用于檢測靶核酸的用途和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于檢測靶核酸的用途和試劑盒。具體地，本發明涉及高通量且靈敏 地檢測皰原蟲（Genus Plasmodium)的用途和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 瘧疾是由瘧原蟲引起的蟲媒傳染病，臨床以周期性寒戰、發熱、頭痛、出汗、貧血、 脾腫大為特征，廣泛流行于熱帶、亞熱帶甚至溫帶邊緣。瘧原蟲的傳播依賴中間宿主按蚊 (Anopheles)，當感染皰原蟲的雌性按蚊叮咬人類時，其唾液中的子孢子隨唾液進入人體的 末梢血液，并隨之進入肝臟。子孢子在肝內發育并進行裂體增殖。當裂殖體發育成熟時， 被寄生的肝細胞破裂并釋放裂殖子至周圍血循環中，裂殖子一部分被吞噬細胞吞噬，另一 部分侵入紅細胞并在其中發育和增殖[1]。侵入后，裂殖子先形成環狀體，經大滋養體、未成 熟裂殖體，最后形成含有一定數量裂殖子的成熟裂殖體，最終導致紅細胞破裂并釋放裂殖 子。新釋放的裂殖子可以再次入侵其他紅細胞，整個復制過程重復幾次之后，部分裂殖子侵 入紅細胞后不再進行裂體增殖，而是發育成雌、雄配子體。配子體的可以在按蚊叮咬人體時 感染按蚊，并在其胃中進一步發育，配子體在人體中無法發育。
[0003] 能夠引起人類瘧疾的瘧原蟲共有5種：惡性瘧原蟲（P. falciparum)、間日瘧 原蟲（P. vivax)、卵形皰原蟲（P. ovale)、三日皰原蟲（P. malariae)以及諾氏皰原蟲 (P.knowlesi)。其中由惡性瘧原蟲引起的瘧疾致死率最高，多發于非洲。間日瘧原蟲引起 的瘧疾致死率低于惡性瘧原蟲，但是它分布更廣且易復發[2]。其他三種瘧原蟲的感染率顯 著低于前兩種[3]。
[0004] 在全球范圍內，在過去的150年中，瘧疾的防治工作取得了巨大的進展，過半數的 國家和地區已經根治瘧疾。剩余的瘧疾疫區中也有近一半的國家和地區開始著手瘧疾的根 治工作[4]。截至2012年，全球還有104個國家和地區處于瘧疾流行區（其中5個國家即 將完成根治工作）[3]。然而近年來由于某些地區瘧疾控制力度的降低、金融危機、病原耐藥 性的提高以及人口流動的加大等因素，瘧疾的根治工作面臨著越來越多的困難[5]。根據世 界衛生組織的報告[3]，截至2011年，全球范圍內仍有33億人面臨瘧疾感染的威脅。
[0005] 鑒于瘧疾的傳播途徑清晰、治療手段明確、防控策略成熟，世界衛生組織認為各國 家和地區應當以瘧疾的徹底根除作為最終目標[3]，并建議達已經到瘧疾根治條件的國家 和地區大力開展瘧疾根治行動，在瘧疾已根除地區應該采取措施防止新瘧疾感染源流入。
[0006] 在我國，過去幾十年中，瘧疾流行情況和防治工作發生了較大的變化。我國衛生部 2006年發布的《2006-2015年全國瘧疾防治規劃》指出，瘧疾是嚴重危害我國人民身體健康 和生命安全、影響社會經濟發展的重要蟲媒傳染病。過去的50年來，我國瘧疾防治工作取 得了顯著成效：截至規劃發布時，瘧疾的發病人數已由20世紀70年代初的二千多萬減少到 了數十萬，顯著的縮小了重度流行區的范圍，除云南、海南兩省外各省已消除了惡性瘧。但 是由于瘧疾流行因素復雜，具有傳播快、易反復的特點，加上近年來部分地區防治工作力度 有所削弱，經費投入不足，以及流動人口和周邊一些國家疫情對我國邊境地區的影響，2000 年以來我國瘧疾疫情出現回升，部分地區出現暴發疫情[6]。截至2006年規劃發布時，全國 有21個省、自治區、直轄市存在瘧疾傳播，其中，云南、海南兩省的瘧疾流行仍較為嚴重，中 部地區的蘇、魯、豫、皖、鄂5省瘧疾流行尚未得到有效控制，許多省受到輸入性惡性瘧的威 脅，防治工作形勢依然十分嚴峻。《2006-2015年全國瘧疾防治規劃》發布之后，中央和地方 各級政府加大了對瘧疾防控工作的支持和投入，使局部地區疫情回升勢頭得到有效遏制。 到2010年，全國24個瘧疾流行省、自治區、直轄市中，95%的縣（市、區）瘧疾發病率已降 至萬分之一以下，僅有87個縣（市、區）瘧疾發病率超過萬分之一 [7, 8]。
[0007] 根據這一最新情況，為切實保障廣大人民群眾身體健康、促進經濟與社會協調發 展、響應聯合國千年發展目標高級別會議提出的在全球根除瘧疾的倡議，我國政府決定在 2010年全面開展消除瘧疾工作，到2020年全國范圍內實現消除瘧疾的目標[7]。
[0008] 全球瘧疾防治工作形勢的變化以及我國對于瘧疾的最新防控策略對瘧原蟲的檢 測方法提出了新要求[9]:在瘧疾低流行區或是接近根除的區域，瘧原蟲感染常常無臨床 癥狀表現，并且患者血液瘧原蟲含量可能很低[10, 11]，這就要求診斷方法具有極高的靈敏 度。另外，為了實現瘧疾的根除，瘧原蟲的檢測策略應當從被動等待患者到醫院診斷改為主 動的篩查當地所有潛在的瘧疾患者，包括沒有表現出臨床癥狀的潛在患者。因為無臨床癥 狀的瘧疾患者是很嚴重的瘧疾傳染源[12-14]。根據世界衛生組織的最新報告，我國尚不 具備全面根治瘧疾所需要的疾病監測能力[3]。因此，為了更好的完成全球范圍內的瘧疾 防控與根除工作，更好的滿足我國政府作出的瘧疾根治策略的需要，在瘧疾的篩查與監測 中，我們亟需一個同時具備以下幾個特性的瘧原蟲檢測方法：具有大批量樣品處理能力以 滿足大規模篩查需要；具有極高的靈敏度以滿足檢測無癥狀感染者以及血液混樣（sample pooling)的需求；具有極高的特異性以指導疾控中心建立相關模型和指導醫師合理制定 治療方案。
[0009] 目前主要的瘧疾診斷方法包括：依靠癥狀診斷、顯微鏡鏡檢、RDT快速診斷實驗、 基于核酸擴增的檢測技術等。具體如下：
[0010] 依靠癥狀的診斷。在部分地區，臨床上的瘧疾診斷僅利用病人癥狀進行判斷。瘧 疾的臨床癥狀包括發燒、嘔吐、頭暈、頭痛、寒冷、嗜睡、呼吸困難等。但這些癥狀的特異性不 高、容易與其他疾病的癥狀混淆，因此依靠癥狀的診斷在瘧疾流行地區可能導致對非瘧疾 病人的誤診，而在非瘧疾流行區可能會導致對瘧疾病人的誤診[15]。
[0011] 顯微鏡鏡檢。厚、薄血膜染色鏡檢是目前最常用的方法。該方法通過取外周血制 作厚、薄血膜，經姬氏或瑞氏染液染色后鏡檢查找瘧原蟲。姬姆薩（Giemsa)薄片染色步驟 大致為：空氣瞭干、甲醇固定、Giemsa染色、漂洗瞭干、100x油鏡觀察[16]。由于可以直觀 的看到寄生蟲的存在與否以及數量，顯微鏡鏡檢法至今仍被學術界認定為臨床瘧疾診斷的 金標準，并且被世界衛生組織推薦為瘧疾疫區確診瘧原蟲感染的兩種方法之一 [3]。但是這 種方法需要更多的人力、時間，無法用于大批量樣品的快速診斷。不僅如此，這種顯微鏡檢 測的方法對檢驗員的專業要求很高，并且易受主觀因素的影響，不同檢驗員對同一樣品檢 驗的結果也可能有較大差異[17]。這就導致了顯微鏡鏡檢對瘧原蟲的定量有較大誤差，并 因此影響到治療方案的選擇。該方法另外一個較大的缺點就是靈敏度較低，專業的鏡檢人 員對瘧疾樣品的檢出下限約為每毫升血樣50000個瘧原蟲，而分子生物學的方法的檢測下 限可比顯微鏡鏡檢低2500倍[18]。
[0012] RDT快速診斷實驗。RDT快速診斷實驗采用快速診斷試紙條對微量血液進行檢測， 它基于免疫層析技術，檢測對象是瘧原蟲的抗原。按照RDT診斷法靶標抗原的不同，可以將 RDT方法分為4類[19]，這四種靶標抗原為：富含組胺酸蛋白2 (HRP2)，一種水溶性的蛋白， 僅產生于惡性瘧原蟲；瘧原蟲乳酸脫氫酶（pLDH)，一種存在于所有瘧原蟲中的酶；瘧原蟲 醛縮酶（Plasmodium aldolase), -種存在于四種皰原蟲（惡性皰原蟲、間日皰原蟲、三日 瘧原蟲、卵形瘧原蟲）的酶；第四種抗原為間日瘧原蟲的特異性抗原，該抗原的資料未被公 開，但是已經有文獻通過實驗證明了該抗原的特異性[20]。相比于其他診斷方法，RDT快速 診斷實驗更加準確可靠、快速、經濟，更適用于緊急或是沒有專業瘧疾診斷人員的情況，此 外該方法不需要電、顯微鏡等設備，在偏遠地區可以扮演重要角色，世界衛生組織也將RDT 瘧原蟲檢測技術推薦為瘧疾疫區確診瘧原蟲感染的兩種方法之一 [3]。在一項針對我國與 緬甸邊境地區瘧疾流行狀況的調查中，RDT方法對瘧疾的診斷顯示出了與顯微鏡鏡檢相當 的靈敏度與特異性[21]。但是RDT診斷方法在鑒別瘧原蟲物種方面效果有限，大多數的試 劑盒只能區分出惡性瘧原蟲，對于其他瘧原蟲，則無法準確判斷[22]。另外，以富含組胺酸 蛋白2(HRP2)為檢測靶標的試劑盒容易對痊愈后的瘧疾患者得出假陽性結果，這是由于該 抗原在患者接受治療后仍會繼續存在[23]，這樣的特性極大的限制了這類試劑盒在評價療 效以及預后方面的應用。基于檢測瘧原蟲乳酸脫氫酶（PLDH)的試劑盒在評價治療效果過 程中，可能比鏡檢更早出現陰性；然而在病情復發后，該類產品比鏡檢檢出陽性的時間更滯 后[19]。
[0013] 基于核