適于多重pcr反應的南瓜ssr標記引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學DNA標記技術領域，具體涉及一組適于多重PCR反應的南 瓜SSR標記引物，本發明還涉及該引物在南瓜品種鑒定上的應用及一種南瓜品種鑒定方 法。
【背景技術】
[0002]簡單序列重復（simple sequence repeat, SSR)是指基因組上存在的l_6bp長度 的堿基串聯重復序列，因為重復次數的不同而在不同個體間表現出多態性。簡單重復序列 已經被廣泛地用于開發SSR標記。SSR標記因具有多態性高、重復性好、呈共顯性遺傳和在 基因上覆蓋范圍等優點，而被廣泛地用于遺傳圖譜的構建、基因定位和品種鑒定等領域。
[0003] SSR標記是一種序列特異性標記，開發SSR標記必須事先知道SSR位點及其側翼的 DNA序列，然后根據側翼序列設計擴增產物包含SSR位點的引物對，之后再檢查該擴增產物 在不同基因型個體之間的變異，即多態性。因此，SSR標記具有物種特異性，即不同物種之 間的SSR標記多數情況下都不能通用，對于不同物種而言，SSR標記需要單獨開發。
[0004]南瓜是一種主要的萌蘆科蔬菜作物，分為食用南瓜、籽用南瓜、砧用南瓜和飼料用 南瓜等，用途廣泛，經濟價值高。目前公開報道的南瓜的SSR標記數量非常有限，尚不能滿 足南瓜分子標記輔助選擇育種的需要。
[0005] SSR標記分析步驟通常包括以下幾步：提取樣品DNA ;使用SSR標記引物對樣品 DNA進行PCR擴增；擴增產物用變性或者非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；電泳完成后用銀 染法對聚丙烯酰胺凝膠進行染色；照相記錄結果。由于聚丙烯酰胺制膠、電泳和染色耗時較 長，而且每次只能檢測一對引物，這些不足顯著地降低了 SSR分析的效率。
[0006] 多重PCR (multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一 PCR反應體 系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。利用多重PCR方法在一次 PCR反應中擴增多個SSR位點，可以顯著地提高SSR標記分析的效率，降低實驗成本。但由 于不同引物對在同一個PCR反應中會存在相互干擾導致PCR擴增失敗，以及擴增產物增多 導致結果讀取困難等不利因素的存在，導致建立SSR標記的多重PCR技術十分困難。因此， 開發能用于多重PCR反應的SSR標記及其相應的PCR擴增技術體系將顯著提高SSR標記的 分析效率。

【發明內容】

[0007] 本發明利用南瓜轉錄組測序結果，開發了3個多態性高、擴增產物長度差異大、在 同一個PCR反應中不相互干擾的南瓜SSR標記，并通過優化PCR擴增體系和程序，建立了包 含以上3個SSR標記的多重PCR反應體系，將之用于南瓜品種鑒定，能顯著提高SSR標記的 分析效率，降低分析成本。
[0008] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：對來自兩份南瓜種質材料的轉錄組 測序結果進行分析，鑒定出SSR位點；利用Primerf Plus軟件設計SSR位點側翼引物；利用 61個南瓜商業品種驗證SSR位點的多態性；篩選多態性高、PCR擴增質量高、產物大小差異 大的3組SSR標記引物進行多重PCR反應；優化PCR反應體系和擴增程序，獲得穩定的南瓜 SSR標記的多重PCR技術體系并用于檢測南瓜品種間的遺傳差異。
[0009] 所述的3組SSR標記引物為：
[0010] 第一組引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:l所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2 所示；
[0011] 第二組引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID N0:4 所示；
[0012] 第三組引物，其正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6 所示。
[0013]所述的 PCR 擴增體系為：總體積 25yL，含有 lXbuffer，2.4yM MgCL2,240 yM dNTPs，0.6U Taq酶，三組引物的正、反向引物各0.16yM，30ng DNA。
[0014] 所述的PCR擴增程序為：94°C預變性5min;94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延 伸1!^113〇8,34個循環；721：延伸1〇111111;41：保存。
[0015] 本發明的特點在于：利用自有的南瓜轉錄組測序結果開發了新的南瓜SSR標記， 通過選擇和技術體系優化，利用這些標記建立起了一個包含3個SSR標記的高質量的多重 PCR技術體系。
[0016] 本發明的優點是：
[0017] (1)高效性。首先，本發明可以在一個PCR反應中對3個SSR位點進行分析，與傳 統SSR標記分析方法相比，效率提高了3倍。此外，本發明選擇的SSR標記經過實驗驗證都 有非常尚的多態性，因此，可以進一步提尚南瓜品種鑒定的效率。
[0018] (2)可靠性。首先，本發明先對單個SSR標記進行了選擇，保證多態性高、擴增質量 好和滿足多重PCR技術要求，然后再進行多重PCR實驗，并進一步地優化了多重PCR的反應 體系和擴增程序，建立了穩定的多重PCR技術體系。其次，本發明選擇的3個SSR標記的擴 增產物長度差異大，讀取結果非常方便，從而進一步保證了結果的準確性。
[0019] (3)實用性。本發明是基于常規的SSR實驗技術體系建立的，不需要額外的設備或 儀器條件，非常容易實現。其次，本發明還可用于南瓜品種指紋圖譜構建、雜種純度鑒定等 方面，具有廣泛的適用性。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :LySSR01標記在不同南瓜品種上的的擴增帶型圖。
[0021] 圖2 :LySSR90標記在不同南瓜品種上的的擴增帶型圖。
[0022] 圖3 :LySSR131標記在不同南瓜品種上的的擴增帶型圖。
[0023] 圖4 :LySSR131，LySSR90和LySSROl的3個SSR標記的多重PCR對南瓜品種的擴 增帶型圖。
【具體實施方式】[0024] 實施例1
[0025] (l)SSR位點選擇：發明人對2份南瓜材料的根進行取樣，并送交華大公司進行轉 錄組測序，測序結果報告中包含了 SSR位點預測，從中選取測序質量高的SSR位點所在的序 列進行SSR位點多態性的驗證；
[0026] (2)引物設計：用Primer3 Plus軟件設計SSR位點兩側引物。引物設定參數為： 引物最適長度20bp，退火溫度58°C，擴增產物大小100bp-300bp。
[0027] (3)南瓜材料和DNA提取：從市場上購買61個不同的商業南瓜品種，采用CTAB法 提取南瓜葉片總DNA。用Nanodrop2000 (Thermo公司生產）檢測提取DNA的濃度和純度，將 A260與A280比值大于1. 8的高質量DNA樣本，稀釋成10ng/uL工作液，用于PCR擴增。
[0028] (4)PCR擴增和電泳：PCR反應的總體積為10yL，含有1 x Buffer，2mM MgCl2， 200 yM dNTPs，0.2yM 引物，0.5UTaq酶，20ng DNA。PCR 反應程序為：94°C5min;94°C30s， 55°C 30s，72°C 45s，35個循環；72°C 5min ;12°C保存。PCR反應產物采用8%非變性PAGE膠 檢測，電泳在DYCZ-30型電泳儀（北京市六一儀器廠產品）上進行，以120V恒壓電泳2h，銀 染染色。
[0029] (5)單個SSR位點的選擇：根據步驟⑷的結果，選擇多態性高、帶型好、擴增產物 大小差異在50bp左右的SSR位點，再對這些SSR位點的引物進行序列分析，排除能相互配 對和形成發卡結構SSR位點，最終確定3個SSR位點用于多重PCR分析。3個SSR位點的編 號分別為 LySSR01、LySSR90 和 LySSR131。LySSROl 所在的 Contig30 序列見 SEQ ID NO. 7， LySSR90 所在的 Contig22297 序列見 SEQ ID NO. 8, LySSR131 所在的 Contig30734 序列見 SEQ ID NO. 9。LySSRO 1、LySSR90 和 LySSRl31 標記的引物序列及 SSR 基序等見表 1。LySSRO 1 標記在其中17個不同南瓜品種上的的擴增電泳圖見圖l，LySSR90標記在其中17個不同南 瓜品種上的的擴增電泳圖見圖2，LySSR131標記在其中17個不同南瓜品種上的的擴增電泳 圖見圖3。圖中M表不分子量標記，1-17的編號表不隨機選擇的17個南瓜品種。從圖1-3 可以看出，所選擇的3個SSR標記不僅多態性高，而且擴增帶型好。
[0030] 表1 SSR標記的引物序列及重復基序和擴增片段大小
【主權項】
1. 適于多重PCR反應的南瓜SSR標記引物，其特征在于：所述引物共有三組，分別為： 第一組引物，其正向引物序列如SEQIDNO: 1所示，反向引物序列如SEQIDNO:2所 示； 第二組引物，其正向引物序列如SEQIDNO: 3所示，反向引物序列如SEQIDNO:4所 示； 第三組引物，其正向引物序列如SEQIDN0:5所示，反向引物序列如SEQIDN0:6所示。
2. 權利要求1所述的適于多重PCR反應的南瓜SSR標記引物在南瓜品種鑒定上的應 用。
3. -種南瓜品種鑒定方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 提取南瓜樣品的DNA; 2) 用南瓜SSR標記引物對提取的DNA進行PCR擴增； 3) 用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟2)的擴增產物； 4) 根據擴增產物帶型組合的差異對南瓜品種進行鑒定， 步驟2)中所述的南瓜SSR標記引物共有三組，適于多重PCR反應，所述引物分別為： 第一組引物，其正向引物序列如SEQIDNO: 1所示，反向引物序列如SEQIDNO:2所 示； 第二組引物，其正向引物序列如SEQIDNO: 3所示，反向引物序列如SEQIDNO:4所 示； 第三組引物，其正向引物序列如SEQIDN0:5所示，反向引物序列如SEQIDN0:6所示。
4. 根據權利要求3所述的南瓜品種鑒定方法，其特征在于：步驟2)中的PCR擴增體系 為：總體積25yL，含有lXbuffer，2?4yMMgCL2,240yMdNTPs，0?6UTaq酶，三組引物的 正、反向引物各〇? 16yM，30ngDNA。
5. 根據權利要求3所述的南瓜品種鑒定方法，其特征在于：步驟2)中的PCR擴增程序 為：94°C預變性 5min;94°C變性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸Imin30s，34 個循環；72°C 延伸IOmin;4°C保存。
【專利摘要】本發明公開了三組適于多重PCR反應的南瓜SSR標記引物，屬于植物分子生物學DNA標記技術領域，本發明還公開了所述引物在南瓜品種鑒定上的應用及一種南瓜品種鑒定方法。本發明利用南瓜轉錄組測序結果，開發了一批南瓜SSR標記，從這些標記中選擇出3個多態性高、帶型好、擴增產物大小差異在50bp左右、引物之間不能相互配對和形成發卡結構SSR位點，通過對PCR反應體系和擴增程序的優化，建立了3個SSR位點的多重PCR分析技術體系。該SSR標記的多重PCR擴增帶型好、多態性高、結果易讀，顯著提高了SSR的分析效率，可以用于南瓜品種鑒定、指紋圖譜構建和雜種純度鑒定等領域。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104694642
【申請號】CN201510087268
【發明人】別之龍, 孔秋生, 劉勇, 孫士濤, 劉朋
【申請人】華中農業大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月25日