專利名稱：含有熱休克蛋白hsp70c的用于促進漢坦病毒融合蛋白g2s0.7提呈的重組腺病毒表達載體的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及分子生物學、免疫學及免疫應用等相關領域。本發明涉及腺病毒重組轉移載體的改建及其對腎綜合征出血熱(HFRS)致病原的ー種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體G2S0. 7-pCAG。
背景技術：
腎綜合征出血熱及其基因工程疫苗研究現狀腎綜合征出血熱(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由漢坦病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠類等傳播的ー種急性病毒性傳染病，臨床上以發熱、出血和急性腎功能損害為主要特征。中國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家，具有流行范圍廣、發病人數多、病死率高等特點，到目前為止臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物。為易感人群接種疫苗是預防傳染性疾病大規模擴散最有效的防控措施。因此，針對HFRS疫苗的研究一直是該領域的熱點。國內外近年來雖已研制出HFRS的滅活疫苗，但從部分人群試用的情況來看，該類疫苗還存在明顯不足，主要是其誘導機體產生中和抗體的能力較弱，也不能有效地刺激細胞免疫應答。目前在HFRS基因工程疫苗基礎研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相對較弱，刺激機體產生的抗體出現較晚，滴度亦不高。本發明人多年對HV中免疫原性最強的核蛋白(NucleocapsidProtein, NP)的結構及功能，NP與GP不同片段嵌合基因(G1S0. 7、G2S0. 7)的構建及其表達，以及不同融合基因(蛋白)刺激機體免疫應答的能力及其影響因素等進行了較為深入的研究。一系列體內、外實驗結果表明，上述嵌合基因在腺病毒表達系統中能有效地刺激機體的體液免疫(包括中和抗體)應答以及細胞免疫應答，且其效果均高于非嵌合組。
然而在研究中我們也發現了ー些問題，如盡管利用各種系統均能表達出完整的融合蛋白，但總的來說蛋白表達量還是偏低。此外，用融合蛋白免疫動物后雖然各表達系統均能刺激機體產生體液及細胞免疫應答，且腺病毒表達系統的效果要優于其他系統，但是整體的免疫水平還不十分理想。因此，進ー步選擇合適的表達載體、優化表達系統對目前HFRS基因工程疫苗的研究有著重要的意義。本申請人前期對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉移載體G2S0. 7-pShuttle進行改建，將其CMV啟動子替換為CAG啟動子/增強子，得到含CAG啟動子/增強子的漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7的重組腺病毒轉移載體，命名為G2S0. 7-pCAG，整合入腺病毒載體DNA中，得到重組腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG。通過比較表達融合蛋白G2S0. 7，結果顯示該重組腺病毒與未替換啟動子的原重組腺病毒rAd-G2S0. 7相比，能有效提高融合蛋白G2S0. 7的表達。在此基礎上，本發明將HSP70抗原遞呈分子基因C末端(HSP70 359_610aa)連接到該重組轉移載體上，通過雙酶切，進而將重組片段整合入腺病毒載體DNA中，得到能夠促進漢坦病韋融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病韋聞表達載體。
優化腺病毒表達載體，促進機體對抗原的提呈促進疫苗組份在體內的有效提呈是提高HFRS基因工程疫苗的效率的途徑之一。HSP70因其在抗原提呈和分子伴侶方面的突出優勢引起了研究者的重視。熱休克蛋白(heatshock protein, HSP)是ー組生物體內普遍存在、進化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白質家族，是生物在應激條件下產生的ー種非特異性、能增強機體對高低溫、創傷、細菌和病毒感染等適應能力的防御性產物。HSP的主要生理功能是促進與維持新生多肽鏈的正確折疊，并且調節細胞的生長、分裂、分化、死亡。由于HSP參與蛋白質的轉運、折疊和裝配，所以HSP又被稱為“分子伴侶”。根據分子量的大小和同源程度將HSP分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP等幾個家族。HSP70家族廣泛存在于各個亞細胞結構中。HSP70家族的結構分為3部分N端(44kDa)由4個α螺旋形成一個裂縫，比C端具有更高的保守性，它具有ATP酶活性，類似肌動蛋白ATP酶結構域；18kDa部分，由4個反向平行的β折疊和ー個α螺旋構成，是多肽的結合部位；C端(IOkDa)主要由α螺旋構成，是多肽和蛋白質·結合的部位，不同HSP70分子該部分的同源性較低。研究表明，HSP70家族蛋白基因與MHC分子基因類似，HSP70的蛋白結合基序與MHC-I類分子的構槽樣結構非常相似，是ー種重要的分子伴侶，參與蛋白在細胞內的轉運，可作為抗原提呈分子發揮作用。此外，HSP70本身也具有很強的免疫原性，可以作為一種佐劑，強烈地刺激機體免疫系統產生針對抗原的免疫反應，而不再需要其他的免疫佐劑。有研究認為HSP融合蛋白疫苗可能通過HSP的的分子伴侶作用將融合蛋白轉移進入APC細胞內，進入MHC-I類分子遞呈途徑，從而將抗原表位遞呈到APC表面，在HIV-lp24與HSP70的融合蛋白的研究中，HSP70能夠增強HIV_lp24的免疫原性，激活機體的細胞和體液免疫反應，同時截短的HSP70完全可以替代HSP70獨立行使其佐劑功能。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體G2S0. 7-pCAG，能有效提高融合蛋白G2S0. 7在實驗動物體內的提呈效率，進而提高機體的體液免疫應答水平和細胞免疫應答水平。將本申請人前期構建的含漢坦病毒76-118株的G2S0. 7嵌合基因及CAG啟動子/增強子的重組腺病毒轉移載體G2S0. 7-pCAG進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端連接到該載體上，并整合入腺病毒載體DNA，以獲得一種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體。本發明的技術方案是設計ー種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體G2S0. 7-pCAG，其制備方法是對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉移載體G2S0. 7-pCAG進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端HSP70 359_610aa連接到該載體上，命名為G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列為SEQ ID N0:1所示。本發明目的是通過以下方式實現的對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉移載體pCAG-G2S0. 7進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端(HSP70359_610aa)連接到該載體上，得到改建的重組腺病毒轉移載體，命名為G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列為SEQ ID NO: I所示。對重組轉移載體和腺病毒載體雙酶切，將G2S0. 7-pCAG-HSP70C整合入腺病毒載體DNA，得到重組腺病毒載體rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C。
本發明利用基因重組技術，將本申請人前期構建的含漢坦病毒76-118株的G2S0. 7的嵌合基因及CAG啟動子/增強子的重組腺病毒轉移載體PCAG-G2S0. 7進行改建，并將重組片段整合入腺病毒載體DNA中，以期獲得一種用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重組腺病毒高表達載體。將本發明rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C及前期未整合HSP70抗原遞呈分子基因C末端的重組腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG和未替換啟動子的重組腺病毒rAd-G2S0. 7分別免疫實驗小鼠后進行免疫學特性的研究，發現本發明能有效提高融合蛋白G2S0. 7在實驗動物體內的提呈效率，進而提高機體的體液免疫應答水平和細胞免疫應答水平。


下面結合實施例附圖對本發明做進ー步說明圖 I. HSP70C 基因的 PCR 擴增結果；其中L HSP70C ；M =DNAwide range maker ；
圖2. G2S0. 7-pCAG-HSP70C KpnI 單酶切鑒定結果；其中L2 :G2S0. 7-pCAG-HSP70C ；M DL2000maker ；圖3.重組腺病毒 DNA 的 PCR 鑒定；其中L2 G2S0. 7-pCAG_HSP70C ；M 200bpmaker。圖4.重組腺病毒的 PCR 鑒定；其中L G2S0. 7-pCAG_HSP70C ；M 200bp maker。圖5· HEK293細胞的CPE現象；其中A :正常對照；B :轉染6天后。圖6. G2S0. 7-pCAG-HSP70C表達產物的免疫熒光檢測結果；其中A :檢測NP的表達；B :檢測HSP70C的表達；C HEK 293陰性對照；圖7.各組免疫小鼠細胞因子IFN-Y的檢測結果；圖8.各組免疫小鼠細胞因子IL-2的檢測結果。圖9.含G2S0. 7嵌合基因的重組腺病毒免疫小鼠CTL檢測結果。
具體實施例方式本發明所用的腺病毒表達系統購自CL0NTECH公司的Adeno-X 系統(貨號K1650-1)，其轉移載體為pShuttle。本發明中所采用的重組腺病毒轉移載體G2S0. 7-pCAG由本申請人前期構建(見原專利申請號 200910254563. 2)。本發明中所采用的重組腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG、rAd_G2S0. 7由本申請人前期包
裝、純化。本發明中所采用的雙價HFRS滅活疫苗購自浙江天元公司。本發明中所插入HSP70C 基因序列是以 HSP70C up primer、HSP70C down primer為引物，以結核分枝桿菌基因組為模板，進行PCR擴增，如附圖I所示。PCR產物與T-easy載體14°C連接過夜，連接產物電轉化E. coli JM109后涂布含Amp抗性的瓊脂平板，37°C培養12hr,挑選單菌落增菌,提質粒后以HSP70C up primer、HSP70C down primer為引物進行PCR鑒定，獲得陽性克隆，命名為Teasy-HSP70C，送金斯瑞生物科技公司進行測序。本發明中重組腺病毒載體構建方法及重組腺病毒免疫學特性的研究內容具體如下
I.重組轉移載體G2S0. 7-pCAG-HSP70C的構建采用Not I單酶切G2S0. 7-pCAG和T easy-HSP70C質粒，分別膠回收目的片段和載體。將載體與片段14°C連接過夜，連接產物電轉化E. coli JM109后涂布含Kana+抗性的2XYT瓊脂平板，37°C培養12hr，挑取單菌落增菌，提質粒后用Kpn I單酶切鑒定，獲得陽性克隆，命名為G2S0. 7-pCAG_HSP70C(HSP70C基因位于G2S0. 7嵌合基因的下游)。附圖2為G2S0. 7-pCAG_HSP70C陽性克隆Kpn I單酶切鑒定結果。2.重組腺病毒DNArAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C的構建、鑒定、包裝及單斑純化將上述構建成功的重組轉移載體和重組腺病毒載體分別用PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切，膠回收目的片段和載體，T4連接酶14°C連接過 夜，連接產物轉化(JM109感受態)后涂布含AMP+的2XYT固體培養基，37°C孵箱培養12 14hr，挑選單菌落搖菌提質粒后酶切鑒定，獲得陽性克隆。附圖3為rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C重組腺病毒DNA的PCR鑒定結果。將重組腺病毒DNA用Pac I酶單切以線性化質粒，轉染HEK293細胞，待出現明顯CPE(CytopathicEffect，細胞病變)后回收細胞，如附圖5所示。離心后將沉淀重懸于高壓滅菌的PBS。反復凍融該沉淀3次后離心收集上清，即獲得重組腺病毒。附圖4為rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C的PCR鑒定結果。采用空斑法純化重組腺病毒，_80°C保存。3. rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C融合蛋白G2S0. 7表達的檢測測定重組腺病毒滴度(具體方法參見 CLONTECH Adeno-Xw Rapid Titer Kit，Cat. No. 631028)。以 100pfu/cell的MOI (multiplicity of infection,感染復數)感染293細胞，同時感染本申請人前期包裝的rAd-G2S0. 7重組腺病毒作為對照，48hr后免疫熒光檢測目的蛋白的表達。3. INP表達的檢測感染前24hr以I X IO5細胞/孔的密度將HEK293細胞鋪于24孔板，第二天以100pfu/cell的MOI感染HEK293細胞，4hr后更換新鮮的10% S-DMEM培養液，每孔500 μし將細胞置于CO2孵箱中培養48hr，使細胞密度達到75%，之后用冷甲醇_20°C固定細胞20min，PBS輕柔沖洗3次。加入I : 1000稀釋的mAb 1A8 (由本申請人制備并保存，可識別漢坦病毒特異抗原位點，具有較高的結合活性)，37°C孵育2hr，PBS輕柔洗3次，加入用O. 2%。伊文氏蘭液I : 100稀釋的FITC標記的羊抗鼠ニ抗，于37°C孵育lhr，PBS輕柔洗3次。避光保存，在熒光倒置顯微鏡下觀察結果。3. 2HSP70C表達的檢測于24孔板中培養細胞及感染病毒步驟如前，以I : 250稀釋商品化特異性抗HSP70C抗體，37°C孵育lhr，PBS輕柔沖洗3次后加入用0. 2%。伊文氏蘭液I : 100稀釋的FITC標記的羊抗鼠ニ抗，于37°C孵育lh，PBS輕柔洗3次，避光保存，在熒光倒置顯微鏡下觀察結果。附圖6分別為rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C中融合蛋白G2S0. 7及HSP70C的免疫熒光檢測結果。其中A為S0. 7免疫熒光檢測結果，B為HSP70C免疫熒光檢測結果，C為HEK293細胞陰性對照。4.重組腺病毒免疫C57BL/6小鼠將各組重組腺病毒經過増殖、純化和滴度測定后，以108pfu/0. 5ml/只經腹腔注射入小鼠體內(4周齡C57BL/6小鼠雌鼠，每組5只，購自本校動物實驗中心)，間隔2周免疫一次，共三次；正常小鼠組(4周齡C57BL/6小鼠雌鼠，姆組5只,購自本校動物實驗中心)腹腔注射生理鹽水0. 5ml/只,Adenovirus組(4周齡C57BL/6小鼠雌鼠，每組5只，購自本校動物實驗中心；Adenovirus購自Clotech公司，含IacZ基因，通過檢測β_半乳糖苷酶的表達，可作為腺病毒陰性對照)腹腔注射腺病毒108pfu/ml/只，滅活疫苗組腹腔注射疫苗10 μ I/只，間隔2周注射一次，共三次。5.重組腺病毒免疫小鼠血清特異性抗體的檢測結果在第三次免疫后10天對各組免疫小鼠摘眼球取血并分離血清。包被HTNV NP lOyg/mlJt過夜；將各組免疫小鼠血清做I : 10 I : 640倍比稀釋，疫苗對照組稀釋至I : 640，37°C孵育Ihr ;洗滌后各孔加入I : 20000稀釋的HRP-抗鼠ニ抗，37°C孵育Ihr ;洗滌后加入OPD底物液顯色，室溫下避光放置15min后加入終止液，測定各孔的A49tl值。附表I為各組免疫小鼠血清特異性抗體檢測結果。

6.重組腺病毒免疫小鼠血清中和抗體的檢測結果在第三次免疫后10天對各組免疫小鼠摘眼球取血并分離血清。感染前一天接種Vero-E6細胞于96孔板，使其長成單層。O. 22μπι濾器提前過濾各組免疫小鼠的血清，然后用高壓過的IXPBS做I : 5 I 160倍比稀釋，陽性對照mAb 3G1 (可識別NP/G2上特異抗原位點，具有較高中和活性和血凝抑制活性)從I : 1000開始做倍比稀釋，陰性對照Sp2/0腹水做I : 1000稀釋。將iootcid50htnv分別與各實驗組血清及對照樣品充分混勻，37°c 5% co2孵育lhr。將96孔板各孔細胞上清吸盡，分別加入各組病毒與血清(或腹水)混和液100μ I/孔，做4個復孔，同時設立病毒對照組和正常細胞對照組。37°c 5% CO2孵育90min后，吸盡各孔上清，加入200μ I/孔含2%小牛血清的完全RPM-1640培養液，37°C 5% CO2孵育9天，每隔3天換ー次培養液。將96孔板放入_80°C反復凍融3次，用ELISA夾心法檢測凍融液中的病毒抗原，具體步驟如下I 1000稀釋mAb 1A8及腹水Sp2/0，4°C包被過夜I加入100 μ I/孔細胞凍融上清，37°C孵育IhI加入I : 2000稀釋的HRP-1A8抗體，37°C孵育IhI加入100 μ I/孔OPD底物液顯色，靜置15minI加入50 μ I/孔2Μ H2SO4終止液I測定各孔A49tl值結果判定Ρ值為各免疫組Α·值，N為陰性對照組A49tl值，以Ρ/Ν值彡2. I者為陽性，能抑制50%細胞感染的血清最大稀釋度為中和抗體效價。附表2為各組免疫小鼠血清中和抗體效價檢測結果。7.重組腺病毒免疫小鼠分泌細胞因子的ELISPOT檢測結果7. I免疫小鼠脾淋巴細胞制備在第三次免疫后10天摘眼球處死各組小鼠，無菌分離脾臟獲取脾細胞懸液。加入Gey’ s溶液裂解其中的紅細胞，離心收集脾淋巴細胞，加入不完全RPM-1640洗滌2次，離心后重懸于含2%小牛血清完全RPM-1640培養液中，計數備用。7. 2ELISP0T檢測免疫小鼠細胞因子IFN- Y、IL-2
處死小鼠前一天，包被IL-2檢測板(IFN- Y為預包被檢測板)，具體程序如下 無菌條件下每孔加入50 μ I/孔70%こ醇，靜置2min后棄盡，加入200 μ I/孔無菌去離子水洗滌5次，100 μ I/孔加入特異性稀釋抗體，4°C包被過夜。用無菌I XPBS洗滌5次后，200 μ I/孔加入含10% -小牛血清的完全RPM-1640培養液室溫封閉30min，用無菌IXPBS洗滌5次后，包被完成備用。上述各組實驗小鼠脾細胞稀釋成I X IO7細胞/ml濃度，100 μ I/孔加入個細胞因子檢測板，并加入10mg/ml HTNVNP作為刺激物，每個樣品作3個復孔。陽性對照孔中加入PHA (phytohemagglutinin,植物血凝素，終濃度為4 μ g/ml),陰性對照孔不加刺激物，背景對照孔只加培養基。37°C 5% CO2孵育18hr，無菌I X PBS洗滌5次后加入生物素化抗鼠細胞因子的mAb，室溫孵育2hr，無菌I XPBS洗滌5次后加入I : 1000稀釋的HR標記鏈霉親和素，室溫孵育lhr，高壓I XPBS洗滌5次后加入TMB底物顯色液，避光靜置，待斑點出現后，自來水沖洗，避光明干，用ELISPOT讀數儀測定斑點數。附圖7為重組腺病毒細胞因子IFN- Y的檢測結果ΓΡ < O. 01)。附圖8為重組腺病毒 細胞因子IL-2的檢測結果(*P < O. 05，**P < O. 01)。8.重組腺病毒免疫小鼠CTL細胞殺傷實驗檢測結果8. I效應細胞的制備在第3次免疫后10天摘眼球處死各組小鼠，無菌分離脾臟獲取脾細胞懸液(同上)，將其置于含5%小牛血清完全RIPM-1640培養液中，加入終濃度為10 μ g/ml的HTNVGP，25U/ml的IL_2，37°C 5% CO2，作為CTL細胞殺傷實驗效應細胞。8. 2靶細胞的制備提前兩天用重組腺病毒rAd_G2S0. 7感染B16細胞作為CTL細胞殺傷實驗靶細胞。8. 3CTL細胞殺傷實驗計數效應細胞和靶細胞，按照20 1,50 UlOO I的效靶比將50 μ I (2X IO6/孔、I X IO6/孔、4X IO5/孔)效應細胞和50 μ I (2X IO4/孔)革巴細胞加入96孔板中，設置3個復孔，并以正常鼠脾細胞作為陰性對照。布板設各項對照孔(附表3顯示各對照孔配制方案)，之后按如下步驟檢測37°C 5% CO2孵育細胞4h后，250 Xg室溫離心5min，離心前40min靶細胞最大釋放孔加入10 μ I/孔裂解液，離心后每孔吸出50 μ I細胞上清至新96孔板，加入50 μ I/孔底物液，室溫避光靜置30min，加入50 μ I/孔終止液，測定A49tl值，計算殺傷活性。附圖9為重組腺病毒免疫小鼠CTL檢測結果，在效靶比為100 I時，rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C組小鼠脾細胞的殺傷活性要高于其他試驗組及對照組(P< O. 05) ο在效靶比為50 I時，rAd-G2S0. 7-pCAG-HSP70C組小鼠脾細胞的殺傷活性要高于其他試驗組及對照組(P < O. 01)。表I.各組免疫小鼠血清特異性抗體檢測結果
權利要求
1.含有熱休克蛋白HSP70C的用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7提呈的重組腺病毒表達載體，其制備方法是對含嵌合基因G2S0. 7的重組腺病毒轉移載體G2S0. 7-pCAG進行改建，將HSP70抗原遞呈分子基因C末端HSP70359-610aa連接到該載體上，命名為G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列為 SEQ ID NO 1 所示。
全文摘要
本發明涉及含有熱休克蛋白HSP70C的用于促進漢坦病毒融合蛋白G2S0.7提呈的重組腺病毒表達載體,主要是對含CAG啟動子/增強子及漢坦病毒76-118株的G2S0.7的嵌合基因的G2S0.7-pCAG轉移載體進行改建，用于促進機體對高表達的漢坦病毒融合蛋白G2S0.7有效提呈。能有效提高實驗動物機體的體液免疫應答水平和細胞免疫應答水平。
文檔編號C12N15/861GK102676582SQ20121007088
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者于瀾, 吳興安, 張亮, 張芳琳, 徐志凱, 李凱, 李璞媛, 白文濤, 程林峰 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學