一種解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物保護領域，更具體設及一種能同時括抗蔬菜軟腐病和油茶主要病 害的解淀粉芽抱桿菌BacillusamyloliquefaciensD2WM，同時還設及一種解淀粉芽抱桿 菌BacillusamyloliquefaciensD2WM的制備方法，還設及一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM在制備治療或預防蔬菜軟腐病及油茶病藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 蔬菜軟腐病又稱水爛、爛瘡落，除危害十字花科蔬菜（如蘿K大白菜等）外，還 可危害馬鈴馨、番茄、窩宦、黃瓜、芹菜和蔥類等蔬菜，引起不同程度的損失。蔬菜軟腐病 發病初期，病部為水浸狀半透明，后擴大為淡灰褐色濕腐，病部組織黏滑，失水后表面下 陷，常溢出白色菌濃，并有惡臭，后期蔬菜整個軟化，全部爛掉，請見（易圖永.蔬菜軟腐 病[J].湖南農業，2015 (2) :28-29.)歐文氏菌巧rwinia)是引起植物軟腐病發生的主要 病原菌，它屬于腸桿菌科巧nterobacteriaceae)，主要包括胡蘿h軟腐歐文氏菌胡蘿h亞 種巧rwiniacarotovorassp.carotovora，Ecc)、胡蘿h軟腐歐文氏菌黑腔亞種巧rwinia carotovorassp.atroseptica，Eca)和菊歐文氏菌巧rwiniachrysanthemi，Ech)S個亞 種，請見（PerombelonM.Pot曰todiseasescausedbysoftrotErwini曰s:曰noverview ofpathogenesis[J].Plantpathology. 2002, 51 (I) : 1-12.)其中，Eca的專一性較強，主要 侵染溫帶上豆；Ecc在自然條件下寄主范圍和地理分布最為廣泛，可W侵染±豆、胡蘿K 芹菜、黃瓜、辣椒和菊宦等植物，遍布亞熱帶和溫帶等地；Ech則可侵染±豆、大麗花和玉 米等，請見（TothIKjBellKS,HolevaMC,etal.Softroterwiniae:fromgenesto genomes[J].Molecularplantpathology. 2002, 4(1):17-30.)近年來，蔬菜種植規模不斷 擴大，蔬菜病害逐步引起重視，其中尤W蔬菜軟腐病發生嚴重，造成的損失巨大。 陽00；3]油茶（Camelliaoleifera)屬山茶科（Theaceae)山茶屬（Camellia)，是我國特 有的一種高級油料作物，主要生長于中國南方亞熱帶地區高山及丘陵地帶，是重要的木本 油料樹種之一，請見（莊瑞林.中國油茶[M].北京：中國林業出版社，2008.)油茶種子含 大量優質的不飽和脂肪酸和維生素E，是一種在優質、耐儲藏的高級食用油，在食用油中占 重要地位；另外，茶油在醫藥、工業上也應用廣泛，可作為肥皂、凡±林、防誘油、潤滑油等的 原料；茶枯可做農藥，也是優質的有機肥料，還是提取拷膠、皂素、慷醒、活性炭等產品的原 料，提取后的固體殘渣可作為豬的精飼料。可W說，油茶全身都是寶，具有很好的應用開發 前景，對促進農民增收、加快山區綜合發展、維護國家糧油安全等方面有非常重要的作用。
[0004] 油茶病害種類繁多，其危害也愈發嚴重。油茶炭痘病、葉枯病、軟腐病是由病原物 引起的3種毀滅性病害，在我國各油茶產區普遍發生，油茶的地上各部位均可受害，主要引 起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干潰瘍、甚至整株死亡，請見（束慶龍，張良富.中國油茶栽培 與病蟲害防治[M]..北京：中國林業出版社，2009.)同樣，油茶根腐病、茶餅病、黑斑病、潰 瘍病等也時常發生，每年油茶產業因病害造成了巨大的經濟損失。近年來，湖北油茶種植規 模不斷擴大，相應的病害逐步引起重視。
[0005] 然而，目前對蔬菜軟腐病和油茶主要病害的防治普遍通過種植抗性品種和化學防 治來控制，過多使用化學殺菌劑有危害人類身體健康、藥物殘留破壞生態環境、引發病原物 產生抗藥性、影響蔬菜和茶油質量和食用安全等諸多缺點，不利于蔬菜和油茶產業的綠色 可持續發展。尋求安全、高效和經濟的生物源農藥已成為當前防治蔬菜和油茶病害的熱點 和當務之急，其中括抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。
[0006] 在植物病害的生物防治中研究和應用較多的微生物主要有細菌類、真菌類和放線 菌。芽抱桿菌度acilus)是一類理想的生防菌篩選對象，在目前生防細菌中研究較多。它 能夠抑制植物根部、枝干、葉、花和果實等各個部位的病害，應用范圍很廣。因其能夠產生耐 熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的抱子，因此十分利于生防芽抱桿菌在環境中的定殖與繁殖 及其發酵菌液的生產加工，請見（班慧芳.轉aiiA基因魔芋的軟腐病抗性及魔芋內生菌產 生抑菌蛋白的組成分析巧].華中農業大學，2009.)和（柴蠢莉，周盈，林擁軍，等.蘇云金 芽胞桿菌抗軟腐病aiiA基因轉花魔芋研究[J].分子植物育種，2007, 5(5) :613-618.)。目 前的生防芽抱桿菌主要包括枯草芽抱桿菌化subtilis)、巨大芽抱桿菌化megaterlum)、 多粘芽抱桿菌度.polymyxa)、短小芽抱桿菌度.pumilus)W及蠟狀芽抱桿菌度.cereus) 等。孫明等發明了一種對胡蘿h軟腐歐文氏菌具有抑菌活性的枯草芽抱桿菌BSn5及抑菌 蛋白APn5(【申請號】200710053427. 8)，該枯草芽抱桿菌的抑菌活性物質是蛋白APn5,只能 括抗胡蘿h軟腐歐文氏菌亞種，其生防范圍較窄；黃靜等公開了一種解淀粉芽抱桿菌化-1 在防治棉花黃萎病、大白菜軟腐病、青枯病、桃樹腐爛病、蘋果腐爛病等方面的應用（申請 號：201410735508. 6)，需利用解淀粉芽抱桿菌與殼寡糖組合成微生態菌劑，比較而言只對 棉花黃萎病的防治效果較好；劉君昂等公開了一種括抗油茶病害的短短芽抱桿菌Z26,能 夠有效抑制油茶炭痘病菌、根腐病、半邊瘋等病原菌的生長（【申請號】201110027957. 1)，該 生防菌劑對油茶炭痘病的最大抑制率達到83. 4%，還有進一步提高的空間；周國英等發明 了一種有效防治油茶病害的復合微生物源農藥及應用方法（【申請號】201310203845. 6)，公 開發明了一種由放線菌球抱鏈霉菌球抱亞種和細菌短短芽抱桿菌及其他助劑復配的微生 物農藥，可防治油茶一種或幾種主要病害，該復配的微生物農藥制備過程相對繁瑣，耗時較 長；也有利用枯草芽抱桿菌和蘇云金芽抱桿菌MLl分別在花生果腐病和魔芋軟腐病防治上 的相關報道（【申請號】201310708367. 4,【申請號】201510015310. 5)。然而，關于解淀粉芽抱 桿菌能同時在蔬菜軟腐病及油茶主要病害上的防治研究及應用報道很少。另外，文獻報道 多為針對油茶某一種病害的單一防治，目前市面基本沒有可W同時防治兩種W上油茶病害 效果很好的單一菌劑產品，且還未見對防治油茶黑斑病及油茶潰瘍病兩種病害的報道。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是在于提供了一種解淀粉芽抱桿菌Bacillusamyloliquefaciens D2WM，該解淀粉芽抱桿菌從健康油茶根際±壤分離篩選獲得，能同時高效的防治蔬菜軟腐 病和油茶主要病害，是一株具有廣譜括抗作用的生防芽抱桿菌，填補了單一微生物菌劑同 時防治歐文氏菌=個亞種和多種油茶病原真菌的技術空白，對軟腐病及油茶無公害防治具 有一定的實際意義。
[0008] 本發明的另一個目的是在于提供了 一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciensD2WM生防菌劑的制備方法，方法易行，操作簡便。菌劑經如下步驟得 至IJ:將LB平板或者斜面上的D2WM菌落挑取一環移植到試管活化，35°C搖床培養16h，轉速 150rpm，試管中LB液體培養基為：蛋白腺lOg/l，酵母提取物5g/l，氯化鋼5g/L，pH7. 0 ;活 化后的菌液按照1% -3%的接種量移植到裝有IOOmLLB液體培養基的250mL錐形瓶中，轉 速150巧m，35°C搖床培養10h-24h，當菌含量大于2XIO8C化/mLW上即可獲得發酵菌液，儲 存作為生防菌劑。該生防菌劑制作容易，生長速度快，液體培養代謝產物只需要在液體培養 基中培養l〇-24h即可獲得很好的括抗效果，相對于一般細菌、真菌大大縮短了培養時間， 降低了生產成本。
[0009] 本發明還有一個目的是在于提供了 一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制備治療或預防蔬菜軟腐病藥物中的應用，該生防菌株可同時 治療或預防凡是能由歐文氏菌引發的蔬菜軟腐病，包括青椒、紅椒、窩宦、±豆、輒瓜、白菜 軟腐病等。對胡蘿h軟腐歐文氏菌胡蘿h亞種、胡蘿h軟腐歐文氏菌黑腔亞種和菊歐文氏 菌=個亞種均有很好的括抗作用。
[0010] 本發明的第4個目的是在于提供了 一種解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM在制備治療或預防油茶主要病害藥物中的應用，該菌株的生防菌 劑可高效防治油茶炭痘病、葉斑病、黑斑病、潰瘍病等，液體發酵濾液抑菌率實驗表明，該解 淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM對油茶主要病害的抑菌率達到95% W 上。
[0011] 為了實現上述的目的，本發明采用W下技術措施：
[0012] 其技術構思是：采用常規法進行分離、純化和保存對軟腐病和油茶主要病害同時 有括抗作用的生防菌株。請見（姚麗逵，王埼，付學池，等.小麥紋枯病生防芽抱桿菌的篩 選及鑒定[J].中國生物防治，2008,24(1):53-57.)。W實驗室分離到的軟腐病菌為指示 菌，分離得到的菌株為待檢菌，將分離純化到細菌利用點接法依次