專利名稱：一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的制作方法
技術領域：
本發明屬于病毒學、分子生物學和生物制品領域，與病毒疫苗、病毒性疾病診斷及基因治療有關。
目前，正在使用的漢坦病毒滅活疫苗主要有3種地鼠腎細胞滅活疫苗、沙鼠腎細胞滅活疫苗、純化的鼠腦滅活疫苗。這些傳統疫苗生產使用的都是原代細胞培養或動物器官接種的方法培養活病毒，再使用滅活劑滅活病毒后制成的。由于原代細胞或動物器官本身的不均一性，因此具有產量和質量不穩定的缺點。由于必須使用滅活劑滅活，會對病毒抗原性有影響。滅活疫苗的生產中必須使用活病毒，存在著工作人員被感染和環境污染的問題。疫苗生產中使用的滅活劑福爾馬林或β-丙內酯均是致癌劑。開發新型疫苗的目的則是避免這些問題。
痘苗病毒作為載體表達漢坦病毒結構蛋白已有不少成功例子。美國陸軍傳染病研究所以痘苗病毒為載體，表達了漢坦病毒76-118株的M和S片段，構建了單獨表達M和S及同時表達M加S的重組痘苗病毒，并用共表達M和S的重組痘苗病毒制備了疫苗。但由于痘苗病毒載體本身具有的缺點，如嚴重副反應等，使之難以廣泛應用。以桿狀病毒為載體表達全長M片段、全長S片段以及G1和G2亞單位也已獲得成功，但目前從這種表達系統中純化病毒蛋白到人用疫苗水平尚有大量工作要做。在本發明出現之前，尚未見有成功獲得穩定表達漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物細胞系的報道。
開發一種方便、可靠的血清診斷方法來檢測受感染個體血清內的抗漢坦病毒抗體不僅有利于病毒病的診斷，并且還可通過檢測型特異性的抗體用于病毒型別的鑒定，這對于臨床和流行病學都具有重要的意義。已經證明，漢坦病毒糖蛋白上的一些抗原表位與構象高度相關，在大腸桿菌中表達的糖蛋白由于不能進行翻譯后加工，喪失了一些天然病毒的抗原性和免疫原性。本發明提供的這種在真核細胞中表達的核蛋白和糖蛋白，可以作為更具代表性的抗原或者更有效的免疫原。
基于當前漢坦病毒感染的研究現狀和CHO(中國倉鼠卵巢細胞)細胞、Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)已經用于疫苗生產的現實，建立通過這兩種哺乳動物細胞系表達重組漢坦病毒結構蛋白和重組漢坦病毒樣顆粒的方法將是非常有用的。該系統產生的重組漢坦病毒結構蛋白和漢坦病毒樣顆粒具有天然蛋白的免疫學特性，這種具有天然構象的重組蛋白、重病毒樣顆粒以及它們的不同組合，對于漢坦病毒病的預防、診斷和治療是非常有用的。
發明詳述本發明陳述的一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系及其用途，主要包括由引起腎綜合癥出血熱(HFRS)的四種漢坦病毒型M和S基因整合入哺乳類細胞后所產生的不同漢坦病毒型別和基因組成的病毒樣顆粒及其生產細胞系，該漢坦病毒樣顆粒具有與天然漢坦病毒類似的免疫原性和抗原性。其主要用途將作為一類新型漢坦病毒基因工程疫苗，包括單價和多價疫苗。所陳述的細胞系將用于新型漢坦病毒基因工程疫苗的生產，所生產的疫苗將用于HFRS的預防，同時可用于診斷試劑和基因治療中的新型載體的研發。
本發明陳述的一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系及其用途，主要內容包括以下幾點1、一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于每種工程細胞系分別整合有漢坦病毒姬鼠型(HTN)、家鼠型(SEO)、棕背鲆型(PUU)、杜布洛瓦型(DOB)四個血清型漢坦型病毒的M片斷和S片斷基因或上述各型漢坦病毒單一的M片斷基因。2、一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于工程細胞系分為兩類，一類為可穩定表達各型漢坦型病毒M片斷基因編碼的漢坦病毒糖蛋白G1和G2和S片斷基因編碼的漢坦病毒核蛋白；另一類為單一穩定表達各型漢坦型病毒M片斷基因編碼的漢坦病毒糖蛋白G1和G2。3、一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于通過漢坦病毒糖蛋白和核蛋白在哺乳動物細胞內的共同持續穩定表達或漢坦病毒糖蛋白在哺乳動物細胞內的單一持續穩定表達，可在細胞內形成漢坦病毒樣顆粒并分泌到細胞外，從而在細胞培養上清中可持續收獲漢坦病毒樣顆粒。4、一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于該組細胞系可持續生產權利要求(1)和(2)中所述四型漢坦病毒中的任何一型整合基因所決定的漢坦病毒樣顆粒，其中包括漢坦病毒糖蛋白和核蛋白共同表達形成的病毒樣顆粒和漢坦病毒糖蛋白單一表達形成的病毒樣顆粒。5、權利要求(1-4)所述的一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征為該細胞系為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)和非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)，也可以為用于生產的任何一種可能的哺乳類動物細胞。6、根據權利要求(4)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系所生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，可根據今后實際應用的需要在體外單獨或任意配伍組合使用。7、一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于該組細胞系生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，具有和天然漢坦病毒的糖蛋白和核蛋白類似的免疫原性，無論是單一型別重組漢坦病毒樣顆粒或不同型別漢坦病毒樣顆粒配伍使用，均可在動物或人體內誘導產生特異性中和抗體和其他相應的免疫反應。8、一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于該組細胞系生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，具有和天然漢坦病毒的糖蛋白和核蛋白類似的抗原特性，能與天然漢坦病毒結構蛋白誘導產生的多克隆和單克隆抗體發生特異性結合。9、根據權利要求(1-8)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的用途，其特征在于該組細胞系生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，可以用于制備漢坦病毒疫苗，可以用單一型別漢坦病毒樣顆粒或不同型別漢坦病毒樣顆粒的不同組合制備漢坦病毒疫苗，這些疫苗在人群中使用后，能夠預防不同型別的漢坦病毒感染。9、根據權利要求(1-8)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的用途，其特征在于一組以哺乳動物細胞系表達的漢坦病毒重組核蛋白、重組糖蛋白、病毒樣顆粒或它們的組合作為抗原組分構成漢坦病毒診斷試劑盒和漢坦病毒分型診斷試劑盒。10、根據權利要求(1-8)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的用途，其特征在于通過各種分子生物學方法，在漢坦病毒樣顆粒內部包裝具有治療作用的基因，這些基因可以是RNA或DNA，通過漢坦病毒樣顆粒將這些基因轉移到體內，作為基因治療的轉移載體。至今國內外任何一種形式的漢坦病毒基因工程疫苗尚未成功。本發明陳述的一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系及其用途，系國際上首次發明，對病毒基因工程疫苗的發展和病毒性疾病的預防均具有很重要的意義。病毒樣顆粒疫苗的制備技術不僅可用于漢坦病毒樣顆粒疫苗的制備，也可用于其他病毒樣顆粒疫苗的制備。
以下的優先實施例對本發明作詳細說明，擔不意味著限制本發明的內容。在這些實施例中，為說明本發明，用于擴增各型漢坦病毒M片斷和S片斷基因的病毒株為本實驗室保存，表達載體由梁米芳教授構建，專利申請號01102214.0。所用CHO細胞來源于本所遺傳室。實施例1-4為一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系制備方法；實施例5-12為一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系及其產物應用性特征。
倍的形態。3、 圖3為純化后的漢坦病毒樣顆粒經SDS-PAGE分離后，用考馬氏亮藍染色的結果。第1泳道樣品為漢坦病毒糖蛋白和核蛋白共同形成的病毒樣顆粒，電泳后顯示糖蛋白G1、G2和核蛋白條帶。第2泳道樣品為漢坦病毒糖蛋白單獨形成的病毒樣顆粒，電泳后顯示糖蛋白G1和G2條帶。第3泳道為蛋白分子量標記。4、 圖4為純化后漢坦病毒樣顆粒的蛋白印跡試驗結果，第1泳道樣品為漢坦病毒糖蛋白和核蛋白共同形成的病毒樣顆粒，可以和抗漢坦病毒核蛋白的單克隆抗體反應，顯示陽性條帶。第2泳道樣品為漢坦病毒糖蛋白單獨形成的病毒樣顆粒，可以和抗漢坦病毒核蛋白的單克隆抗體反應后，不出現陽性條帶。5、 圖5為漢坦病毒糖蛋白單獨形成的病毒樣顆粒和不同抗體的反應，該顆粒能夠和多克隆血清和抗漢坦病毒糖蛋白單克隆抗體反應，不能和抗漢坦病毒核蛋白單克隆抗體反應。6、 圖6為漢坦病毒糖蛋白和核蛋白共同形成的病毒樣顆粒和不同抗體的反應，該顆粒能夠和抗漢坦病毒多克隆血清、抗漢坦病毒糖蛋白單克隆抗體和抗漢坦病毒核蛋白單克隆抗體反應。
權利要求
1.一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于每種工程細胞系分別整合有漢坦病毒姬鼠型(HTN)、家鼠型(SEO)、棕背鲆型(PUU)、杜布洛瓦型(DOB)四個血清型漢坦型病毒的M片斷和S片斷基因或上述各型漢坦病毒單一的M片斷基因。
2.一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于工程細胞系分為兩類，一類為可共同穩定表達各型漢坦型病毒M片斷基因編碼的漢坦病毒糖蛋白G1和G2和S片斷基因編碼的漢坦病毒核蛋白；另一類為單一穩定表達各型漢坦型病毒M片斷基因編碼的漢坦病毒糖蛋白G1和G2。
3.一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于通過漢坦病毒糖蛋白和核蛋白在哺乳動物細胞內的共同持續穩定表達或漢坦病毒糖蛋白在哺乳動物細胞內的單一持續穩定表達，可在細胞內形成病毒樣顆粒并分泌到細胞外，從而在細胞培養上清中可持續收獲漢坦病毒樣顆粒。
4.一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于該組細胞系可持續生產權利要求(1)和(2)中所述四型漢坦病毒中的任何一型整合基因所決定的漢坦病毒樣顆粒，其中包括漢坦病毒糖蛋白和核蛋白共同表達形成的病毒樣顆粒和漢坦病毒糖蛋白單一表達形成的病毒樣顆粒。
5.權利要求(1-4)所述的一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征為該細胞系為中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)和非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)，也可以為用于生產的任何一種可能的哺乳類細胞。
6.根據權利要求(4)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系所生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，可根據今后實際應用的需要在體外單獨或任意配伍組合使用。
7.一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于該組細胞系生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，具有和天然漢坦病毒的糖蛋白和核蛋白類似的免疫原性，無論是單一型別重組漢坦病毒樣顆粒或不同型別漢坦病毒樣顆粒配伍使用，均可在動物或人體內誘導產生特異性中和抗體和其他相應的免疫反應。
8.一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，其特征在于該組細胞系生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，具有和天然漢坦病毒的糖蛋白和核蛋白類似的抗原特性，能與天然漢坦病毒結構蛋白誘導產生的多克隆和單克隆抗體發生特異性結合。
9.根據權利要求(1-8)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的用途，其特征在于該組細胞系生產的不同漢坦病毒型別和不同基因組成的漢坦病毒樣顆粒，可以用于制備漢坦病毒疫苗，可以用單一型別漢坦病毒樣顆粒或不同型別漢坦病毒樣顆粒的不同組合制備漢坦病毒疫苗，這些疫苗在人群中使用后，能夠預防不同型別的漢坦病毒感染。
9.根據權利要求(1-8)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的用途，其特征在于一組以哺乳動物細胞系表達的漢坦病毒重組核蛋白、重組糖蛋白、病毒樣顆粒或它們的組合作為抗原組分構成漢坦病毒診斷試劑盒和漢坦病毒分型診斷試劑盒。
10.根據權利要求(1-8)，一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系的用途，其特征在于通過各種分子生物學方法，在漢坦病毒樣顆粒內部包裝具有治療作用的基因，這些基因可以是RNA或DNA，通過漢坦病毒樣顆粒將這些基因轉移到體內，作為基因治療的轉移載體。
全文摘要
本發明為一組生產漢坦病毒樣顆粒的哺乳動物工程細胞系，工程細胞系分別整合有漢坦病毒姬鼠型(HTN)、家鼠型(SEO)、棕背型(PUU)、杜布洛瓦型(DOB)各型病毒的M和S基因或單一M基因，穩定表達上述漢坦病毒M基因編碼的病毒糖蛋白G1和G2和S基因編碼的病毒核蛋白，并形成由糖蛋白和核蛋白共同或由糖蛋白單獨組成的漢坦病毒樣顆粒及其不同型別顆粒的組合。本發明的用途在于漢坦病毒樣顆粒可作為一種新型基因工程疫苗預防HFRS；可作為診斷制劑用于臨床診斷；可作為基因治療中基因轉移的載體。
文檔編號C12N7/01GK1442479SQ0210438
公開日2003年9月17日 申請日期2002年3月5日 優先權日2002年3月5日
發明者李德新, 梁米芳, 李川 申請人:中國預防醫學科學院病毒學研究所