一株解淀粉芽孢桿菌lx-j1及其用圖
【專利說明】一株解淀粉芽孢桿菌LX-J1及其用途 【技術領域】
[0001] 本發明涉及屬于微生物技術領域。更具體地，本發明涉及一株解淀粉芽孢桿菌 LX-J1，還涉及所述解淀粉芽孢桿菌LX-J1的用途。 【【背景技術】】
[0002] 花生為豆科作物，又名"落花生"或"長生果"，含油量高達50%。是主要油料經濟 作物之一。花生白絹病是發生在花生上的重要病害之一，經根、莢果及莖基部受侵染后，初 呈褐色軟腐狀，花常常在近地面的莖基部和其附近的土壤表面先形成白色絹絲，并有油菜 籽狀菌核，莖葉變黃，逐漸枯死，花生莢果腐爛。該病菌在高溫高濕條件下開始萌動，侵染花 生，沙質土壤、連續重茬、密度過大不通風，陰雨天發生較重。目前對花生白絹病的防治措施 除了優選種子和輪作外，使用的藥劑都是化學農藥，這些化學藥劑不僅破壞生態環境且易 殘留。隨著科學的不斷發展和人們生活水平的提高，對食品安全和環保農業也提出了更高 的要求，因此新型高效的生物農藥及肥料是防治植物病害將是有機農業發展的必然趨勢。
[0003] 解淀粉芽孢桿菌具有生長快、適應能力強、穩定性好、代謝方式廣泛的特點；具有 促進植物生長，和抑制土傳性病原菌的特性，并且可對熱、電磁輻射、紫外線及一些化學藥 品具有很強的抗逆性，正是因為具有如此之強的抗逆性，使得其有利于生防菌劑的劑型加 工生產，因此解淀粉芽孢桿菌是作為農用微生物具有較高開發價值的生防菌。 【
【發明內容】
】
[0004] [要解決的技術問題]
[0005] 本發明的目的是提供一株解淀粉芽孢桿菌LX-J1。
[0006] 本發明的另一個目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌LX-J1的用途。
[0007] [技術方案]
[0008] 本發明是通過下述技術方案實現的。
[0009] 本發明涉及一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) LX-J1，該菌株 于2015年8月21日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 11263。
[0010] 根據本發明的一種優選實施方式，所述的解淀粉芽孢桿菌LX-J1的培養方法的步 驟如下：
[0011] A、斜面培養
[0012] 使用接種環挑取一環保存于甘油管中的解淀粉芽孢桿菌LX-J1接種于斜面培養 基斜面上，然后置于恒溫培養箱中在溫度28~30°C的條件下斜面培養40~48小時；
[0013] B、種子培養
[0014] 將一環在步驟A得到的斜面培養物接種到液體種子培養基中，然后置于恒溫培養 箱中在溫度28~30°C與轉速180rpm的條件下培養6h~10h，得到種子培養物；
[0015] C、發酵培養
[0016] 按照以發酵培養基體積計5~10 %接種量，將在步驟B得到的種子培養物轉接 至發酵培養基中，再置于發酵培養罐中，先在溫度28~30°C、轉速150~200rpm、風量 1:1. 0~1. 2與罐內壓力0. 04~0. 08MPa的條件下培養15h，接著在溫度30~35°C與轉 速320~380rpm的條件下繼續發酵培養至40 - 45h，發酵結束后得到的發酵培養物含有 100~120億/ml解淀粉芽孢桿菌LX-J1。
[0017] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述斜面培養基的制備方法如下：
[0018] 將5~10g牛肉膏、1~5g氯化鈉、5~10g蛋白胨與20g瓊脂溶于水中，再用水 補充到總體積l〇〇〇ml，然后使用無機酸或無機堿將得到的溶液pH值調節至pH 7. 0~7. 2。
[0019] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述液體種子培養基的制備方法如下：
[0020] 將5~10g牛肉膏、1~5g氯化鈉與5~10g蛋白胨溶于水中，再用水補充到總體 積1000ml，然后使用無機酸或無機堿將得到的溶液pH值調節至pH 7. 0~7. 2。
[0021] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述發酵培養基的制備方法如下：
[0022] 將15~20g淀粉、1~3g玉米衆粉、1~5g蛋白胨、1~5g氯化鈉、1~5g Κ2ΗΡ04 · 3H20、1~3g NH4C1與0· 1~0· 5g MgS04 · 7H20溶于水中，再用水補充到總體積 1000ml，然后使用無機酸或無機堿將得到的溶液pH值調節至pH 7. 0~7. 5。
[0023] 根據本發明的另一種優選實施方式，所述的無機酸選自鹽酸或磷酸；所述的無機 堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水。
[0024] 本發明還涉及一種解淀粉芽孢桿菌LX-J1制劑的生產方法。
[0025] 該生產方法的步驟如下：
[0026] 往所述的解淀粉芽孢桿菌LX-J1發酵液中添加以金屬離子重量計為0. 1~0. 5% 的硫酸銅、1~2%的硫酸鋅、0. 1~0. 5%的硫酸錳及0. 1~0. 6%黃原膠，得到所述的解淀 粉芽孢桿菌LX-J1制劑。
[0027] 本發明還涉及采用所述生產方法生產得到的解淀粉芽孢桿菌LX-J1制劑。每毫升 解淀粉芽孢桿菌LX-J1制劑含有100億以上個解淀粉芽孢桿菌LX-J1。
[0028] 本發明還涉及所述的解淀粉芽孢桿菌LX-J1制劑在防治禾谷絲核菌、立枯絲核 菌、終極腐霉、白絹病菌與馬鈴薯黑痔病中的用途。
[0029] 下面將更詳細地描述本發明。
[0030] 本發明涉及一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) LX-J1，該菌株 于2015年8月21日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 11263。
[0031] 一、分離篩選
[0032] 從河南駐馬店花生種植地塊采集土壤樣品，依照五點取樣法在地塊四周和中央在 深度10~20cm范圍內分別采取100g土壤，將這些土壤等量混勾，得到一種土樣。稱取10g 土樣溶于90ml水中，在振蕩培養箱中在溫度28°C與轉速180rpm的條件下振蕩20min，分離 得到濃度為10 2g/ml的懸浮液。
[0033] 移取100 μ 1懸浮液放于裝有900 μ 1水的離心管中，充分振蕩混勾，制成10 3g/ml 的懸浮液，再依次用水稀釋至10 7或10 sg/ml懸浮液。分別移取100 μ 110 7或10 sg/ml懸 浮液，均勻涂布在倒有PDA固體培養基（20g葡萄糖、200g去皮馬鈴薯、18g瓊脂粉與1000ml 蒸餾水，pH7. 0)的平板中，同時在平板上按照每個平板中心接種一個花生白絹病菌菌核，接 著放到溫度25°C培養箱中倒置培養4d，觀察并挑選拮抗抑制圈大的菌落。
[0034] 二、純化
[0035] 讓在步驟一挑選的菌落在NA培養基（蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L， 瓊脂20g/L)上再次劃線純化，挑取單菌落點接種于上述PDA培養基上，在培養基上接種花 生白絹病菌進行拮抗驗證，并且挑取具有相同菌落形態的單菌落接種于NA培養基上，劃線 保存。
[0036] 三、菌株鑒定
[0037] ①菌體形態特性：革蘭氏陽性菌，桿狀，在NA培養基上培養12h以上可產生芽孢， 具體參見附圖1。
[0038] ②菌落形態特性：在NA培養基上培養至菌落3mm時菌落形態為圓形、有凸起、表面 有褶皺，邊緣呈波狀不透明白色菌落，具體參見附圖2。
[0039] ③分子生物學鑒定（16s rDNA序列擴增及序列測定）：
[0040] 樣品總DNA制備：米用常規細菌DNA提取方法進行。
[0041] PCR引物：正向引物27F :AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ;反向引物 1492r :TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T〇
[0042] PCR反應體系：20 μ 1反應體系，反應液組成：1 μ 1 DNA模板、10 μ 12XMastarMix、 0·4μ1 27F、0.4yl 1492R，超純水補足至 20μ1。
[0043] PCR擴增程序：在溫度94°C為2min ;30個循環（在溫度94°C為lmin，在溫度52°C 為lmin，在溫度65°C為8min);在溫度65°C為18min。
[0044] 擴增產物經0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后測序，測序結果利用blast軟件進 行同源性比對，該菌株與解淀粉芽孢桿菌的同源性為99%，結合菌落特征、菌體形態特征及 分子生物學特性，鑒定該分離菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)。解淀 粉芽孢桿菌CGMCC No. 11263菌株的16S rRNA基因序列測定結果見附錄1。
[0045] 該菌株命名為解淀粉芽孢桿菌LX-J1，它已于2015年8月21日