用于檢測櫻桃ssr標記的引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學DNA標記技術與應用領域，特別設及用于檢測樓桃SSR標 記的引物。
【背景技術】
[0002] 簡單重復序列（SimpleSequenceR巧eat,SSR)，也稱為串聯重復序列或微衛星標 記，是一種共顯性標記，具有多態性高，重復性好，易于檢測的優點，被廣泛應用于種質資源 親緣關系鑒定、遺傳圖譜構建、功能基因的篩選和分子標記輔助育種等工作中。SSR標記的 獲取通常有3種途徑，分別是：利用已公布的表達序列標簽、利用已完成測序的基因組序列 和利用轉錄組序列。
[0003] 中國樓桃（Primuspseudocerasus)的近緣物種有桃（P.persica)、杏 (P.armeniaca)、李（P.salicina)和歐洲甜樓桃（P.avium)等，其中桃的基因組已經完成測 序。盡管用于桃遺傳圖譜構建、功能基因的篩選和分子標記輔助育種的SSR標記比較豐富， 而且同科或同屬植物SSR標記有一定程度的轉移性，但是多數情況下，側翼序列突變導致 SSR標記向近緣物種轉移的成功概率很低。截至2015年11月20日，GenBank公布的歐洲 甜樓桃表達序列標簽巧ST)有6496條，中國樓桃僅有185條，但利用EST序列開發中國樓 桃SSR標記的研究尚未見報道。顯然，由于GenBank登錄的歐洲甜樓桃和中國樓桃的表達 序列標簽數量非常有限，所能開發的SSR標記的數量也是有限的。應用新一代高通量測序 平臺IlluminaHiseqTM2000能夠W較低的價格、較快的速度獲得較多的轉錄組信息，是大 量開發中國樓桃SSR標記的有效方法。因此，如能利用EST序列開發中國樓桃SSR標記，增 加樓桃屬分子標記的數量，勢必會對今后的樓桃育種工作帶來極大的便利。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中樓桃分子標記數量不足的缺點，提 供一組用于檢測樓桃屬植物SSR標記的引物，增加樓桃屬分子標記的數量W應用于今后的 育種工作中。
[0005] 為了解決技術問題，本發明提出了用于檢測樓桃SSR標記的引物，該檢測引物共 有9個引物對，其核巧酸序列如下：
[0006] 化2632-F和化2632-R的核巧酸序列分別如沈QIDNO: 1、2所示；
[0007] 化3793-F和化3793-R的核巧酸序列分別如沈QIDN0:3、4所示；
[0008] 化4400-F和化4400-R的核巧酸序列分別如沈QIDN0:5、6所示；
[0009] Unigenel3394-F和Unigenel3394-R的核巧酸序列分別如沈QIDN0:7、8 所示；
[0010] Unigenel3887-F和Unigenel3887-R的核巧酸序列分別如沈QIDN0:9、10 所示；
[0011] 化1旨611616590斗和化1旨611616590-1?的核巧酸序列分別如沈9 10側：11、12所示；
[0012] 化1旨611619771斗和化1旨611619771-1?的核巧酸序列分別如沈9 10側：13、14所示；
[0013] Unigene8656-F和Unigene8656-R的核巧酸序列分別如沈QIDNO: 15、16 所示；
[0014] 化4698-F和化4698-R的核巧酸序列分別如沈QIDNO: 17、18所示。
[0015] 本發明還提出上述用于檢測樓桃SSR標記的引物在樓桃遺傳多樣性分析中的應 用。
[0016] 此外，本發明還提出利用上述用于檢測樓桃SSR標記的引物進行樓桃遺傳多樣性 分析的方法，所述方法包括如下步驟：
[0017] 步驟I，各樓桃材料的DNA提取； 陽01引步驟II，微衛星分析：
[0019] (1)、PCR擴增：W步驟I提取的DNA為模板進行PCR擴增；
[0020] A:20μL反應體系包含：TaKaRaPremixTaq? 10化、正向引物0. 1化，反向引物 0. 5μL巧光修飾的M13引物0. 4μLlOngDNA模板和雙蒸水； 陽02UB:反應程序：94°C預變性4min;94°C變性40s，54°C退火40s，72°C延伸40s，30個 循環后，改變循環條件為94°C變性40s，53°C退火40s，72°C延伸40s，進行8個循環，最后 72°C延伸6min; 陽02引 似、電泳檢測：
[0023] 取上述擴增產物5μL加入1μL6XLoadingbuffer;在含有0. 5μg/μL邸的 1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下拍照記錄結果；
[0024] (3)、SSR基因分型和GeneMapper軟件統計：
[00巧]選取上述在不同樓桃材料中電泳條帶粗細、明暗、片段長度變化不一的標記1μL約lOOng的PCR產物與12μL變性劑和0. 25μL內參混勻，使用lippendorfMasteixycler PCR儀在95°C下變性5min，取出立即放置冰上5min，然后使用ABI3130遺傳分析儀進行分 析，同時使用GeneMa卵er軟件讀取片段長度；
[0026] 步驟III，遺傳多樣性分析
[0027] 將GeneMa卵er統計得到的標記長度數據按照標準格式輸入GenA化X6. 501，計 算樓桃材料的遺傳多樣性參數，繪制聚類圖。 陽02引優選的，在上述正向引物的5'端統一加18bp的M13序列： 5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'。
[0029] 優選的，所述巧光標識引物為5'端分別使用Fam和Hex兩種巧光基團修飾的Ml3 引物，其中M13引物的序列為5' -TGTAAAACGACGGCCAGT-3'。
[0030] 優選的，所述樓桃材料為中國樓桃材料，來自如下：朱紅1、臨海地方品種1、朱砂 紅、山樓1、朱紅2、朱紅3、山樓2、早紅寶石1、朱紅4、浙閩樓、早紅寶石2、臨海地方品種2、 諸暨地方品種、朱紅5、仙居地方品種、中國樓桃1、中國樓桃2、中國樓桃3、中國樓桃4、大鷹 嘴、中國樓桃5、高盆樓桃。 陽〇3U 優選的，所述步驟I的DM提取步驟為：（1)配制DM提取液：2 %CTAB，0. 1M Tris，20mM邸TA，1. 4M化Cl，p冊.0;DNA溶解緩沖液：10mMTris;lmM邸ΤΑ;PH=8. 0 ;似 對中國樓桃材料進行如下處理： 陽03引①在10血離屯、管中加入4血的DNA提取液和80μLβ-琉基乙醇，放置在65°C水 浴中預熱lOmin;
[0033] ②取Ig中國樓桃材料的新鮮葉片，在研鉢放入少許PVP，加入液氮充分研磨；將研 磨好的葉片轉移至含DNA提取液的離屯、管中，混勻后放入65°C水浴鍋中水浴30min，每隔 lOmin搖勻一次，使葉片細胞充分裂解；
[0034] ③水浴結束后，取出離屯、管冷卻至室溫；加入4血的預冷V:V= 24:1的氯仿/異 戊醇混合溶液，充分混勻后使用離屯、機在10 00化pm下離屯、15min;
[0035] ④用移液器小屯、吸取上清液，轉移至新的10血離屯、管中，加入4血的異丙醇和 400化的3M的醋酸鋼溶液，輕輕顛倒混勻，靜置10-15min至產生絮狀沉淀，然后使用離屯、 機在10 000巧m下離屯、lOmin;
[0036] ⑥離屯、后棄上清液，將底部白色沉淀即：DNA小屯、取出，轉入1. 5血離屯、管中，加入 700μL70 %的乙醇洗涂兩次；
[0037] ⑧離屯、后棄上清液，用移液器吸干剩余酒精，將白色沉淀物收集在側管壁上，盡可 能鋪平打薄，放入37Γ保溫箱中烘干；
[0038] ⑦加入500μLDNA溶解緩沖液將烘干后的DNA重新溶解，完全溶解后加入1μL RNase，用移液器輕輕吸打DM溶液，混勻后將離屯、管放入37°C保溫箱中保溫比；
[0039] ⑨取4μΙDNA在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測其完整性。 W40] ⑨吸取一部分DNA稀釋至10-3化g·μL/用于后續的PCR反應，剩余部分置 于-20°C保存。
[0041] 相對于現有技術，本發明的有益效果是：
[0042] (1)本發明利用本課題組前期開發的中國樓桃"短柄"品種休眠花芽組織的轉錄組 信息尋找SSR位點，經13種中國樓桃品種或地方品種及7個野生中國樓桃共22個不同樓 桃基因型篩選，得到9個具有多態性的通用型標記。
[0043] 本發明篩選出9個SSR標記在22個中國樓桃種或品種中有多態性，在22個中國樓 桃種或品種