一種解淀粉芽孢桿菌ws-8及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株解淀粉芽孢桿菌WS-8及其應用，屬于農業微生物及生物技術領 域，具有改善葉色、提高葉片葉綠素含量、提高植株系統抗病性、防治作物葉面氣傳真菌病 害、提尚品質的功效。
【背景技術】
[0002] 葉霉病的病原菌為Fulvia fulva(Cooke)Cif.，屬半知菌亞門褐孢霉屬，異名為黃 枝孢菌Cladosporium fulvumCooke，是設施番前栽培中常見的病害，該病傳播快、危害重， 一般造成減產20-30%，嚴重時可達50%以上。目前主要采用化學藥劑進行防治，但由于它的 致病性分化繁雜而且復雜，存在許多生理小種;導致化學農藥的防治效果越來越差，藥劑的 用量越來越大，造成蔬菜的農藥殘留超標，種植環境被嚴重污染，阻礙了農業的可持續發 展。生物農藥憑借其低殘留、對環境無污染的優勢，及對農業的可持續發展、農業生態環境 的保護、食品安全的保障具有重要的作用，而受到越來越廣泛的關注與厚愛。
[0003] 芽孢桿菌Bacillus spp.是一類好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陽性、產芽孢的桿狀 細菌。芽孢桿菌產生的芽孢，有較強的抵抗干燥、熱和紫外線輻射等外界環境壓力的能力， 同時芽孢桿菌種群中有許多具有特殊功能的菌株，可產生許多種活性物質，如多肽、環肽、 氨基酸、蛋白酶及香豆素等，所以在工業、農業、醫學和食品加工等領域中有廣泛的應用價 值。由于生防芽孢桿菌具有抑制多種植物病原菌的能力，并且是自然界中廣泛存在的非致 病細菌，對人畜無害，對環境友好，因此，備受國內外植物保護和環境保護專家的青睞。目 前，生防芽孢桿菌廣泛應用于植物根部、枝干、葉片以及果蔬采后病害的防治上。
[0004] 美國已有3株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和1株解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens獲得環保局(EPA)商品化生產應用許可，進入大面積推廣應用。其中解 淀粉芽孢桿菌FZB42和枯草芽孢桿菌GB122混用制成的殺菌劑商品名為BioYield，由 Gustafson公司研發，應用于防治蔬菜、櫻桃、葡萄、萌蘆和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰 霉病等病害。國內殺菌劑截止到2014年12月，只有1種解淀粉芽孢桿菌的可濕性粉劑進行 登記，用于防治稻瘟病。
[0005] 據預測，2014-2020年間全球農藥生物農藥在消費量和市值需求上將獲得10%以上 的快速增長，而亞太地區有望獲得最快速的增長。隨著"十三五"規劃的制定，國家更加重視 綠色農業的發展、更注重生態環境的保護，蔬菜種植的生物農藥使用比例會越來越大，為生 物農藥的發展提供了更為廣闊的空間。目前已經授權及公開的專利，多為解淀粉芽孢桿菌 防治土傳真菌病害、防治水果采后病害，防治蔬菜葉面真菌病害的相關研究較少，利用解淀 粉芽孢桿菌防治番茄葉霉病未見相關報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌及其用途，該菌株適宜于露地及棚室條 件，可提高植株系統抗病性，可控制植株葉面氣傳真菌病害及土傳真菌病害，尤其能防治番 茄葉霉病。
[0007] 本發明采用如下技術方案： 本發明所述的菌株WS-8為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏號為 CGMCC No. 11787，保藏日期為2015年12月4日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所， 郵編 100101。
[0008] 本發明的解淀粉芽孢桿菌培養條件簡單，于牛肉膏蛋白胨培養基平板上菌落呈白 色，圓形、中間凹陷、表面光滑、不透明，電鏡下觀察菌體大小約為〇·7μηι~0·8μηιΧ 1 ·8μηι~3 Μ，芽胞中生，橢圓形;革蘭氏陽性、兼性厭氧菌;生理生化指標結合16S rDNA的分析，確定 該菌株為解淀粉芽孢桿菌。
[0009] 本發明所述解淀粉芽孢桿菌WS-8的最佳發酵培養基配方為：淀粉0.7%，豆餅粉 1.6%，蔗糖0.2%，酵母膏0.08%，蛋白胨0.05%，硫酸銨0.15%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂 0.03%，硫酸錳0.01%，氯化鈉0.02%，碳酸鈣0.1%，pH7.3-7.5，以上均為質量百分比。
[0010] 本發明還提供了解淀粉芽孢桿菌WS-8在防治作物葉面氣傳真菌病害及土傳真菌 病害中的應用，具體地，所述作物葉面氣傳真菌病害為:梨輪紋病、梨黑斑病、黃瓜灰霉病、 番前葉霉病、番前灰霉病、番前早疫病或番前煤污病，所述土傳真菌病害為立枯病、枯萎病、 黃萎病或蔓枯病。
[0011] 優選地，用于防治作物葉面氣傳真菌病害，將所述解淀粉芽孢桿菌的發酵液10-100倍稀釋后噴施于葉面，優選50倍稀釋(孢子數為1億/ml)，7-15天噴施一次。用于防治土 傳真菌病害時，將所述解淀粉芽孢桿菌的發酵液10-100倍稀釋后灌根，優選10倍稀釋(孢子 數為5億/ml)。
[0012] 本發明還提供了所述解淀粉芽孢桿菌WS-8在提高作物生理生化指標及品質中的 應用，具體為用于提高作物葉片中葉綠素含量、可溶性蛋白含量及作物抗壞血酸含量。優選 將所述解淀粉芽孢桿菌WS-8的發酵液10-100倍稀釋后噴施于作物，優選50倍稀釋(孢子數 為1億/ml)，間隔10天噴施一次。
[0013] 本發明所述的解淀粉芽孢桿菌WS-8發酵液稀釋50倍葉面噴施，對番茄葉霉病的防 效可達72%;同時可有效改善葉色，提尚葉片中葉綠素的含量;提尚葉片的光合能力，促進光 合產物可溶性蛋白的合成;提高番茄中抗壞血酸的含量，改善番茄品質。葉面噴施對棚室內 氣傳真菌病害番茄灰霉病、番茄早疫病、黃瓜灰霉病、黃瓜白粉病、黃瓜霜霉病的防效分別 達70.2%、71%、70.8%、72%、71.1%;對采后梨的輪紋病和黑斑病的防效達64%、69% ;灌根對棚 室內番茄枯萎病和黃萎病土傳真菌病害的防效分別達61.8%和62%，對食源性的金黃色葡萄 球菌也有很好的抑制作用。可見該菌株的高效應用可有效降低真菌病害的發病率，減少產 品的農藥殘留，保護了環境的生態安全，其潛在市場應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明解淀粉芽孢桿菌WS-8的系統發育樹。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作更進一步的說明，以便本領域內的技術 人員了解。
[0016] 實施例1:解淀粉芽孢桿菌WS-8的分離及鑒定 于石家莊鹿泉大河鎮番茄、黃瓜種植棚室采集染病和健康蔬菜葉片，在本實驗室依照 下列條件培養，即可獲得本發明的廣譜抗菌解淀粉芽孢桿菌WS-8: 菌株WS-8的分離和純化:將健康樣品和去除腐爛及霉菌后染病葉片，采用梯度稀釋的 方法，將10克葉片放入磷酸緩沖液中，室溫200r/min震蕩30min，超聲處理5min，制得菌懸 液涂布平板，挑取單菌落采用劃線的方法進行純化。
[0017] 拮抗菌株WS-8篩選:將純化出的單菌落，以番茄葉霉病、早疫病為目的病原菌株進 行抗病菌株的初篩及復篩;獲得拮抗效果好的菌株WS-8菌株。
[0018] 本發明所述的解淀粉芽孢桿菌WS-8依據其菌落形態和個體形態學特征、生理生化 特征及16S rDNA基因序列的系統進化分析進行鑒定。
[0019] 該菌株的個體形態與菌落特征如下：電鏡下觀察菌體大小約為0.7μπι~0.8μπι X 1.8μπι~3μπι，芽胞中生，橢圓形。培養條件簡單，于牛肉膏蛋白胨培養基平板上菌落呈白色， 圓形、中間凹陷、表面光滑、不透明、邊緣不整齊。
[0020] 該菌株的部分生理生化鑒定結果如下表： 表1菌株WS-8的生理生化鑒定結果