專利名稱：：卵巢癌的生物標記的制作方法卵巢癌的生物標記相關申請本發明相關于2005年6月24日申請的美國臨時申請案第60/693,755號和2006年3月22日申請的美國臨時申請案第60/785,031號，這兩案所揭示的技術并入本文作為參考。
技術領域：
：本發明一般是關于臨床診斷法，且特別是，關于卵巢癌的臨床診斷法。技術背景在發達國家中，卵巢癌為最致命婦科惡性腫瘤的一種。光在美國，每年就有大約23，000名婦女被診斷患有所述疾病，其中有接近14，000名婦女因此死亡(Jamal,"s丄，^Cs/car/67_z、5^^47Y^^")。盡管癌癥療法有進展，卵巢癌死亡率在過去二十年(同上)實際上保持不變。由于診斷卵巢癌的階段越早、存活的可能性迅速升高，因此早期偵測仍然是提升卵巢癌病患長期存活可能性的最重要因素。晚期診斷出來的卵巢癌的預后差、與確診過程有關的費用和風險性、及其于一般民眾人口中相對低的普遍率，這些共同造成對于一般民眾卵巢癌篩檢測試的敏感度和特異性有非常嚴苛的要求。適用于癌癥早期偵測和診斷的腫瘤標記的識別，對于改善病患的臨床結果具有很大前景。對于病征模糊或沒有病征或對于物理偵測相對無法達到的腫瘤的病患來說尤為重要。雖然在早期偵測上付出大量努力，但是目前還沒有一種花費經濟的篩檢方法(Paley,C""，QwVK13(5):399402(2001))，而且診斷時婦女通常表現為已播散疾病(disseminateddisease)。(Ozolset3丄，Epithelialovariancaner.In:HoskinsWJ",PerezCA，YoungRC，editors.PrinciplesandPracticeofGynecologicOncology.3rded.Philadelphia:Lippincott，WilliamsandWilkins;p981—1057(2000))。CA125是最具特征的腫瘤標記，其在大約30至40%的第I階段卵巢腫瘤中為陰性的，而且在許多良性疾病中它的水平提高(Meyerds丄，/Ca/7cer，82(9):1535—8(2000);Buamah，/5"〃i^.6^co丄，75(4):264-5(2000);Tuxeneta丄，Cs/3cerZreaL7fe7.，21(3):215-45(1995))。由于CA125的低敏感度和特異性使得它作為以大眾為基礎的篩檢工具以早期偵測和診斷卵巢癌之功用受阻(MacDonaldets_Z.，fwr./OZ^tet.f7"eccJ7e/ix^.，82(2):155-7(1999);Jacobsets丄，#鵬.7fe/rw/.，4(1):1-12(1989);Shihets丄，Tumormakersinovariancancer,Diamandis，Fritsche，Lilja，Chan，andSchwartz,editor;Tumormarkersphysiology,pathobiology，technologyandclinicalapplications,Philadelphia:AACCPress;inpress)。雖然盆骨超音波以及最近的陰道超音波已用于篩檢高風險病患，但其兩者技術應用于一般民眾都不具足夠敏感度和特異性(MacDonald，如前)。最近在癌癥模型的風險度縱向評估中(Skates"a丄，Cs/7cer，76U。:2004-10(1995))組合使用CA125與其它腫瘤標記(Woolasds丄，/.淑j'謹2c雄er/"st.，85(21):1748-51(1993);Woolass丄，^Teco丄^co丄，59(1):111—6(1995);Zhanga_Z"6y"eco丄。腳丄，73(1):56-61(1999);Zhange"丄，UseofMultipleMarkerstoDetectStageIEpithelialOvarianCancers:NeuralNetworkAnalysisImprovesPerformance,AmericanSocietyofClinicalOncology(2001);An廳lMeeting,Abstract),并且助、同使用超音波作為第二線試驗(Jacobsds丄，^r.#e^./.，306(6884):1030—34(1993);Menons丄，^rj'&'s力/cw/77s〗必We^j'cs朋J6>77eco/o^r，107(2):165-69(2000))表明，在提升整體試驗特異性得到很好的結果，而特異性對于具相對低普遍性的疾病(例如卵巢癌)為關鍵性指標。由于晚期卵巢癌令人失望的預診斷，普遍認為主治醫師將會接受積極預測值在至少1Cm的試驗結果(Bastds丄，"/7cer7yesfoz朋ts/^7fesesrc力，107:61-97(2002))。將所述試驗擴展到更廣泛的族群，則一般篩檢試驗將需要敏感度為大于70%及特異性為99.6%。目前沒有一種現有的血清學標記，例如CA125、CA72-4或M-CSF，單獨地產生上述的功效(BastT/t/船i^ers，13:179-87(1998))。因此，需要有新穎血清學上的生物標記，其單獨地或與其它標記或診斷型物理療法組合，以給予早期偵測卵巢癌所需要的敏感度和特異性(Bastetal.，Earlydetectionofovariancancer:promiseandreality,OvarianCancer:ISISMedicalMediaLtd.,Oxford,UK(2001),inpress)。若沒有可接受的篩檢試驗，早期偵測仍然是改善患有卵巢癌病患長期存活最關鍵的因素。因此，需要有可靠且準確測量病患卵巢癌狀態的方法，然后其結果可用于處理受驗者治療。
發明內容本發明通過提供新穎的生物標記及對診斷卵巢癌有用的生物標記的組合物，以及使用所述多個生物標記來診斷卵巢癌的方法及試劑盒以滿足上述這些需求。更特別的是，在一個態樣中，本發明提供定性受驗者卵巢癌狀態的方法，包括(a)測量取自受驗者樣本中的至少一種生物標記，其中所述的至少一種生物標記選自表1、表3及表4所組成的群組;及(b)關聯測量與卵巢癌狀態。在一個具體實施例中，所述的至少一種生物標記選自下列所組成的群組ApoCl、血紅蛋白a/e、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A、鈣周期蛋白、轉甲狀腺素蛋白(transthyretin)(雙電荷)及IgG重鏈。在另外的具體實施例中，所述的方法包括測量各種ApoCl、血紅蛋白a/e、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A、鈣周期蛋白、轉甲狀腺素蛋白及IgG重鏈。在另外的具體實施例中，所述的方法進一步包括測量卵巢癌的一些其他已知生物標記，例如CA125。在另外的具體實施例中，所述的方法進一步包括測量卵巢癌的一些其他己知生物標記，例如CA125。在進一步的具體實施例中，所述的方法進一步包括測量及關聯至少一種選自下列群組所組成的生物標記CA125、轉鐵蛋白(transferrin)、結合珠蛋白(haptoglobin)、ApoAl、轉甲狀腺素蛋白、ITIH4內部片段、02-微球蛋白、抗菌多肽(h印cidin)、波思塔亭(prostatin)、骨橋素(osteopontin)、嗜酸性粒細胞衍生的神經毒素(esoinophil-derivedneurotoxin)、瘦素(l印tin)、催乳素(prolactin)、IGF-II、血紅蛋白及它們的修飾型式。在又一另外的具體實施例中，所述的方法進一步包括CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA195、腫瘤相關胰蛋白酶抑制因子(TATI)、CEA、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、唾液酸TN(SialylTN)、半乳糖轉化酶、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF、CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生長因子受體細胞外區域110kD部分(pll0EGFR)、組織激肽釋放酶原(kallikreins)，例如激肽釋放酶6和激肽釋放酶10(NES-1)、絲氨酸蛋白水解酶(prostasin)、HE4、肌酸激酶B(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽(UGP)、DianonNB70/K、組織肽抗原(TPA)、SMRP、骨橋素和結合珠蛋白、瘦素、催乳素、類胰島素生長因子I及類胰島素生長因子II。也可使用本發明的其他方法、試劑盒及軟件來測量及關聯這些額外的生物標記。在上述方法的一個具體實施例中，所述的至少一種生物標記通過在SELDI探針的吸附劑表面上捕獲所述生物標記及通過激光解吸-電離質譜法來偵測所獲補的生物標記而測量。在另外的具體實施例中，所述的至少一種生物標記通過免疫分析法測量。當已知所述生物標記的身分時，所述方法的后者是特別有用的。在一個具體實施例中，樣本為卵巢囊腫液。在相關的具體實施例中，吸附劑為選自下述群組所組成的成員疏水性吸附劑、離子交換吸附劑、陽離子交換吸附劑及金屬螯合物吸附劑。在又一另外的具體實施例中，所述吸附劑為陽離子交換吸附劑。在另外的具體實施例中，本發明的生物標記通過不同于質譜法或是不同于依賴測量所述生物標記的質量的方法來測量。例如，在某些具體實施例中，此發明的生物標記通過免疫分析法來測量。如指示，上述方法是針對定性卵巢癌狀態。在一個具體實施例中，通過軟件分類演算法進行關聯。一般來說，在本發明的方法中，卵巢癌狀態選自良性卵巢疾病、低惡性潛能卵巢癌、卵巢癌(惡性)及其他惡性病癥。在一個具體實施例中，卵巢癌狀態選自良性卵巢疾病及與卵巢癌(惡性)及其他惡性病癥相對的低惡性潛能卵巢癌。在另外的具體實施例中，卵巢癌狀態是選自與良性卵巢疾病相對的低惡性潛能卵巢癌、卵巢癌(惡性)及其他惡性病癥。在又一個具體實施例中，卵巢癌狀態排除良性卵巢疾病的可能性。在又另外一個具體實施例中，卵巢癌狀態排除卵巢癌(惡性)及其他惡性病癥的可能性。在另外的具體實施例中，本文所述偵測生物標記及關聯測量與卵巢癌狀態的方法進一步包括基于所述狀態處理受驗者治療。在相關的具體實施例中，若所述測量與卵巢癌為關聯，則處理受驗者治療包括投予化學治療劑到所述受驗者。在另外的具體實施例中，所述方法進一步包括在受驗者處理后測量至少一種生物標記以及關聯該測量與疾病發展，包含決定疾病發展的速率。本發明也提供一種包括測量來自受驗者的樣本的至少一種生物標記的方法，其中，所述至少一種生物標記選自表l、表3及表4的生物標記所組成的群組。本發明另外的具體實施例提供一種決定卵巢癌過程的方法，包括(a)第一次測量來自受驗者的生物樣本中的至少一種生物標記，其中，所述至少一種生物標記選自表1、表3及表4的生物標記所組成的群組；及(b)第二次測量來自受驗者的生物樣本中的至少一種生物標記；及(C)比較第一次測量與第二次測量；其中，所比較的測量決定所述卵巢癌的過程。在又一個具體實施例中，所述至少一種生物標記選自下列所組成的群組ApoCl、血紅蛋白a/e、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈。在進一步具體實施例中，所述方法包括測量各種下列生物標記ApoCl、血紅蛋白a/p、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈。在相關的具體實施例中，所述方法包括額外地測量CA125。在再一個具體實施例中，所述至少一種生物標記選自下列所組成的群組ApoCl、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、鈣粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)。在另外的具體實施例中，所述方法包含測量各種ApoCl、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、鈣粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)。在另外的具體實施例中，所述方法進一步包括測量卵巢癌的某些其他已知生物標記，例如CA125。除此處所述方法外，本發明也提供一種包括選自表l、表3及表4的生物標記的純化的生物分子的組合物。在另外的具體實施例中，本發明提供一種包括生物特異性捕獲試劑，例如抗體的組合物，所述生物特異性捕獲試劑特異性結合一種選自表K表3及表4的生物標記的生物分子。在相關的具體實施例中，所述生物特異性捕獲試劑結合至固體載體。在又一具體實施例中，本發明提供一種包括生物特異性捕獲試劑的組合物，所述生物特異性捕獲試劑結合至一種表l、表3及表4的生物標記。在其他的具體實施例中，本發明提供試劑盒。例如，在一個具體實施例中，本發明提供一種試劑盒，包括(a)固體載體，包括附著至其上的至少一種捕獲試劑，其中，所述捕獲試劑結合選自表1、表3及表4的生物標記所組成的第一群組的至少一種生物標記；及(b)使用所述固體載體來偵測表1、表3及表4的一種生物標記的說明書。在相關的具體實施例中，所述的試劑盒進一步包括使用所述固體載體來偵測選自下列所組成群組的一種生物標記ApoCl、血紅蛋白ci/i3、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈的說明書。在另外的具體實施例中，所述試劑盒包括使用所述固體載體來偵測下列各種生物標記ApoCl、血紅蛋白a/|3、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈的多個說明書。在又一具體實施例中，所述試劑盒進一步包括使用所述固體載體來偵測CA125的說明書。于再一個相關的具體實施例中，所述試劑盒包括使用所述固體載體來偵測選自下列所組成群組的至少一種生物標記ApoCl、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、鈣粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)的多個說明書。在另外的具體實施例中，所述試劑盒包括使用所述固體載體來偵測下列各種生物標記ApoCl、ApoAII、ApoCI工、鈣粒蛋白A、鈣粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)的多個說明書。在另外的具體實施例中，所述試劑盒包括使用所述固體載體來偵測卵巢癌的某些其他已知生物標記的多個說明書，例如CA125。在另外的相關具體實施例中，所述試劑盒的所述固體載體包括為SELDI探針的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑為疏水性吸附劑、陰離子交換吸附劑、陽離子交換吸附劑及金屬螯合物吸附劑。在又一具體實施例中，所述試劑盒額外地包括一種容器，所述容器含有至少一種表1、表3及表4的生物標記。在又一個具體實施例中，所述試劑盒額外地包括陽離子交換層析吸附物。在另外的具體實施例中，本發明提供一種試劑盒，包括(a)固體載體，包括附著于其上的至少一種捕獲試劑，其中，所述捕獲試劑結合至少一種選自表1、表3及表4的生物標記所組成的群組的生物標記；及(b)含有至少一種所述生物標記的容器。在相關的具體實施例中，所述容器包含至少一種生物標記，其選自下列所組成群組ApoCl、血紅蛋白a/P、ApoAI工、ApoCI工、鈣粒蛋白C、令丐粒蛋白C(截斷型)、l丐粒蛋白A及IgG重鏈。在又一具體實施例中，所述容器包含各種下列生物標記ApoCl、血紅蛋白a/e、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈。在相關的具體實施例中，所述容器進一步包含CA125。在另外相關的具體實施例中，所述容器包含選自下列所組成群組的至少一種生物標記ApoC1、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、辛丐粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)。在另外的具體實施例中，所述容器包含各種下述生物標記ApoCl、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、鈣粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)。在另外的具體實施例中，所述容器進一步包含CA125。在又一具體實施例中，所述試劑盒的所述固體載體包括為SELDI探針的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑為疏水性吸附劑、陰離子交換吸附劑、陽離子交換吸附劑及金屬螯合物吸附劑。在又一具體實施例中，所述試劑盒額外地包括一種含有至少一種表1、表3及表4的生物標記的容器。本發明額外提供一種軟件產品，包括存取隸屬于樣本的數據的編碼，所述數據包括樣本中至少一種生物標記的測量，所述生物標記選自表1、表3及表4的生物標記所組成群組的生物標記；且進一步包括進行分類演算法的編碼，其將所述樣本的所述卵巢癌狀態分類為所述測量的函數。在相關的具體實施例中，所述軟件產品將所述樣本的卵巢癌狀態分類成為一種生物標記的測量的函數所述生物標記選自下列所組成群組ApoCl、血紅蛋白a/p、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈。在又一個具體實施例中，所述分類演算法將所述樣本的所述卵巢癌狀態分類成為各種生物標記的測量的函數，所述各種生物標為ApoCl、血紅蛋白ci/e、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白C、鈣粒蛋白C(截斷型)、鈣粒蛋白A及IgG重鏈。在另一具體實施例中，所述分類演算法將所述樣本的所述卵巢癌狀態分類成為CA125的測量的函數。在相關的具體實施例中，所述軟件產品將樣本的卵巢癌狀態分類成為一種生物標記的測量的函數，所述生物標記選自下列所組成群組ApoCl、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、f丐粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)。在另外的具體實施例中，所述分類演算法將所述樣本的所述卵巢癌狀態分類成為各種生物標記的測量的函數，所述各種生物標記為ApoCl、ApoAII、ApoCII、鈣粒蛋白A、鈣粒蛋白C、鈣周期蛋白及轉甲狀腺素蛋白(雙電荷)。在另外的具體實施例中，所述分類演算將所述樣本的所述卵巢癌狀態分類成為CA125的測量的函數。本發明額外提供一種包括通過質譜法或免疫分析偵測表1、表3及表4的生物標記的方法。在另外的具體實施例中，本發明提供一種包括將有關卵巢癌狀態的診斷結果傳達至受驗者的方法，，其中，所述卵巢癌狀態是通過來自受驗者的樣本的生物標記的關聯性而決定的，且所述生物標記選自表1、表3及表4的生物標記所組成的群組。在相關的具體實施例中，所述診斷結果是透過計算機生成媒介傳達至受驗者。在另外的具體實施例中，本發明提供一種用于識別與表1、表3及表4的一種生物標記相互作用的化合物的方法，其中，所述的方法包括(a)將表1、表3及表4的一種生物標記與測試化合物接觸；及(b)決定所述的測試化合物是否與表1、表3及表4的該生物標記相互作用。在另外的具體實施例中，本發明提供一種用于調節細胞中鈣粒蛋白C濃度的方法，其中，所述方法包括將所述的細胞與抑制劑接觸，其中，所述抑制劑阻止鈣粒蛋白C裂解。本發明額外提供一種治療受驗者病癥的方法，其中，所述方法包括投予受驗者治療上有效量的鈣粒蛋白C的抑制劑，其中，所述的抑制劑阻止鈣粒蛋白C裂解。在相關的具體實施例中，所述病癥為卵巢通過以下詳細的說明書、實施例及權利要求書，本發明的其他特征、目的及優點及其優選的具體實施例將很明白。圖示簡單說明第1圖，患有良性(a，a')、惡性上皮卵巢癌(b，b')、及低惡性潛能癌的個體病患的囊腫液的代表性光譜(A)及其對應凝膠圖示(B)。通過陰離子交換以下降pH值(pH值9.0、7.0、5.0、4.0、3.0)然后有機溶劑而分級(fractionated)，吸附至CM10蛋白質晶片(ProteinChip)陣列，并且在低激光強度讀取結果。顯示每位病患在pH值9.0的洗提分級。代表性散點和箱線圖(C)顯示m/z10，840(鈣粒蛋白A)在「波峰強度」中的變化性。各散點圖的水平線為平均「波峰強度」。在患有惡性上皮卵巢癌的病患中波峰m/z10，840有顯著較大的「波峰強度」。發詳細說明與優選的具體實施例I.簡介生物標記是一種有機生物分子，所述生物分子區別呈現于取自一種表現型狀態(例如患有疾病)受驗者的樣本及與其相比較的取自另一種顯型狀態(例如不患有疾病)受驗者體的樣本。如果經統計計算顯示不同群組中的生物標記的平均或是中值表現水準具顯著差別，則表示所述生物標記在不同顯型狀態之間是區別呈現的。用于統計上顯著性的常見測試方法包括t一test、AN0VA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。單獨使用或組合使用的生物標記提供一種測量受驗者是屬于一種顯型狀態還是另一種顯型狀態的相對風險的方法。因此，它們對于作為疾病的標記(診斷上)、藥物的治療有效性(治療診斷上(theranostics))以及藥物毒性上是很有用的。n.卵巢癌的生物標記本發明提供以多肽為基礎的生物標記，所述生物標記區別表現于患有卵巢癌的受驗者，特別是，卵巢癌(惡性，例如侵略性上皮卵巢癌)、低惡性潛能卵巢癌((LMP)，邊界疾病(borderlinedisease))、良性卵巢疾病及其他惡性病癥(例如除了侵略性上皮卵巢癌之外的惡性腫瘤，包含轉移癌(例如胃癌轉移至卵巢)、間皮瘤、基質卵巢癌等))。生物標記的特征為如同經質譜法測定的質荷比、他們于飛行時間質譜法的光譜波峰的形狀，以及他們結合至吸附劑表面的結合特性。這些特征提供一種決定一種特定偵測到的生物標記是否為本發明的生物標記的方法。這些特征表示這些生物分子的固有特性但并非用于限制所辨別的生物分子的種類。在一種態樣中，本發明以單離型式提供這些生物標記。這些生物標記是使用SELDI技術運用購自CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA)("Ciphergen")的蛋白質晶片(ProteinChip)陣列而發現。收集取自診斷患有卵巢癌(侵略性上皮卵巢癌)、低惡性潛能卵巢癌(邊界疾病)、其他惡性病癥及良性卵巢疾病受驗者的卵巢囊腫液。部份的樣本保留而未經分級，而其他部份的樣本通過陰離子交換層析分級。將未經分級和經分級的樣本施用至SELDI生物晶片，且通過在CiphergenPBSII質譜儀上的飛行時間質譜法來產生樣本中多肽的光譜。由此獲得的光譜將通過CiphergenBiosystems，Inc.的CiphergenExpressDataManagerSoftware以Biomarke:rWizardandBiomarkerPatternSoftware來分析。對各組的質量光譜進行散點圖分析。利用曼惠特尼(Mann-Whitney)測試分析來比較卵巢癌和控制組在所述散點圖中的各蛋白質集群(cluster)，并選擇于所述兩組之間有顯著區別(P〈0.0001)的蛋白質。此方法在實施例部份將進一步詳細的描述。由此所發現的生物標記呈現于表1中。按照所述實施例部份，"蛋白質晶片(ProteinChip)分析」欄表示于其中發現生物標記的層析分級(若有分級的話)、生物標記所結合的生物晶片的種類及生物標記在卵巢癌中是否上調節或下調節。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>'須注意在實施例部份提出的血紅蛋白a及血紅蛋白13在SELDI偵測分析中為雙電荷2「于惡性腫瘤為上調節」表示所述生物標記在卵巢癌及其他惡性病癥(例如除了侵略性上皮卵巢癌以外的惡性腫瘤，包含與良性卵巢疾病相對的轉移癌(例如胃癌經常轉移至卵巢)、間皮瘤、基質卵巢癌等)及低惡性潛能卵巢癌(LMP，邊界疾病))為上調節:'「于LMP為下調節」表示所述生物標記在與其他三組(亦即良性卵巢疾病、卵巢癌(惡性)及其他惡性病癥)相對的低惡性潛能卵巢癌為下調節1「排除良性」表示生物標記的出現將排除良性疾病的可能性，但單獨卻不足以于其他三組間作出診斷(卵巢癌LMP、卵巢癌(惡性)及其他惡性病癥)5「排除惡性腫瘤」表示生物標記的出現將排除惡性疾病的可能性，但其本身單獨卻不足以作出良性卵巢疾病的診斷'1「于惡性腫瘤為下調節」表示所述生物標記在卵巢癌及與良性卵巢疾病及低惡性潛能卵巢癌(LMP)(邊界疾病))相對的其他惡性病癥為上調本發明的生物標記的特征為如同通過質譜法所測定的他們的質荷比。各生物標記的質荷比為提供于上表1、下表2及3的「M」后的數字。因此，例如，M6420表示具有測得的6420的質荷比。所述質荷比通過自CiphergenBiosystems，Inc.PBSII質譜儀產生的質量光譜而測定。此儀器具有大約+/-0.15百分比的質量精確度。另外，此儀器具有大約400到1000m/dm的質量解析度，其中m為質量而dm為在0.5峰寬的光譜峰寬。生物標記的質荷比是通過使用BiomarkerWizarcf'軟件(CiphergenBiosystems,Inc.)而測定。BiomarkerWizard通過自所有經分析光譜(如同由PBSII所決定者)中將相同的質荷比的波峰集群、取集群中最大及最小的質荷比，再將其除以2而分配質荷比給生物標記。因此，所提供的質量反映出這些規格。本發明的生物標記進一步以他們在飛行時間質法中的譜峰形狀為特征。本發明的生物標記進一步以他們在層析表面上的結合性質為特征。本發明的生物標記可結合的所述層析表面的實施例包含但不限定于疏水性吸附劑(例如CiphergerAi50ProteinChip⑤陣列)、陰離子交換吸附劑(例如Cipherger^Q10ProteinChip,車列)、陽離子交換吸附劑(例如Cipherger^CM10ProteinChip⑧陣列)及金屬螯合物吸附劑(例如Cipherger^頂AC-30ProteinChip⑧陣列)。一些生物標記結合到使用10%乙腈的結合及清洗緩沖液的疏水性吸附劑(例如CiphergenH50ProteinChip⑤陣列)。某些生物標記結合到使用pH8.0的50mMTris緩沖劑的結合及清洗緩沖液的陰離子交換吸附劑(例如CiphergenQl0ProteinChip⑧陣列)。一些生物標記結合到使用，例如，50mMTrispH8.0/500mMNaCl的結合及清洗緩沖液的金屬螯合物吸附劑(例如以偶合銅的Cipherger^IMAC-301~(^6^0^@陣列)。大部分的生物標記在以pH4的100mM醋酸鈉清洗后結合到陽離子交換吸附劑(例如CiphergenCM10ProteinChip⑧陣列)。本發明某些生物標記的身分已經確定并顯示于表1中。作出所述確認的方法描述于實施例部份。對已經確定身分的那些生物標記來說，這些生物標記的出現可通過在本
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中其他已知方法來測定(例如免疫分析)。由于本發明的生物標記以質荷比、結合性質及光譜的形狀為特征，因此他們可通過質譜法來偵測而不需知道他們特定的身分。然而，若有需要，未經確認身分的生物標記可通過，例如，確認多肽的胺基酸序列來識別其身分。例如，生物標記可通過許多酶例如胰蛋白酶或V8蛋白酶來制成其肽圖，且這些裂解片段的分子量可用于搜尋與通過多種酶所產生的裂解片段的分子量相匹配的序列的資料庫。或者，蛋白質生物標記可使用串聯質譜儀技術來定序。于這種方法中，所述蛋白質通過，例如，凝膠電泳而單離。切下含有生物標記的帶，并將所述蛋白質以蛋白酶進行裂解。個別的蛋白質片段通過第一質譜儀來分開。然后所述片段進行碰撞引發冷卻，其將肽片段化并產生多肽條帶(ladder)。然后以串聯MS的第二質譜儀來分析多肽條帶。多肽條帶成員質量的差異可識別出胺基酸的序列。整條蛋白質可以此方法定序，或將定序后片段進行資料組搜尋來找出其候選身分。偵測生物標記的優選來源為卵巢囊腫液。然而，在其他的具體實施例中，所述生物標記是在其他的體液，例如血清、血液或尿液中偵本發明的生物標記為生物分子。因此，此發明提供單離型式的這些生物分子。可自生物體液例如尿液或血清中單離生物標記。基于生物標記的質量和他們的結合特性，他們可通過本領域已知的任何方法單離。例如，可如同這里所描述般對包括生物分子的樣本進行層析分離，并通過例如丙烯醯胺凝膠電泳進行進一步的分離。了解生物標記身分也使得他們能通過免疫親和層析(immunoaffmitychromatography)來單離。III.蛋白質的不同型式與生物標記蛋白質通常以可測定的不同質量為特征的復數種不同型式存在于樣本中。這些型式可能產自翻譯前修飾及翻譯后修飾其中一者或兩者。翻譯前修飾型式包含等位變異體、剪接變異體及RNA編輯型式。翻譯后修飾型式包含由下列所導致的型式蛋白酶裂解(例如親蛋白質的片段)、糖基化、磷酸化、脂質化、氧化、甲基化、胱氨酸基化(cystinylation)、磺酸化(sulphonation)禾口乙醯基化(acetylation)。當偵測或測量樣本中的蛋白質時，區分一種蛋白質的不同型式的能力取決于其差別的本質及用于偵測或測量的方法。例如，使用單株抗體的免疫分析將偵測含有表位(印tiope)的蛋白質的所有型式且不會區別他們。然而，使用針對在蛋白質上的不同表位的二種抗體的夾心免疫分析將能偵測同時包含這二種表位的蛋白質的所有型式且不會偵測那些僅含一種表位蛋白質的形式。在診斷分析中，當所使用的特別方法偵測到的這些形式可作為與任何特別型式一樣良好的生物標記時，無法區分蛋白質的不同型式所產生的影響很小。不過，當蛋白質的特別型式(或特別型式的子集)是比通過特別方法所一起偵測收集的不同型式更好的生物標記時，可能犧牲這種分析法的強度。于這種情況下，利用一種于一種蛋白質的多種型式間區分及特異地偵測及測量蛋白質的一種所欲型式或多種型式的分析方法是有用的。區分分析物(analyte)的不同形式或是特異地偵測分析物的一種特別型式稱為「解析」所述分析物。質譜法是一種解析不同蛋白質型式特別有效的方法，這是因為這些不同型式典型具有不同質量，而可通過質譜儀來解析。因此，若蛋白質的一種型式相較于生物標記的另一型式而言是疾病的最優良生物標記，則當傳統的免疫分析不能區分這些形式且也不能特異偵測有用的生物標記，質譜儀能夠特異偵測及測量這種有用的型式，。一種有用的方法學將質譜法與免疫分析結合。首先，生物特異性捕獲試劑(例如辨別所述生物標記及它的其他型式的抗體、核酸適體(aptamer)或親和體(affibody))用來捕獲興趣生物標記。優選地，所述生物特異性捕獲試劑結合到固體相，例如珠、平板、膜或陣列。在將未結合的材料沖掉后，以質譜法偵測及/或測量所捕獲的分析物。(這種方法也將導致捕獲結合到所述蛋白質的蛋白質相互作用物(interactors)或是以其他方式被抗體辨別(它們本身可以作為生物標記)的蛋白質相互作用物(interactors))。各種型式的質譜法適于偵測蛋白質型式，其包含激光吸附法，例如傳統的MALDI或SELDI，以及電噴灑(electrospray)電離。因此，當本文提及偵測特別蛋白質或為測量特別蛋白質的量時，其意指在解析或是不解析蛋白質的各式型式下偵測或測量蛋白質。例如，「測量鈣粒蛋白C」的步驟包含通過不區分出樣本中所述蛋白質的各式型式的方法(例如一些免疫分析)以及通過將一些型式與其他型式區分或測量所述蛋白質的特定型式(例如質譜法)的方法來測量任何及/或所有型式的鈣粒蛋白C。相反地，當欲測量一種蛋白質的特定的一種或是多種型式時(例如鈣粒蛋白C的特別型式包含經截斷化、磷酸化、糖基化等修飾后的型式)，所述特別的一種型式(多種形式)是特定的。例如，「測量M10430」表示測量具有明確為10430Da分子量的多肽，因此，自鈣粒蛋白C的其他型式區分出M10430。IV.偵測卵巢癌的生物標記本發明的生物標記可通過任何適合的方法偵測。可用于此目的的偵測范例包含光學方法、電化學方法(伏安法(voltametry)和安培法(amperometry)技術)、原子力顯微鏡及射頻方法，例如多極共振光譜。除顯微鏡以外，例示性光學方法，共焦和非共焦顯微鏡也偵測螢光、冷光、化學冷光、吸收率、折射率、透射率、雙折射或折射率(例如表面電衆共振、橢圓術(ellipsometry)、共振鏡象法、光柵偶合器波導法或干涉法)。在一個具體實施例中，樣本通過生物晶片的手段來分析。生物晶片一般包括固體基材且具有捕獲劑(也稱為吸附劑或親和試劑)黏附于其上的一般平坦表面。有時，生物晶片的所述表面包括復數個可定址位置，每個可定址位置上結合有吸附劑。蛋白質生物晶片為適用于捕獲多肽的生物晶片。在本領域內已揭示許多蛋白質生物晶片。那些蛋白質生物晶片包含，例如，由CiphergenBiosystems,Inc.(Fremont,CA)、Zyomyx(Hayward，CA)、Invitrogen(Carlsbad,CA)、Biacore(Uppsala,Sweden)及Procognia(Berkshire:UK)生產的蛋白質生物晶片。這類蛋白質生物晶片的例子描述在下述已公開的專利申請案中美國專利第6，225，047號(Hutchens等人)；美國專利第6，537，749(Kuimelis等人)；美國專利第6，329，209號(Wagner等人);PCT國際公開號W000/56934(Englert等人);PCT國際發明者A·T·巴倫,E·T·馮,F·R·尤蘭,J.R.·萬那耶爾,P·D·德普里斯特申請人:賽弗吉生物系統公司;肯塔基大學研究基金會