用于現場檢測多種血清型口蹄疫病毒的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種應用重組酶聚合酶擴增技術 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并結合側流層析技術（Lateral Flow Assay)現場檢測多種血清型口蹄疫病毒的引物、探針及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的發生在豬、牛、羊等偶蹄類動物上的急性、 熱性、高度接觸性傳染病，被世界動物衛生組織列為"A類烈性傳染病"，一旦暴發，必須撲殺 感染及接觸感染的動物，造成巨大的直接經濟損失，而且嚴重危害畜牧業的健康發展以及 相關產品的對外貿易，對國家的政治、經濟具有深遠的影響。口蹄疫病毒有7個血清型和65 個以上的血清亞型，血清型之間無交叉免疫現象，因而難以控制。我國為口蹄疫流行國家， 主要流行〇型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我國大面積爆發了 Asia 1型口蹄疫，2009 年和2013年爆發了 A型口蹄疫，近年來，均有0型口蹄疫的散發和流行，特別是隨著我國養 殖業集約化、規模化的迅猛發展，口蹄疫的傳播風險也來越大。
[0003] 目前，病毒的分離與鑒定、PCR及其相關的技術是口蹄疫病毒檢測的主要方法，口 蹄疫病毒的分離培養要求在生物安全三級以上實驗室進行，并需要特殊的儀器設備和專業 的技術人員，在分尚過程中存在病毒擴散的危險，且耗時長。而PCR及其相關的技術可以檢 測口蹄疫病毒的核酸，但需要復雜的儀器設備，難以滿足非實驗室等現場環境下的檢測要 求。
[0004] 重組酶等溫擴增（recombinase ploymerase amplification, RPA)技術是不同于 PCR的核酸檢測技術，RPA是在重組酶介導下模擬體內DNA的復制過程。重組酶與引物結 合形成蛋白-DNA復合物后，尋找到雙鏈DNA同源序列，在單鏈DNA結合蛋白的作用下，模板 DNA解鏈，引物與模板DNA配對，并在鏈置換DNA聚合酶的作用下復制、擴增，單個DNA模板 分子得到大約1〇12擴增產物。它與PCR不同，不需要退火反應過程，可在37°C~42°C等溫 條件下，反應20余分鐘即可得到擴增產物（Forget et al.，2012)。RPA可以與側向流動免 疫層析技術相結合，在RPA擴增體系中，需要生物素標記的反向引物和熒光基團標記的探 針，在距熒光基團30個堿基處有一個脫堿基位點（dSpacer)，該位點可被nfo核酶識別、切 害J，產生新的羥基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成帶有生物素和熒光基團雙標記的 RPA產物，通過層析膜擴散，被生物素配體和熒光基團標記抗體捕獲，形成具有顏色的檢測 線。該方法檢測時間短，5分鐘左右就能目測結果，肉眼判讀。
[0005] 但目前對于RPA技術的研宄尚處于起步階段，國內外還沒有將RPA技術應用于 FMDV檢測的報道。本發明系首次采用RPA技術建立快速檢測FMDV的方法，并通過特異性和 靈敏度評價，可用于臨床現場檢測，為FMDV的現場檢測提供一種靈敏、可靠的新方法。

【發明內容】

[0006] 針對RPA技術應用于FMDV檢測領域的空白，本發明提供了一種準確、快速、簡便的 現場檢測口蹄疫病毒的RPA檢測方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0008] 一種用于通過RPA-側流層析技術檢測多種血清型口蹄疫病毒的通用引物和探針 組合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列 如 SEQ ID No. 3 所示。
[0009] 正向引物 2BF:5' -GTCTCGACGAGGCCAAGCCCTGGTACAAACT-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0010] 反向引物 2BR :5' -【Biotin】CGAGGCGACCTTGACCAACCCGGCCAACAGG-3' ；（SEQ ID No. 2)
[0011] 探針序列 2BP :5'-【FAM】GTCTTGAGATTCTGGACAGCACTTTTGTCGTG【dSpacer】 AAAAGATCTCCGACTCG【C3-spacer】3, ；（SEQ ID Νο·3)。
[0012] 需要說明的是：與常規PCR反應不同，RPA反應所需引物的長度通常為30-35bp， 探針序列的長度為46-52bp，引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構，其長度 的增加也使引物設計及選擇難度的增加，因此，引物的設計和選擇對RPA的結果至關重要。 RPA技術正處于起步研宄階段，尚無專門的引物、探針設計軟件，也沒有大量的數據為其引 物設計原則提供依據。因此，本發明的引物和探針組合是需要從靶標序列兩端設計多對引 物進行優化、篩選才能得到。
[0013] 本發明還提供了一種檢測口蹄疫病毒的試劑盒，該試劑盒中包含有由用于通過 RPA技術檢測口蹄疫病毒的引物和探針組成的引物探針液。
[0014] 所述引物探針液的組成為：正向引物2BF和反向引物2BR終濃度均為0. 4μπιο1/ L，檢測探針2ΒΡ的終濃度為0. 12 μmol/L，擴增核苷酸序列片段為SEQ ID NO. 4所示。
[0015] 進一步的，該檢測口蹄疫病毒的試劑盒中還包括有：標準陽性質粒、緩沖液、酶擴 增八聯管、無菌雙蒸水、反應驅動液、產物稀釋液和側流層析試紙條；
[0016] 所述陽性標準質粒為pEASY-T3_2B，用于檢測的陽性對照，以檢驗反應體系和反應 條件能否正常反應。
[0017] 用于構建陽性標準質粒的引物序列如下：
[0018] FMDV-F :5, -CACTCCCTTACACCGCTCCC-3,（SEQ ID No:5);
[0019] FMDV-R :5, -ACTCTTTCCCTGGCCGGATT-3'（SEQ ID No:6)。
[0020] 所述陽性標準質粒pEASY-T3-2B是以FMDV基因組cDNA為模板，由SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6PCR擴增的核苷酸序列片段（SEQ ID NO. 7)與PEASY-T3載體相連接后得到的 重組質粒，連接方法為所屬領域常規技術。
[0021] PCR 擴增的反應體系為 50 μ L :10XPCR Buffer II (Mg2+Plus) 5 μ L、2. 5mM dNTP M ixture 8 μ L、rTaq 0· 5 μ L (5U/ μ L)、cDNA 模板 2 μ L，10 μ mol/L 的引物 FMDV-F 和 FMDV-R 各2 μ L，滅菌超純水加至50 μ L。
[0022] 反應程序為 94°C預變性 3min，然后 94°C 20s，55°C 20s，72°C 20s，35 個循環；72°C 延伸5min，4°C保存。
[0023] 所述無菌雙蒸水可作為陰性對照或補足反應體系用，其制備方法為雙蒸水經高壓 滅菌后，分裝到滅菌的小管中。
[0024] 所述的緩沖液、酶擴增八聯管、反應驅動液、產物稀釋液可于市場購買得到。
[0025] 具體的，一種檢測口蹄疫病毒的試劑盒，每50yL擴增體系中含有緩沖液 29. 5 μ L、引物探針液4. 6 μ L、無菌雙蒸水12. 4 μ L、待測樣本cDNA或陽性對照分別為1 μ L 或空白對照1 μ L、反應驅動液2. 5 μ L。（上述陽性對照是指陽性標準質粒，空白對照指無菌 雙蒸水）
[0026] 本發明還提供一種應用RPA技術并結合側流層析技術檢測FMDV的方法，步驟如 下：
[0027] (1)提取待測樣本的總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，獲得cDNA ;
[0028] (2)設計用于多種血清型口蹄疫病毒檢測的通用引物和探針，以cDNA為模板，進 行RPA擴增，擴增條件為：38°C水浴4min后，混勻，再38°C水浴20min ;
[0029] (3)應用側流層析試紙條進行擴增產物檢測，當試紙條出現兩條棕色條帶，一條位 于質控區內，一條位于檢測區，則結果為陽性，表明樣本中含有口蹄疫病毒核酸；當試紙條 只有質控區出現一條棕色條帶，檢測區沒有條帶，則結果是陰性，表明樣本中不含有口蹄疫 病毒核酸。
[0030] 本發明的有益效果：
[0031] (1)采用本發明的引物和探針組合，通過RPA技術對FMDV進行檢測的方法，具有較 高的靈敏度、特異性和重復性。
[0032] 本發明選用的口蹄疫病毒2B基因引物是經大量實驗篩選獲得的，特異性好，與 牛、豬的其他病毒包括牛腸道病毒、牛流熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、牛傳 染性鼻氣管炎病毒、豬皰瘆病毒、豬瘟病毒等病毒無交叉反應。
[0033] RPA能夠將痕量的核酸模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約 IO12擴增產物；本發明所建立檢測方法可檢測5TCID 5(|的FMDV病毒。
[0034] (2)本發明的RPA技術并結合側流層析技術檢測FMDV的方法，既具有分子生物學 檢測的高靈敏、高通量，又具有免疫學檢測的特異性好、操作簡便的優點，還不需復雜儀器， 尤適于基層實驗室和現場的口蹄疫病毒快速篩查檢測。
[0035] (3)檢測速度快：與常規PCR相比，不必經過變性、退火、延伸三個步驟，RPA反應的 最適溫度在37°C -42°C之間，無需變性，在常溫下20min左右即可完成反應。
[0036] (4)不需要復雜的儀器設備，適用于現場檢測。本發明所建立檢測方法可以在常溫 等溫條件下擴增、試紙條可視化檢測，不要PCR儀、熒光定量PCR儀、電泳儀、電泳槽等復雜 的儀器設備，而且RPA不需復雜的樣品處理，可以真正實現便攜式的現場快速核酸檢測。
【附圖說明】
[0037] 圖1為RPA引物、探針組的篩選結果，其中1為引物2BF、2BR和探針2BP組，2為 引物2CF、2CR和探針2CP1組，3為2CF、2CR和探針2CP2組，4為3AF、3AR和探針3AP組，5 為3CF、3CR和探針3CP組，6為3DF