防治十字花科根腫病解淀粉芽孢桿菌Bam22的發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物農藥技術領域，具體設及一種防治十字花科根腫病解淀粉芽抱桿 菌Bam22的發酵方法。
【背景技術】
[0002] 僅幾十年來，十字花科根腫病在全球范圍內迅速蔓延，嚴重影響了十字花科作物 的生長，造成了巨大的經濟損失。
[0003] 鑒于使用化學農藥對環境有害且存在食品安全隱患，生防技術日益受到研究者和 農業從業者的青睞。然而，由于十字花科根腫病菌不能離體培養的特性在一定程度上限制 了該病生防菌株的篩選，因此現有的對十字花科根腫病有較好防治功效的菌株只有寥寥幾 種，嚴重的限制了生防方法在十字花科根腫病防治工作的進一步開展。
[0004] 本發明的發明人經過大量的實驗摸索研究，獲得了一株對十字花科(特別是油菜） 根腫病具有高效防治功效、且施用劑量少的生防菌株，于2015年9月6日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏號為CGMCCNo. 11329。將其更好的應于于實 際防治工作中，需要對其發酵培養方法進行摸索。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種防治十字花科根腫病解淀粉芽抱桿菌Bam22的發酵 方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1) 挑取經過在固體培養基上培養后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養基 中，于30-32°C震蕩培養10-12小時，轉速為200-220rpm，作為種子液；所述液體培養基的 成分按質量百分數計包括：酵母提取物0. 2-0. 3%、牛肉浸膏0. 1-0. 2%、蛋白腺0. 7-0.8%、 化Cl0. 3-0.6%、余量為水，pH=7. 0-7. 2 ; 2) 將步驟1)所得物置入發酵罐中進行發酵40-50小時，罐溫為27-30°C，發酵罐攬拌 速度為220-25化pm，空氣流量0.8 :1-1:1(VAm);發酵罐中的培養基的成分按質量百 分數計包括：豆粉4-5%、蛋白腺0. 1-0. 15%、葡萄糖0. 5-0. 7%、淀粉2-3%、硫酸儘0. 1%、硫酸 亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、碳酸巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 0-7. 4 ; 所述高抗十字花科根腫病解淀粉芽抱桿菌Bam22于 2015年9月6日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏號為CGMCCNo. 11329。
[0006] 本發明提供的發酵方法能夠很好的對解淀粉芽抱桿菌Bam22進行發酵培養，使得 該生防菌具有十分優良的活性，易于開展十字花科根腫病的防治工作。
[0007] 優選的，所述方法在步驟1)之前還包括步驟：試管種的培養，所述試管種的培 養方法為：將解淀粉芽抱桿菌Bam22置于斜面培養基中于30°C下培養36小時；所述斜面 培養基的成分按質量百分數計包括：酵母提取物0. 2-0. 3%、牛肉浸膏0. 1-0. 2%、蛋白腺 0. 7-0.8%、化Cl0. 3-0.6%、瓊脂 2%，余量為水，pH=7. 0-7. 2。
[0008] 優選的，所述步驟I)中，所述液體培養基的成分按質量百分數計為：酵母提取物 0. 25%、牛肉浸膏0. 12%、蛋白腺0. 75%、化Cl0. 5%、余量為水，pH=7. 2。
[000引優選的，所述步驟1)中，培養溫度為30°C，培養時間為12小時。
[0010] 優選的，所述步驟2)中，發酵罐中的培養基的成分按質量百分數計為：豆粉4. 5%、 蛋白腺0. 12%、葡萄糖0.6%、淀粉2. 5%、硫酸錠0. 1%、碳酸巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水， 抑=7. 8。
[0011] 優選的，所述步驟2)中，罐溫為28°C，發酵時間為48小時。
[0012] 本發明的有益效果：本發明的發酵方法對解淀粉芽抱桿菌Bam22的培養十分有 利，獲得的芽抱多，且具有良好的生物活性。
【具體實施方式】
[0013] 下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是W下實施例只是用 于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據上述
【發明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
[0014] 下述實施例中所用的細菌于2015年9月6日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路1 號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保 藏號為CGMCCNo. 11329。
[001引 實施例1 1) 挑取經過在固體培養基上培養后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養 基中，于31°C震蕩培養11小時，轉速為200巧m，，作為種子液；所述液體培養基的成分按 質量百分數計為：酵母提取物0. 2%、牛肉浸膏0. 1%、蛋白腺0. 7%、化Cl0. 3 %、余量為水， 抑=7. 0 ; 2) 將步驟1)所得物置入發酵罐中進行發酵40小時，罐溫為30°C，發酵罐攬拌速度為 250巧m，空氣流量0.8 : 1 (V/Vm);發酵罐中的培養基的成分按質量百分數計為：豆粉4%、 蛋白腺0. 1%、葡萄糖0. 5%、淀粉2%、硫酸儘0. 1%、硫酸亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、碳酸巧 0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 0。
[001引實施例2 1) 挑取經過在固體培養基上培養后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養 基中，于32°C震蕩培養10小時，轉速為220rpm，作為種子液；所述液體培養基的成分按 質量百分數計為：酵母提取物0. 3%、牛肉浸膏0. 2%、蛋白腺0. 8%、化Cl0. 6%、余量為水， 抑=7. 0 ; 2) 將步驟1)所得物置入發酵罐中進行發酵50小時，罐溫為27°C，發酵罐攬拌速度為 220巧m，空氣流量0.9 : 1 (V/Vm);發酵罐中的培養基的成分按質量百分數計為：豆粉5%、 蛋白腺0. 15%、葡萄糖0. 7%、淀粉3%、硫酸儘0. 1%、硫酸亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、碳酸 巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 4。
[0017]實施例3 1)挑取經過在固體培養基上培養后的解淀粉芽抱桿菌Bam22單菌落，置于液體培養基 中，于30°C震蕩培養12小時，轉速為210rpm，作為種子液；所述液體培養基的成分按質量 百分數計為：酵母提取物0.25 %、牛肉浸膏0.12 %、蛋白腺0.75 %、化Cl0.5 %、余量為水， 抑=7.O; 2)將步驟I)所得物置入發酵罐中進行發酵48小時，罐溫為28°C，發酵罐攬拌速度為 220巧m，空氣流量1:I(VAm);發酵罐中的培養基的成分按質量百分數計為：豆粉4. 5%、 蛋白腺0. 12%、葡萄糖0. 6%、淀粉2. 5%、硫酸儘0. 1%、硫酸亞鐵0. 06%、憐酸氨二鐘0. 2%、 碳酸巧0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7.3。
[001引對比實施例 除了液體培養基中成分為牛肉浸膏0. 3%，酵母提取物0. 1%，蛋白腺0. 5%，葡萄糖 1. 0%，余料為水，pH7. 5,培養溫度為28°C;W及發酵罐罐溫為25°C之外，其余與實施例1 一 致。
[0019] 經檢測，實施例1、實施例2、實施例3所得菌液含芽抱量分別為6. 5X1〇9C化/ml、 7. 3X10?cfu/ml、8. 2X10?cfu/ml，而對比實施例所得菌液的菌濃僅為1.2Xl〇scfu/ml。
[0020] 實驗例 實施例3所得菌液用于十字花科根腫病的防治實驗 實驗對象：油菜、白菜、青花菜。
[0021] 將所得菌液稀釋200倍、500倍、800倍、1000倍，利用灌根法，移栽時每植株誘 100mL菌液稀釋液，移栽后7天第二次灌根，移栽后15天第=次灌根。
[0022] 病情分級： 0級：根部無腫瘤，根系發育正常； 1級：1-30%的根著少許腫瘤，有小的結節狀腫塊，相互不連接； 2級：31-60%的根著生腫瘤，有大的結節狀或球狀腫塊，相互連接； 3級：61-100%的根著生腫瘤，膨大到形成紡鍵形瘤，大的瘤塊一直延伸到下胚軸，植株 矮小，停止生長或死亡。
[0023] 病情指數=[(各級病株數X相對級數值）/最高級別X調查總株數]X 100。
[0024] 相對防效=(對照病情指數-處理病情指數）X 100/對照病情指數。
[0025] 實驗結果見表1、表2和表3:

【主權項】
1. 一種防治十字花科根腫病解淀粉芽孢桿菌Bam22的發酵方法，其特征在于，所述方 法包括如下步驟： 1) 挑取經過在固體培養基上培養后的解淀粉芽孢桿菌Bam22單菌落，置于液體培養基 中，于30-32°C震蕩培養10-12小時，轉速為200-220 rpm，作為種子液；所述液體培養基的 成分按質量百分數計包括：酵母提取物〇. 2-0. 3%、牛肉浸膏0. 1-0. 2%、蛋白胨0. 7-0. 8%、 NaCl 0· 3-0. 6%、余量為水，ρΗ=7· 0-7. 2 ; 2)將步驟1)所得物置入發酵罐中進行發酵40-50小時，罐溫為27-30°C，發酵罐攪拌 速度為220-250rpm，空氣流量0.8 : 1-1: 1(ν/ν·πΟ;發酵罐中的培養基的成分按質量百 分數計包括：豆粉4-5%、蛋白胨0. 1-0. 15%、葡萄糖0. 5-0. 7%、淀粉2-3%、硫酸錳0. 1%、硫酸 亞鐵0. 06%、磷酸氫二鉀0. 2%、碳酸鈣0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，ρΗ=7. 0-7. 4 ; 所述解淀粉芽孢桿菌Bam22于2015年9月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 11329。2. 根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，所述方法在步驟1)之前還包括步驟： 試管種的培養，所述試管種的培養方法為：將解淀粉芽孢桿菌Bam22置于斜面培養基中于 30°C下培養36小時；所述斜面培養基的成分按質量百分數計包括：酵母提取物0. 2-0. 3%、 牛肉浸膏 〇· 1-0. 2%、蛋白胨0· 7-0. 8%、NaCl 0· 3-0. 6%、瓊脂2%，余量為水，ρΗ=7· 0-7. 2。3. 根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述液體培養基的成 分按質量百分數計為：酵母提取物〇. 25%、牛肉浸膏0. 12%、蛋白胨0. 75%、NaCl0. 5%、余量 為水，pH=7. 2。4. 根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，所述步驟1)中，培養溫度為30°C，培 養時間為12小時。5. 根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，所述步驟2)中，發酵罐中的培養基的 成分按質量百分數計為：豆粉4. 5%、蛋白胨0. 12%、葡萄糖0. 6%、淀粉2. 5%、硫酸銨0. 1%、碳 酸鈣0. 1%、消泡劑0. 01%、余量為水，pH=7. 3。6.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于，所述步驟2)中，罐溫為28°C，發酵時 間為48小時。
【專利摘要】本發明提供了一種防治十字花科根腫病解淀粉芽孢桿菌Bam22的發酵方法，該方法包括：1）挑取經過在固體培養基上培養后的解淀粉芽孢桿菌Bam22菌落，置于液體培養基中，于30-32℃震蕩培養10-12小時，轉速為200-220rpm，作為種子液；2）將步驟1）所得種子液接入發酵罐中進行發酵40-50小時，種子液接入量為8%-10%，罐溫為27-30℃，發酵罐攪拌速度為220-250rpm，空氣流量0.8﹕1-1﹕1（V/V?m）；所述高效十字花科根腫病芽孢桿菌Bam22于2015年9月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC？No.11329。本發明的發酵方法對芽孢桿菌Bam22的培養十分有利，獲得的細菌數多，且細菌具有良好的活性。CGMCC No.06
【IPC分類】A01P3/00, C12R1/07, C12N1/20
【公開號】CN105296392
【申請號】CN201510725765
【發明人】劉勇, 黃小琴, 張蕾, 伍文憲, 劉紅雨, 周西全
【申請人】四川省農業科學院植物保護研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月2日