)。群集分析嘗試將數據分成「群集」或群組，其理想應為成分彼此間非常相似，并且與其它群集的成分非常不相似。隨后使用一些測量數據項目間距離的距離度量測定相似性，并且群集彼此靠近的數據項目。群集技術包含MacQueen的K-平均算法和Kohonen的自組織映圖(Self-OrganizingMap)算法。聲稱用于分類生物信息的的學習算法已描述于如PCT第W001/31580號國際公開案(Barnhilletal.，"Methodsanddevicesforindentifyingpatternsinbiologicalsystemsandmethodsofusethereof")、美國第20020193950Al號專利申請案(Gavinetal.，"Methodoranalyzingmassspectra")、美國第20030004402Al號專利申請案(Hittetal.，"Processfordiscriminationbetweenbiologicalstatesbasedonhiddenpatternsfrombiologicaldata")、以及美國第20030055615Al號專利申請案(Zhang和Zhang,"Systemsandmethodsforprocessingbiologicalexpressiondata，，)。分類模型可在任何合適的數字計算機上形成和使用。適合的數字計算機包括微型、小型或大型利用任何標準或特殊化操作系統的計算機，例如基于Unix、Windows或Linux的操作系統。所使用的數字計算機可物理性地與產生感興趣光譜的質譜儀分離，或可與質譜儀結合。依照本發明具體實施例的訓練數據組與分類模型可通過由數字計算機執行或使用的計算機編碼而具體化。計算機編碼能儲存于任何合適計算機可讀取的媒體，包含光盤或磁盤、記憶棒、磁帶等，并可由任何包括C、C++、visualbasic等的合適計算機編程語言編寫。上述的學習算法適用于發展已發現生物標記的分類算法或發現前列腺癌的新生物標記。因此，分類算法通過提供單獨或組合使用的生物標記診斷值(如切點)形成診斷測試的基礎。7.物質的組合物在另一個態樣中，本發明提供基于本發明生物標記的物質組合物。在另一個具體實施例中，本發明提供本發明生物標記的純化形式。純化的生物標記可作為抗原以制備抗體。純化的生物標記也可作為檢測過程中的標準物。在此所使用的"純化的生物標記"是由其它蛋白質和肽，和/或發現所述生物標記的生物樣本的其它物質中單離出的生物標記。可使用任何本領域所已知的技術純化生物標記，包括但不局限于機械分離(例如離心)、硫酸銨沉淀、透析(包括大小排除透析)、大小排除層析、親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析及金屬螯合層析。這些方法可以任何適當的規模進行，例如于層析柱內或生物芯片上。在另一個具體實施例中，本發明提供生物特異性的捕捉劑，可選擇性為純化的形式，特異性地與本發明的生物標記結合。在一個具體實施例中，生物特異性的捕捉劑是抗體。這些組合物適用于在如診斷的檢測分析中檢測生物標記。在另一個具體實施例中，本發明提供包括結合本發明生物標記的生物特異性捕捉劑的物品，其中補抓劑結合于固相上。舉例來說，本發明可考慮為包括衍生具有生物特異性捕捉劑的珠、芯片、膜、石料或微孔板的裝置。此等物品用于生物標記的檢測分析。另一個本發明的態樣提供包括結合至本發明生物標記如抗體的生物特異性捕捉劑的組合物，所述組合物可選擇地為純化的形式。這些組合物適用于純化生物標記或用于檢測生物標記的分析。在另一個具體實施例中，本發明提供包括固體基質的物品，其中如層析吸附劑或生物特異性捕捉劑的吸附劑附著于固體基質上，本發40明的生物標記進一步結合于所述吸附劑上。在一個具體實施例中，物品為用于質譜分析的生物芯片或探針，例如SELDI探針。這些物品用于純化或檢測生物標記。8.檢測前列腺癌生物標記的試劑盒在另一個態樣中，本發明提供鑒別前列腺癌狀態的試劑盒，用于檢測根據本發明的生物標記。在一個具體實施例中，試劑盒包括固相載體，例如芯片、微孔板或珠或具有捕捉劑附著其上的樹脂，其中捕捉劑結合本發明的生物標記。因此，舉例來說，本發明的試劑盒可包括用于SELDI的質譜分析探針，例如？1^^^011數組。在生物特異性捕捉劑的例子中，試劑盒可包括具有反應表面的固相載體，以及包括生物特異性捕捉劑的容器。試劑盒也可包括清洗溶液或配制清洗溶液的指導說明，其中捕捉劑和清洗溶液的組合允許在固相載體上捕捉一種或多種生物標記供后續通過如質譜分析的檢測。試劑盒可包含多種的吸附劑，每一種表現于不同的固相載體上。在進一步的具體實施例中，試劑盒可包括巻標或分離夾頁形式適合操作參數的指導說明。例如，指導說明可告知顧客關于如何收集樣本、如何清洗探針或被檢測的特定生物探針。在又另一個具體實施例中，試劑盒可包括一個或多個具有作為校正用標準物的生物標記樣本的容器。9.前列腺癌生物標記于篩選分析中的使用以及治療前列腺癌的方法本發明的方法也有其它的應用。例如，生物標記可用于篩選調節生物標記于活體外或活體內表達的化合物，此化合物隨后可用于治療或預防病人的前列腺癌。在另一個實例中，生物標記可用于監控對治療前列腺癌的反應。在又另一個實例中，生物標記可用于遺傳研究，以確定受測對象是否具罹患前列腺癌的風險。因此，舉例來說，本發明的試劑盒可包含具有疏水功能的固體基質，如蛋白質生物芯片(如CiphergenH50蛋白質芯片(ProteinChip)數組，如蛋白質芯片(ProteinChip)數組)，和清洗基質的醋酸鈉緩沖液，以及提供于芯片上測定本發明生物標記和使用測定診斷前列腺癌的指導說明。通過識別與一種或多種表I所列的生物標記反應的化合物，初步篩選出適用于治療測試的化合物。經由實例說明，篩選可包含重組表達表I所列的生物標記、純化此生物標記，以及附著此生物標記于基質上。測試化合物隨后與基質通常于水性條件下接觸，測試化合物與生物標記間的相互作用通過如測量洗提率作為鹽濃度的函數。特定蛋白質可辨識并裂解表I的生物標記，在這種情況下，蛋白質可通過在標準分析中監控一種或多種生物標記的消化而檢測，例如通過蛋白質凝膠電泳。在一個相關的具體實施例中，可測定測試化合物抑制表I中生物標記活性的能力。熟習本領域的技術人員將知道用于測定特定生物標記活性的技術將取決于生物標記的功能和性質而有所不同。舉例來說，若可取得適當的基質，并且基質的濃度或反應產物出現可容易測定時，可測試生物標記的酶活性。通過測定測試化合物存在或不存在的催化速率，可確定潛在治療測試化合物抑制或增強所指定生物標記活性的能力。測試化合物干擾表I生物標記的其中之一的非酶(例如結構的)功能或活性的能力也可被測定。舉例來說，可于測試化合物存在或不存在的情況下通過光譜分析監控包含表I生物標記的其中之一的多蛋白復合物的自組裝。另外，若生物標記是轉錄的非酶增強子，則可通過在活體內或活體外測試化合物存在或不存在時測定生物標記依賴轉錄的水平而識別干擾生物標記增強轉錄的能力的測試化合物。可調控表I生物標記活性的測試化合物可施予患有或有發展為前列腺癌或其它癌癥風險的病人。舉例來說，若于活體內特定生物標記的活性防止前列腺癌的蛋白質累積，則施予增加特定生物標記活性的測試化合物可降低病患罹患前列腺癌的風險。相反地，若生物標記增強的活性至少部分導致前列腺癌的起始，則施予降低特定生物標記活性的測試化合物可降低罹患前列腺癌的風險。在另一種態樣中，本發明提供識別適于治療如前列腺癌病癥的化合物的方法，所述前列腺癌與修飾形式PCI升高的水平相關。舉例來說，在一個具體實施例中，催化將完整長度的PCI裂解形成截斷形式的PCI的化合物可以細胞萃取物或表達庫進行篩選。在此篩選分析的具體實施例中，可通過附著熒光物于PCI而檢測PCI的裂解，其中熒光物于PCI未裂解時保持淬火，而于蛋白裂解時則發出熒光。另外，完整長度的PCI變體經修飾，使得在氨基酸X和Y間的酰胺鍵不可裂解，可將其用于選擇性結合或「困住」可于活體內此位置裂解完整長度PCI的細胞蛋白酶。篩選和識別蛋白酶及其目標物的方法已于科學文獻中完整地記錄，例如于Lopez-0tinetal.(NatureReviews,3:509-519(2002))。在又另一個具體實施例中，本發明提供治療或降低疾病進程或可能性的方法，例如與截斷的PCI水平增加相關的前列腺癌。舉例來說，于識別一種或多種可裂解完整長度PCI的蛋白質后，可于組合庫篩選抑制已識別蛋白質裂解活性的化合物。于化學庫篩選化合物的方法為本領域所公知的技術。參閱如Lopez-0tinetal.(2002)。另外，可基于PCI的結構明智地設計抑制性化合物。N端截斷的PCI被認為減少PCI的蛋白酶抑制活性。參閱如Abrahamsonetal.(Biochem.J.273:621-626(1991))。因此，給予具完整PCI功能的截斷PCI的化合物可能可用于治療如前列腺癌的病癥，因前列腺癌與截斷形式的PCI相關。因此，在進一步的具體實施例中，本發明提供識別增強截斷PCI對其目標蛋白酶親和性的化合物的方法。舉例來說，化合物可經由給予截斷的PC工完成長度PCI蛋白酶抑制活性的能力進行篩選。能調控PCI的抑制活性或與PCI反應的分子活性的測試化合物，可隨后于活體內測試其減緩或停止受測對象中前列腺癌發展的能力。在臨床階段，篩選測試化合物包含在受測對象接受測試化合物前與后從受測對象取得樣本。樣本中表I所列生物標記的水平可被測定與分析，以確定在接觸測試化合物后生物標記的水平是否變化。樣本可通過本文所述的質譜分析進行分析，或樣本可通過任何
技術領域：
所公知的適當方法進行分析。舉例來說，表I所列生物標記的水平可直接通過使用特異性結合生物標記的放射性或熒光標記抗體的西方墨點法測定。另外，可測定編碼一種或多種生物標記的mRNA的水平變化，并且將其與施予受測對象所給定的測試化合物相關聯化。在進一步的具體實施例中，一種或多種生物標記表達水平的變化可通過活體外的方法與材料測得。舉例來說，表達或能表達一種或多種表I生物標記的人類組織培養細胞可與測試化合物接觸。經測試化合物治療的受測對象將被常規地檢查任何治療所導致的生理影響。特別地，測試化合物將以其于受測對象中降低疾病可能性的能力進行評估。另外，若將測試化合物施予已診斷為前列腺癌的受測對象，則測試化合物將以其減緩或停止疾病進程的能力進行篩選。10.實施例10.1.實施例l.前列腺癌生物標記的發現可以被理解的是，文中所述的實施例和具體實施例僅為例示的目的，本領域技術人員可經建議進行不同的修飾或變化，并且包含于本發明的精神和范圍內以及權利要求的范疇。所有的公開物、專利和專利申請都在此并入整體作為參考。實施例1蛋白C抑制劑的識別3890Da的蛋白質通過CM10數組在Q分餾6中被檢測。所提供的代表性圖譜通過公知已識別的蛋白質內部再度校正。目標蛋白質的平均分子量(來自7個光譜)經計算為3890.23Da(圖1)。3890Da的蛋白質存在于商業血清總庫(圖1，光譜"C")。重要地，相比于臨床樣本，商業血清幾乎沒有血小板因子4，其2價離子相當精確地與3890Da的蛋白質重疊。1ml商業血清在變性的條件下通過陰離子交換層析(QHyperDF)進行分餾。使用NP20數組的有機分餾圖譜確認3890Da蛋白質譜峰的存在(圖2)。餾分6進一步通過反相層析分餾。以40。/。ACN將3890Da的蛋白質從RPC珠上洗提(圖3)。在得到的制備物中無PF4的存在確認3890Da蛋白質譜峰是確實存在的蛋白質而并非2價離子(盡管我們不能排除在圖譜研究中2價的PF4離子可貢獻3890Da的蛋白質譜峰強度)。蛋氨酸在中性堿性的pH下為穩定的。然而，在酸性的pH下，則會受到顯著的氧化(CMIO和H50數組圖譜、反相層析，以及在ACN和TFA存在下膜分餾的切點等)。來自Q餾分6的3890Da蛋白質在富集的過程中可觀察到逐漸氧化(圖3和4)，表示候選的生物標記含有蛋氨酸。SDS-PAGE純化和Q-Fr.63890Da譜峰的直接測序對于來自1ml的血清收集量都是不可行的(圖3)。我對于起始物質的最低估計為20ml的參考血清或臨床樣本。在低于pH3以下沒有蛋白質可保持特異性地結合于陰離子交換樹脂(最酸的理論蛋白質EEEEEEEEEE和DDDDDDDD分別具有pi3.47和3.08)。從過去的計畫共同觀測為任何在餾分6中的蛋白質也可于其它與蛋白質pi匹配的Q餾分中被發現(并且在大多數情況下為很大量)。因此通過CM10數組將Q餾分圖譜化。的確，3890Da的譜峰可清晰地在Q-流出液中被檢測(圖5)。其自具有40%ACN的RPC珠上洗提，非常相似于Q-Fr.6"兄弟"(圖6)。Q-FT3890Da的蛋白質與Q_Fr.63890Da的蛋白質相似，在純化的過程中逐漸被氧化，表示其含有蛋氨酸(圖7)。3890Da的蛋白質直接通過Q-TOFMSMS分析(圖8、9)。使用Mascot搜索引擎直接進行數據庫搜索并不成功，因此，通過使用蛋白質探測者工具(ProteinProspectortool)手動解釋MSMS數據。使用最強離子無偏見搜索導致太多的候選物。然而，特定候選物，天然存在的血漿蛋白C抑制劑的C端肽最符合"手動"篩選的標準，如(1)生理相關性，(2)Met的數量，(3)活體內產生任何有意義的肽，(4)解釋個別離子m/z值的錯誤，(5)基于傾向于片段化的預測位點的離子推斷，(6)b和y離子的配對等(圖9-14)。通過使用全血清和抗蛋白C抑制劑抗體的以珠為基礎的免役分析直接確認3890Da蛋白質為暫定的候選物。參考文獻1.Suzuki,K.ProteinCinhibitor.MethodsEnzymol，222:385-399，1993.2.Glasscock,L.N.，Rehault，S.M.，Gregory,C.W.，Cooper，S.T.，Jackson，T.P.，Hoffman,M.，andChurch,F.C.ProteinCinhibitor(plasminogenactivatorinhibitor-3)expressionintheCWR22prostatecancerxenograft.ExpMolPathol，79:23-32，2005.3.Suzuki,K.，Deyashiki，Y.，Nishioka，J.，andToma，K.ProteinCinhibitor:structureandfunction.ThrombHaemost，61:337-342，1989.4.Suzuki,K.，Deyashiki，Y.，Nishioka,J".，Kurachi，K.，Akira，M.，Yamamoto，S.，andHashimoto,S.CharacterizationofacDNAforhumanproteinCinhibitor.Anewmemberoftheplasmaserineproteaseinhibitorsuperfamily.JBiolChem，262:611_616，1987.5.Suzuki,K.，Nishioka,J.，andHashimoto,S.ProteinCinhibitor.Purificationfromhumanplasmaandcharacterization.JBiolChem，258:163-168，1983.6.Cao，Y.，Becker,C，Lundwall，A.，Christensson，A.，Gadaleanu，V.，Lilja，H.,andBjartell,A.ExpressionofproteinCinhibitor(PCI)inbenignandmalignantprostatictissues.Prostate,57:196-204，2003.7.Clauss，A.，Lilja，H.，andLundwall，A.Alocusonhumanchromosome20containsseveralgenesexpressingproteaseinhibitordomainswithhomologytowheyacidicprotein.BiochemJ，368:233—242，2002.8.Strandberg，K.，Kjellberg，M.，Knebel，R.，Lilja，H.，andStenflo,J.AsensitiveimmunochemicalassayformeasuringtheconcentrationoftheactivatedproteinC-proteinCinhibitorcomplexinplasma:useofacatcherantibodyspecificforthecomplexed/cleavedformoftheinhibitor.ThrombHaemost，86:604-610，2001.9.Christensson，A.andLilja，H.ComplexformationbetweenproteinCinhibitorandprostate-specificantigeninvitroandinhumansemen.EurJ"Biochem，220:45—53，1994.10.Laurell，M.，Christensson，A.，Abrahamsson，P.A.，Stenflo，J.，andLilja，H.ProteinCinhibitorinhumanbodyfluids.Seminalplasmaisrichininhibitorantigenderivingfromcellsthroughoutthemalereproductivesystem.J"ClinInvest,89:1094-1101，1992.11.Otlewski，J.，Jelen，F.，Zakrzewska，M.,andOleksy,A.Themanyfacesofprotease—proteininhibitorinteraction.EmboJ，24:1303-1310，2005.權利要求1、一種用于鑒別受測對象中的前列腺癌狀態的方法，包括(a)測量來自所述受測對象生物樣本中的PCI生物標記；以及(b)將所述測量與前列腺癌的狀態進行關聯化。2、如權利要求1所述的方法，其中，所述前列腺癌的狀態通過Gleason評分確定。3、如權利要求l所述的方法，其中，生物標記C4a也在從所述相同受測對象的相同生物樣本中測量。4、一種確定前列腺癌復發機率的方法，包括(a)測量來自所述受測對象生物樣本中的PCI和C4a生物標記；以及(b)將所述測量與前列腺癌的復發進行關聯化。5、如權利要求1所述的方法其中，所述PCI生物標記通過在SELDI探針的吸附劑表面上捕捉所述生物標記，并且通過激光解吸-離子化質譜檢測所述已捕捉的生物標記來測量。6、"，權利要求1所述的方法，其中，所述PCI生物標記通過免疫7、如權利要求l所述的方法，其中，所述樣本是血清。8、如權利要求l所述的方法，其中，所述關聯化通過軟件分類算法完成。9、如權利要求l所述的方法，其中，前列腺癌的狀態選自前列腺癌和非前列腺癌。10、如權利要求1所述的方法，其中，前列腺癌的狀態選自使用Gleason評分為早期的1分和晚期的5分。11、如權利要求l所述的方法，進一步包括(c)基于所述狀態處理受測對象的治療。12、如權利要求5所述的方法，其中，所述吸附劑是IMAC銅吸附13、如權利要求5所述的方法，其中，所述吸附劑是生物特異性吸附劑。14、如權利要求1所述的方法，其中，若所述測量與前列腺癌相關聯，則處理受測對象的治療包括向所述受測對象施加PCI拮抗劑。15、如權利要求l所述的方法，進一步包括(d)在處理受測對象后，測量至少一種所述生物標記以及將所述測量與疾病進程進行關聯化。16、一種用于確定前列腺癌過程的方法，包括(a)在第一時間，測量來自所述受測對象生物樣本中的PCI生物標記；(b)在第二時間，測量來自所述受測對象生物樣本中的PCI生物標記；以及(c)比較所述第一測量和第二測量；其中，所述比較的測量決定前列腺癌的過程。17、一種組合物，包括經純化的PCI。18、一種組合物，包括特異性結合PCI的生物特異性捕捉劑。19、如權利要求18所述的組合物，其中，所述生物特異性捕捉劑是抗體。20、如權利要求18所述的組合物，其中，所述生物特異性捕捉劑結合于固相載體。21、一種組合物，包括結合于PCI的生物特異性捕捉劑。22、一種試劑盒，包括(a)固相載體，包括至少一種附著其上的捕捉劑，其中，所述捕捉劑與PCI結合；以及(b)使用所述固相載體檢測PCI的指導說明。23、如權利要求22所述的試劑盒包括使用所述固相載體檢測PCI的指導說明。24、如權利要求22所述的試劑盒包括使用所述固相載體檢測PCI的指導說明。25、如權利要求21、22或23中任一項所述的試劑盒，其中，所述包括捕捉劑的固相載體是SELDI探針。26、如權利要求21、22或23中任一項所述的試劑盒，其中，所述捕捉劑是IMAC銅吸附劑。27、如權利要求21、22或23中任一項所述的試劑盒，還包括(c)含有所述PCI生物標記的容器。28、如權利要求21、22或23中任一項所述的試劑盒，還包括(c)免疫特異性的層析吸附劑。29、一種試劑盒，包括(a)固相載體，包括至少一種附著其上的捕捉劑，其中，所述捕捉劑與PCI結合；以及(b)含有所述PCI生物標記的容器。30、如權利要求26所述的試劑盒，還包括(c)免疫特異性的層析吸附劑。31、一種軟件產品，包括a.存取屬于樣本的數據的編碼，所述數據包括在所述樣本中PCI生物標記的測量；以及b.執行分類算法的編碼，所述分類算法依照測量的函數分類所述樣本的前列腺癌狀態。32、如權利要求31所述的軟件產品，其中，所述分類算法依照生物標記PCI測量的函數分類所述樣本的前列腺癌狀態。33、如權利要求31所述的軟件產品，其中，所述分類算法進一步依照分子量測量的函數分類所述樣本的前列腺癌狀態。34、一種方法，包括通過質譜測定或免疫測定來檢測所述生物標記PCI。35、一種方法，包括向受測對象傳達與前列腺癌狀態相關的診斷，所述前列腺癌狀態通過來自所述受測對象生物樣本中的生物標記關聯化來確定，其中，所述生物標記選自由PCI和C4a所組成的群組。36、如權利要求35所述的方法，其中，所述診斷通過計算機產生的媒體向所述受測對象傳達。37、一種用于識別與PCI相互作用的化合物的方法，其中，所述方法包括a)將PCI與測試化合物接觸；以及b)確定所述測試化合物是否與PCI相互作用。38、一種用于調節細胞中PCI濃度的方法，其中，所述方法包括a)將所述細胞與抑制PCI表達的小分子接觸。39、一種治療在受測對象中狀態的方法，其中，所述方法包括向受測對象施加治療上有效劑量的小分子，其中，所述小分子抑制PCI的表達。40、如權利要求39所述的方法，其中所述狀態是前列腺癌。全文摘要本發明提供以蛋白質為基礎的生物標記，也就是蛋白C抑制劑(PCI)，用于鑒別病人的前列腺癌狀態。特別地，本發明的生物標記用于分類受測樣本為前列腺癌或非前列腺癌。生物標記可通過SELDI質譜分析檢測。文檔編號G01N33/53GK101310185SQ200680042935公開日2008年11月19日申請日期2006年9月19日優先權日2005年9月19日發明者C·N·羅森茨魏希,D·W·陳,Z·張申請人:約翰·霍普金斯大學