漢坦病毒集成式核酸檢測試劑盒及檢測方法
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發明屬于生物技術檢測領域，特別涉及漢坦病毒核酸檢測試劑盒。
【背景技術】
[0003] 蟲媒病是一類重要的傳染病。近20年來，全球新發現的30多種傳染病中，許多是 由病媒生物傳播的。目前我國法定的傳染病有36種，其中鼠疫、腎綜合征出血熱、瘧疾、登 革熱與登革出血熱等13種疾病為蟲媒病。這類疾病在我國每年傳染病總發病病例中約占 5%-10%，死亡數占傳染病總死亡數的30%-40%。
[0004] 漢坦病毒（Hantavirus)是引起腎綜合征出血熱（HFRS)和漢坦病毒肺綜合征 (HPS)的病原體，屬布尼亞病毒科（Bunyaviridae)漢坦病毒屬（Hantavirus)單股負鏈RNA 病毒。目前，全球已有40多種不同分型的漢坦病毒，其中22個型的漢坦病毒可引起人類疾 病。漢灘型漢坦病毒（HTNV)和漢城型漢坦病毒（SEOV)是引起我國HFRS的主要病原體，嚙 齒動物是漢坦病毒的主要宿主。
[0005] 近半個世紀以來，腎綜合征出血熱嚴重危害我國人民健康和生命安全。20世紀50 年代共發生3568例、60年代23164例、70年代143949例、80年代696074例、90年代488330 例。病死率從1980年的6. 4%降至1993年的1.6%。該病至今仍在我國東北及環渤海地區 廣泛流行，尚無特殊的治療方法及特效藥。
[0006] 隨著國際貿易和旅游業的發展，病媒生物及其攜帶的病原體可借助交通工具、集 裝箱、貨物等在國際間傳播。使原本局限于一定地域內的蟲媒病突破國境或自然地理的界 限，在全球范圍內廣泛傳播與流行，對輸入國的衛生安全特別是口岸地區的衛生安全造成 極大的威脅。
[0007] 鼠類是出入境交通工具中常見的媒介生物之一，可隨飛機、輪船等載體在國境口 岸之間擴散。歷史上多次發生由于鼠類入境造成疫病暴發流行的事例。1898年，一艘汽船 將染有鼠疫耶爾森菌的褐家鼠 （Rattus norvegicus)從印度帶到了馬達加斯加島，褐家鼠 在該島大量繁殖，使當地鼠疫頻繁發生。近年來，我國衛生檢疫機構在北京、上海、寧波、成 都等口岸的入境飛機、輪船、集裝箱中查獲大量的鼠類。鼠類的輸入對我國國境口岸的衛 生安全構成嚴重威脅。
[0008] 加強對嚙齒動物等，尤其是輸入性鼠類進行漢坦病毒檢測是對漢坦病毒進行預 防、控制的基礎和前提，漢坦病毒檢測方法主要有血清學檢測和核酸檢測，血清學檢測主要 有免疫熒光測定（IFA)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)、免疫層析試紙條等。隨著分子生物學 技術的不斷發展，核酸檢測技術被越來越多的應用到病原檢測中來，該技術具有較高的敏 感性，尤其適合于病毒載量低的樣品。
[0009] 核酸檢測主要包括引物設計、反應體系和反應條件優化、核酸擴增、電泳凝膠檢測 和結果分析等。如果沒有預先的儲備，一名熟練的實驗室工作人員從接收樣品到準備、檢測 和分析，需一周左右的時間。如果無法及時獲取陽性樣品對反應組成、反應條件進行探索， 上述時間將明顯延遲或根本進行檢測。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是解決漢坦病毒檢驗檢疫問題，提供一種漢坦病毒集成式核酸檢測 試劑盒，試劑盒簡單實用，特異性強，敏高性高，使用者只需將處理后的樣品加入反應管中， 即可進行擴增反應。
[0011] 本發明漢坦病毒集成式核酸檢測試劑盒，包括漢坦病毒巢式PCR第一輪及巢式 PCR第二輪反應體系，其中PCR第一輪反應體系包括一對通用引物HTV - MFO、HTV - MRO ; PCR第二輪反應體系包括漢城型引物SEO-MF、SEO-MR和漢灘型PCR引物HMF、HMR，引物序列 如下：
所述PCT第一輪為RT-PCR反應體系，總體積為50 μL，包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ) 2.0 μL，補充 RNase Free H2O 使總體積達到 50 μι; 所述PCR第二輪漢城型反應體系總體積為50 μL，包括DNA Polymerase (IU/ μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SEO-MF (2〇μΜ) 2· 0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，補充 ddH20 30.0 μL，使總體積達到 50 ? ； 所述PCR第二輪漢灘型反應體系總體積為50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 μL，4XdNTP 5.0 μL，模板4.0 μL，引物HMF (2〇μΜ) 2.0 μL，弓丨 物 HMR (2〇μΜ)2·0 μL，補充 ddH20 30.0 μL，使總體積達到 50 μL。
[0012] 本發明漢坦病毒集成式核酸檢測方法， (1)漢坦病毒核酸檢測引物的設計與合成：以漢坦病毒M片段設計并合成RT-PCR通用 外引物HTV - MFO、HTV - MRO，擴增片段大小為445 bp ;漢城型PCR引物SEO-MF、SE〇-MR，擴 增片段大小為417 bp;漢灘型PCR引物HMF、HMR，擴增片段大小為382 bp，引物序列如下：
(2) PCR反應體系的建立： RT-PCR 反應體系為 50 μL，包括 Enzyme Mix 2.0 μL，2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ)2·0 μL，補充 RNase Free H2O使總體積達到50 μL ;將RT-PCR反應體系的混合液，模板RNA除外，分裝至200 μL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷凍3 h以上，將PCR管置于凍干機內進行真空干燥 處理3h，保存于-20°C冰箱中待用； PCR第二輪漢城型反應體系為50 μL，包括DNA Polymerase (1U/μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SE0-MF(2(^M)2.0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，補充ddH20 30. 0 μL，使總體積達到50 μι;將PCR第二輪漢城型反 應體系的混合液，模板除外，分裝至200 PL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷凍3 h 以上，將PCR管置于凍干機內進行真空干燥處理3h，保存于-20°C冰箱中待用； PCR第二輪(漢灘型）反應體系為50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL， 10XPCR Buffer 5.0 μL，4 XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL，引物 HMF (20ΜΜ) 2.0 μL，引物 HMR (2〇μΜ)2. 0 μL，補充CldH2O 30. 0 μL，使總體積達到50 μι;將PCR第二輪漢灘型反應體系的 混合液，模板除外，分裝至200 PL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷凍3 h以上，將 PCR管置于凍干機內進行真空干燥處理3h，保存于-20°C冰箱中待用； (3) 實時熒光定量PCR反應：RT-PCR反應條件包括50°C 30min;94°C 3min，94°C 20 s，54°C 30s，72°C 30s，40 cycles ;72°C 5min; PCR 第二輪漢城型反應條件包括 94°C 3min ;94°C 15 s，53°C 25s，70°C 25s，38 cycles ；70°C 5min ； PCR 第二輪漢灘型反應條件包括 94°C 3min;94°C 15 s，56°C 25s，72°C 25s，35 cycles ；72 °C 5 min〇
[0013] 本發明對漢坦病毒集成式核酸檢測試劑盒進行評價，包括敏感性、特異性、重復性 及穩定性評價： 所述敏感性評價采用的方法及結果是：將RT-PCR反應體系用RNase Free H2O復溶，或 根據加入模板RNA的情況減少RNase Free H2O加入量，使反應總體系為50 μΜ將待檢模板 用RNase Free H2O作10倍系列稀釋，按原反應組成、反應條件進行檢測試驗；以能夠檢出 陽性樣品的最低濃度為該試劑盒的檢測下限，即敏感度； 所述特異性評價采用的方法及結果：用本發明的漢坦病毒集成式核酸檢測試劑盒檢測 登革病毒（I型)、登革病毒（II型)、登革病毒(III型)、登革病毒(IV型)、西尼羅病毒、流行性 乙型腦炎病毒； 所述重復性評價采用的方法及結果：從同批次制備的試劑盒中，分別隨機抽取20套裝 有混合試劑的PCR管，各平分為兩組，分別檢測陽性樣品和陰性樣品，進行3批次試驗； 所述穩定性評價采用的方法及結果：在不同的溫度條件下(常溫、4°C和-20°C)保存試 劑盒，一定時間后檢測同一濃度的陽性和陰性樣品并與原檢測結果比對，觀察試劑盒的穩 定性；將檢測試劑盒在常溫、4°C和-20°C條件下分別保存7天、30天和1年，試劑盒對相應 樣品的檢測結果沒有明顯的變化。
[0014] 本發明漢坦病毒集成式核酸檢測試劑盒，充分考慮國境口岸衛生檢疫工作的實際 需要，在試劑盒中按比例優化整合了核酸擴增所需要的引物、酶、dNTPs、緩沖液等多種試 劑，并進行真空干燥處理，便于長期保存和運輸。使用者只需將處理后的媒介樣品加入反應 管中，即可進行擴增反應，簡便實用。
【附圖說明】
[0015] 圖1為漢城型漢坦病毒擴增電泳圖。
[0016] 圖2為漢灘型漢坦病毒擴增電泳圖。
【具體實施方式】
[0017] 為了使本發明更容易被理解而不是限制本發明，下面具體結合實施例闡述本發 明。
[0018] 實施例1 漢坦病毒集成式核酸檢測試劑盒，包括漢坦病毒巢式PCR第一輪及巢式PCR第二輪反 應體系，其中PCR第一輪反應體系包括一對通用引物HTV - MFO、HTV - MRO ;PCR第二輪反 應體系包括漢城型引物SEO-MF、SEO-MR和漢灘型PCR引物HMF、HMR，引物序列如下：
所述PCT第一輪為RT-PCR反應體系，總體積為50 μL，包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ) 2.0 μL，補充 RNase Free H2O 使總體積達到 50 μι; 所述PCR第二輪漢城型反應體系總體積為50 μL，包括DNA Polymerase (IU/ μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SEO-MF (2〇μΜ) 2· 0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，補充 ddH20 30.0 μL，使總體積達到 50 ? ； 所述PCR第二輪漢灘型反應體系總體積為50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 μL，4XdNTP 5.0 μL，模板4.0 μL，引物HMF (2〇μΜ) 2.0 μL，弓丨 物 HMR (2〇μΜ)2