一種提高乳酸菌制劑熱穩定性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及乳酸菌，特別是涉及一種提高乳酸菌制劑熱穩定性的方法，主要用于 乳酸菌粉劑制品延長貨架期。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量 乳酸的細菌的通稱。這類細菌在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性。它們不僅是 研究分類、生化、遺傳、分子生物學和基因工程的理想材料，在理論上具有重要的學術價值， 而且在工業、農牧業、食品和醫藥等與人類生活密切相關的重要領域應用價值也極高。
[0003] 乳酸菌制劑的生產，通常是采用冷凍干燥法制得凍干粉，也有少數耐熱菌株可以 采用噴霧干燥法生產。對于大多數乳酸菌制劑，都對高溫敏感，即使常溫保存，也存在快速 失活的問題。乳酸菌制劑的常溫難保存的問題對乳酸菌在食品和飼料中的添加、流通等帶 來了很大限制，制約了乳酸菌的廣泛應用。為解決乳酸菌的穩定保存問題，人們開發了一系 列保護劑。凍干保護劑就是一種非常常用的乳酸菌保護物質，其一般是由奶粉、海藻糖、多 元醇等物質復合而成，其一方面可以減少乳酸菌在凍干過程中的損失，另一方面，可以提高 乳酸菌的熱穩定性。
[0004] 熱激處理是提高菌體穩定性的另一類重要方法，熱激處理是在乳酸菌發酵過程中 突然升溫保持一段時間，從而提高了微生物的熱穩定性。一般認為，此情況下，微生物的熱 穩定性的提高和熱激蛋白的產生有關。熱激蛋白（Heat Shock Protein，HSP)是在高低溫、 激素、高鹽、干旱、缺氧及機械損傷等多種環境脅迫下生物體內正常蛋白收到抑制而誘導合 成的新的或功能增強的應激蛋白，又被稱為熱休克蛋白。熱激蛋白最早是在1962年，由 Riotossa在果蠅上發現，至今，已經在幾乎所有的動植物、微生物體內發現熱激蛋白的合 成。采用熱激方法也是微生物制劑生產中一種常用的提高菌體熱穩定性的方法。盡管已經 開發了 一系列提尚乳酸菌熱穩定性的方法，但乳酸菌制劑的熱穩定性仍有待進一步提尚。

【發明內容】

[0005] 針對現有技術存在的不足，本發明旨在開發一種新型提高乳酸菌制劑熱穩定性的 方法，顯著提高乳酸菌制劑的熱穩定性。
[0006] 發明人課題組研究發現，發酵工藝的改變對于乳酸菌制劑凍干存活率、凍干粉穩 定性等均具有重要影響，包括發酵培養基、培養溫度、發酵周期等參數是重要影響因素，其 中，發酵溫度是影響最為顯著的因素，且發現，發酵溫度和培養基組成間存在交互作用關 系。采用合適的發酵培養基和發酵條件，可以顯著提高乳酸菌制劑的熱穩定性。魚抽提物 為是魚粉生產時所副產的魚湯經油脂分離和濃縮而得到的產物。魚抽提物是采用魚體生產 的一種復合營養物，其一般的生產方法是將蒸煮后的魚擠壓獲得富含可溶性組分的液體， 然后濃縮標準化所得到的一種產物。
[0007] 本發明在利用魚溶漿作為培養基研究乳酸菌制劑穩定性時，意外地發現采用魚溶 漿作為乳酸菌的營養源，并且采用至少2次升溫熱激的發酵工藝，可以獲得更高穩定性的 乳酸菌制劑。
[0008] 本發明目的通過如下技術方案實現：
[0009] -種提高乳酸菌制劑熱穩定性的方法，采用魚溶漿為營養源，乳酸菌發酵過程中 采用程序性變溫控制，其方法是：在乳酸菌發酵周期中，至少采用2次升溫熱激發酵處理， 兩次升溫熱激發酵的時間間隔為2~5hr，且每次熱激處理時間為10~30min，熱激發酵 溫度比正常發酵溫度高3~1(TC，發酵結束收獲菌體干燥處理；所述正常發酵溫度為35~ 42。。。
[0010] 為進一步實現本發明目的，優選地，所述程序性變溫控制的具體過程為：先采用 正常發酵溫度發酵6~15h，然后進行第一次熱激發酵處理，再降溫至正常發酵溫度發酵 l_3h，之后進行第二次熱激發酵處理，再次降溫至正常發酵溫度發酵8~15h。
[0011] 優選地，所述熱激發酵溫度為比正常發酵溫度高5~8°C。
[0012] 優選地，采取3次以上熱激發酵處理。先采用正常發酵溫度發酵6~10h，然后進 行第一次熱激發酵處理，再降溫至正常發酵溫度發酵l_3h，之后進行第二次熱激發酵處理， 再次降溫至正常發酵溫度發酵6~10h，之后進行第三次熱激發酵處理，再次降溫至正常發 酵溫度發酵6~10h。
[0013] 優選地，所述乳酸菌包括：短乳桿菌（Lactobacillus, brer is)、嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus, acidophilus)、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)、纖維二糖乳桿菌（Lactobacillus, helveticus)、彎曲乳桿菌（Lactobacillus, curvatus)、德式乳桿菌、發酵乳桿菌 (Lactobacillus, fermentum)、乳酸乳桿菌（Lactobacillus, casei)、植物乳桿菌 (Lactobacillus, plantarum)、乳脂鏈球菌（streptococcus, cremoris)，二丁 酮鏈球 菌（Streptococcus, diacetylactis)、奠鏈球菌（Streptococcus, faecium)、乳酸乳球 菌（Lactococcus. lactis)、嗜熱鏈球菌（(Streptococcus, thermophilus))、乳酸片球 菌（Pediococcus. acidilactici)、啤酒片球菌（Pediococcus. cerecisiae)、戊糖片球菌 (Pediococcus. pentosaceus)和雙歧桿菌（Bifidobacterium)中的一種或兩種以上的混合 物。
[0014] 優選地，所述干燥處理為冷凍干燥或噴霧干燥。
[0015] 優選地，所述冷凍干燥是加入凍干保護劑，冷凍干燥得到菌粉。
[0016] 優選地，以質量份數計，所述魚溶漿為營養源的培養基配方組成為：魚溶漿15 - 25 份、檸檬酸氫二銨1. 5 -2. 5份、葡萄糖15 -25份、乙酸鈉4 - 6份，磷酸氫二鉀1. 5 -2. 5份， 硫酸鎂0. 5 -1.份，硫酸錳0. 2 - 0. 3份，吐溫801 - 2份，蒸餾水適量；控制pH值為6 - 6. 8。
[0017] 通常乳酸菌是發酵培養基一般應包含乳制品、酵母膏、蛋白胨等營養物。而本發明 中特別限定采用魚溶漿為營養源。魚溶漿是魚粉生產的副產物，現已標準化生產。其生產 工藝流程如下：魚粉生產工藝的第一步是魚的蒸煮，經過蒸煮魚肉變硬，為下一步操作打下 基礎；第二是壓榨，壓榨是將魚肉和魚湯分開，魚湯分離去除油脂經過濃縮，即可得到魚溶 漿。魚溶漿含有豐富的營養，包括核苷酸、牛磺酸、氨基酸和多肽等，對微生物的生長具有促 進作用。通常，魚溶漿被濃縮至40 %左右的水分含量，被用作飼料原料，用法和魚粉類似，但 目前尚未見采用魚溶漿作為發酵培養基的報道。
[0018] 對于魚溶漿提高乳酸菌熱穩定性的機理，目前尚未有明確的答案。一種可能的解 釋是乳酸菌生長一般對營養要求較高，而魚溶漿中豐富的營養物質，可以更好地幫助乳酸 菌適應各種不利的環境。目前，關于營養源對于乳酸菌適應力的報道還不多見。關于魚溶漿 提高乳酸菌熱穩定性的另一個機理可能和魚溶漿中的多肽有關，分析表明，魚溶漿的中分 子量小于500的多肽高達蛋白的30%以上，多肽可以為乳酸菌營造一個良好的保護環境， 提高乳酸菌的抗逆性。
[0019] 關于乳酸菌的熱激方法，一般的處理是一次熱激，熱激時間通常為30min左右，發 明人發現，多次熱激具有更好的效果，優選地，采取3次以上熱激。每次熱激處理時間為5~ 30min，熱激溫度為比正常發酵溫度高3~8°C。發酵結束，需要收集菌體進行干燥處理，乳 酸菌通常采用凍干的方式進行粉劑生產，但不局限于凍干，亦可以采用噴霧干燥的方式的 生產。
[0020] 相對于現有技術，本發明具有如下優點和有益效果：
[0021] 采用本發明技術，和傳統技術相比，可以顯著提高乳酸菌干粉制劑的熱穩定性，尤 其是解決乳酸菌制劑在非冷鏈物流時的穩定性問題，使得乳酸菌具有更長貨架期，對于產 品的應用推廣具有重要意義。另外，采用魚溶漿作為乳酸菌的發酵培養基，實現了廢物利 用，具有成本低廉的優點。
【具體實施方式】
[0022] 為更好地理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但是本發明的 實施方式不限如此。
[0023] 培養基1配方（MRS培養基）：蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母膏5. 0g，檸檬酸氫 二銨2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐溫801. OmL，乙酸鈉5. 0g，磷酸氫二鉀2. 0g，硫酸鎂0· 58g，硫酸 錳 〇· 25g，蒸餾水 1000mL，ρΗ6· 5。
[0024] 培養基2配方：魚溶漿20. 0g，檸檬酸氫二銨2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐溫801. OmL，乙 酸鈉5. 0g，磷酸氫二鉀2. 0g，硫酸鎂0. 58g，硫酸錳0. 25g，蒸餾水1000mL，pH6. 5。
[0025] 凍干保護劑：以質量百分比計，凍干保護劑的組成為：脫脂奶粉90%，海藻糖8%， 甘氨酸2%。
[0026] 本發明對比例和實施例中涉及的各菌種均為市售通用產品或保藏菌株，購買獲 得。
[0027] 對比例1
[0028] 5L發酵罐，加入3. 5L培養基1，接種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ATCC 8014)，于37°C發酵24hr后離心收獲菌體，按照菌泥的2倍加入凍干保護，凍干保護劑加入 前用2倍無菌水溶解，凍干得到菌粉1。
[0029] 對比例2
[0030] 5L發酵罐，加入3. 5L培養基2,接種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum W - 9)，于37°C發酵24hr后離心收獲菌體，按照菌泥的2倍加入凍干保護，凍干保護劑加入 前用2倍無菌水溶解，凍干得到菌粉2。
[0031] 對比例3
[0032] 5L發酵罐，加入3. 5L培養基1，接種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum W - 9)，于37°C發酵12hr后，升溫至42°C熱激發酵30min，然后恢復37°C發酵2小時，再升 溫至47°C熱激發酵lOmin，然后恢復37°C發酵，直至完成24hr發酵周期，離心收獲菌