海洋芽孢桿菌、分離方法、海洋右旋糖苷酶制備方法及應用
【專利說明】海洋芽抱桿菌、分離方法、海洋右旋糖昔酶制備方法及應用 【技術領域】
[0001]本發明設及微生物醫療技術領域，具體設及一種海洋芽抱桿菌、其分離方法、海洋 右旋糖巧酶的制備方法W及它們口腔護理、日化方面的應用。 【【背景技術】】 陽00引右旋糖酢酶（dextranase,EC3. 2. 1. 11)是專一'性切割a-1,6糖巧鍵葡聚糖中a-1,6糖巧鍵的酶。按切割方式分類將右旋糖酢酶分成外切型和內切型。右旋糖酢是一種 葡萄糖分子Wa-1,6糖巧鍵為主鏈，同時含有少量a-1,3、a-1,4等糖巧鍵構成的支鏈， 而形成的葡聚糖大分子。外切型右旋糖酢酶從右旋糖酢的非還原端開始，逐一將葡萄糖分 子切割下來，其終產物為葡萄糖分子及無法切割的部分；內切型右旋糖酢酶在右旋糖酢分 子的內部隨機切割，生成少量的葡萄糖和異麥芽寡糖。經研究發現霉菌、酵母菌和細菌都能 產生右旋糖酢酶。
[0003] 1968年Fitzgerald首次報道了右旋糖酢酶在離病防治方面的可行性，自此多國 科學家參與研究，進行動物實驗、體外人工牙菌斑實驗，最終證明此酶確實有抑制牙菌斑生 物膜形成的作用。1969年Gibbons和Keyes在倉鼠的飲用水中加入右旋糖酢酶，在離病防 治中效果明顯。2004年，Wiater等人研究了真菌葡聚糖酶對口腔鏈球菌生物膜中變聚糖的 影響，結果表明變聚糖酶與右旋糖巧酶可W有效地預防牙菌斑生物膜的形成，尤其是兩種 酶聯用時作用效果更好。2010年，Yano等人研究發現右旋糖巧酶與香茹多糖共同存在時抑 制生物膜形成的能力增強且對已形成的生物膜也具有降解作用，單獨使用右旋糖巧酶時則 對已形成的生物膜的作用效果甚微。近年來還出現了各種通過基因工程手段治療牙菌斑生 物膜的研究，例如將編碼右旋糖巧酶的基因在口腔細菌中克隆表達。目前丹麥Novo公司、 美國Miles公司已有商品右旋糖巧酶制品出售。Novo公司右旋糖巧酶的生產主要由青霉屬 發酵獲得，美國Miles公司生產的右旋糖巧酶則主要通過毛殼菌屬發酵生產獲得。運些酶 主要應用于制糖工業。運兩種微生物來源的右旋糖巧酶尚未被美國食品藥物管理局批準認 可用于食品行業。為了預防牙菌斑生物膜的形成，目前國外已經設計了多種含右旋糖巧酶 的口腔護理產品。2001年，Song等人對斯氏油脂酵母Lipomycesstarke}d突變株KSM22 右旋糖巧酶漱口液進行了臨床實驗。結果表明，與使用含0. 12%洗必泰漱口液的實驗組相 tk，Lipomycesstark巧i突變株KSM22右旋糖巧酶漱口液在牙菌斑及牙銀炎的防治方面 效果要好，而且引起的副作用較小。2004年Masaru等人再次證實了右旋糖巧酶漱口液可W 有效地預防牙菌斑生物膜的形成，而且長期使用后效果會越來越好。
[0004] 目前國內關于右旋糖巧酶在牙菌斑生物膜防治中的應用的報道并不多見，而且相 對集中。1988年中國科學院微生物研究所孫晉武等人證明了淡紫擬青霉右旋糖巧酶可W抑 制變異鏈球菌產生胞外多糖，降低形成牙菌斑的可能性。此后北京口腔醫院趙寶榮等人通 過動物實驗及臨床實驗再次證實了淡紫擬青霉右旋糖巧酶對牙菌斑的抑制作用。2007年四 川大學華西口腔醫學院蔣丹研究了美國Sigma公司青霉屬右旋糖巧酶對變異鏈球菌單菌 種生物膜的作用效果，結果顯示右旋糖巧酶能降解變異鏈球菌生物膜中的胞外多糖。 陽〇化]盡管國內已出現關于右旋糖巧酶的部分防離報道，但尚未出現含右旋糖巧酶的口 腔護理產品。究其原因主要包括右旋糖巧酶的微生物來源及右旋糖巧酶的酶學特性。右旋 糖巧酶的產生菌主要為霉菌，用霉菌來生產預防口腔牙菌斑的右旋糖巧酶存在一定的安全 性問題，且產酶時間長，如果用在牙膏中，還存在堿性條件下不穩定的問題。 【
【發明內容】
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[0006] 本發明要解決的技術問題在于擴展口腔護理微生物的種類，特別是開發安全性能 高的海洋芽抱桿菌在口腔護理中的應用，W改善現有技術存在的缺陷。
[0007]為此，本發明提供一種海洋芽抱桿菌度acillusSP.)，所述菌株為kl，保藏單位： 武漢大學中國典型培養物保藏中屯、保藏日期：2015年7月9日，保藏號：CCTCCM2015437。
[0008] 所述菌株的16SrDNA基因序列為沈QIDNo. 2。
[0009] 本發明另一方面提供了一種海洋芽抱桿菌的菌株分離方法，包括下述步驟：
[0010] 于溫度為20~30°C的條件下，將勸海沉積物在固體培養基活化培養1~2天后分 離得到，其中，所述述固體培養基的質量組分如下： 1] 屯、腦粉0. 8~1. 0份，蛋白腺0. 5~0. 75份、瓊脂1. 0~1. 5份，人工海水100份， 抑為7. 5~8. 0。
[0012] 本發明再一方面提供了一種海洋右旋糖巧酶的制備方法，包括下述步驟：
[0013] 將所述海洋芽抱桿菌的菌株接種于液體種子培養基，在20~3(TC的條件下振蕩 培養24~36小時，獲得種子培養液，其中，所述液體種子培養基的質量組分如下：屯、腦粉 0. 8~1. 0份，蛋白腺0. 5~0. 75份，滅菌天然海水100份，抑為7. 5~8. 0;
[0014] 按體積比為1~5%將步驟所述種子培養液接種于發酵培養基，經發酵培養后，離 屯、取上清，制得發酵液，其中，所述發酵培養基的質量組分如下：屯、腦粉0.8~1.2份，蛋白 腺0. 1~0. 5份，化Cl0. 1~0. 2份，胞2冊〇4 0. 05~0. 1份，滅菌天然海水100份，抑為 8. 0 ;
[0015] 將所述發酵液過濾膜，濾液經冷凍干燥后制得海洋右旋糖巧酶。
[0016] 在一些實施例中，在完成上述步驟后，還包括將所述海洋右旋糖巧酶進行分離純 化的步驟。
[0017] 在一些實施例中，所述屯、腦粉是由牛屯、腦經過脫脂、凍干、研磨、過篩后得到。
[0018] 在一些實施例中，所述發酵培養的溫度為20~30°C，時間為26~30h。
[0019] 在一些實施例中，所述分離純化溫度為4~6°C。
[0020] 此外，本發明還提供了的上述海洋右旋糖巧酶的用途，所述海洋右旋糖巧酶在口 腔護理、日化上的應用。
[0021] 本發明的提供了一種海洋芽抱桿菌，將其應用于口腔護理、日化、海洋生物醫療 中，拓展了生物醫療微生物的范圍。本發明應用于上述海洋芽抱桿菌制備得到海洋右旋糖 巧酶，對變異鏈球菌具有抑制其生物膜形成的功能，除了可W應用于離齒防治及在醫療，日 化等方面W外，對海洋生物醫藥等方面也具有巨大的應用潛力。 【【附圖說明】】
[0022] 圖1為右旋糖巧酶產生菌株周圍的藍色透明圈；
[0023] 圖2為發酵溫度與海洋胞外右旋糖巧酶酶活的關系圖；
[0024] 圖3為發酵時間與海洋胞外右旋糖巧酶酶活的關系圖；
[00巧]圖4為最適發酵條件下細菌的生長曲線（A)與產酶曲線度）圖。 【【具體實施方式】】
[00%] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖和具體實施 例對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用于解釋本發明，而 非限定本發明。
[0027]本發明提供一種海洋芽抱桿菌度acillusSP.)，所述菌株為kl，保藏單位：武漢 大學中國典型培養物保藏中屯、，保藏日期：2015年7月9日，保藏號：CCTCCM2015437。
[0028] 經測定，所述芽抱桿菌的菌株16SrDNA基因序列為SEQIDNo. 2,經檢索，在 Genebank數據庫中未發現完全相同的序列。
[0029] 由于篩選的微生物為芽抱桿菌，已經作為口腔護理產品來源菌株，芽抱桿菌已在 化妝品生產名錄內，無需再做額外檢測。
[0030] 本發明