一種非病毒iPSCs誘導組合物及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種非病毒iPSCs誘導組合物及其試劑盒。具體地，包括若干重組質粒，所述若干重組質粒是由將表達重編程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa?miR?302s的DNA序列構建到附加體質粒所制得；所述hsa?miR?302s的DNA序列為包含hsa?miR?302a、hsa?miR?302b、hsa?miR?302c、hsa?miR?302d中的任一種或兩種以上的序列。該誘導組合物不加入高風險重編程因子，如c?MYC、SV40?LT、TP53抑制因子，適用于安全性高、非整合地誘導重編程獲得iPSCs，可很大程度上地降低臨床風險。
【專利說明】
一種非病毒i PSCs誘導組合物及其試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種非病毒iPSCs誘導組合物及其試劑盒，屬于生物工程技術及再生 醫學領域。
【背景技術】
[0002] 經典干細胞生物學通常認為細胞分化是單向不可逆的，1962年，英國科學家John B.Gurdon將青蛙腸細胞核移植入去核的青蛙卵細胞內，并發育成一只正常的蝌蚪，首次證 實了體細胞核可以重編程為具有類似胚胎發育早期階段的多能細胞狀態，類似的技術也催 生了各種克隆的哺乳動物誕生。在Gurdon成果報道四十年后，日本科學家Shinya Yamanaka 于2006年利用逆轉錄病毒攜帶的四個轉錄因子(0CT4(標準基因名為:P0U5F1)、S0X2、KLF4、 c-MYC，簡稱0SKM)成功地將小鼠成纖維細胞重編程為具備胚胎干細胞（embryonic stem cells,ESCs)多能性的誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs)，次年 Yamanaka研究小組利用相同的方法獲得了人的iPSCs，與此同時James A · Thomson研究小組 也通過慢病毒攜帶另外四個轉錄因子(0(^4、5(^2、似11叩、1^1128，簡稱05見)成功獲得了人 的iPSCs(hiPSCs)。由于iPSCs不受如克隆技術以及ESCs(來源于胚胎組織）使用的倫理限 制，且與ESCs在形態、基因表達譜系、表觀遺傳譜系、自我更新能力以及多能性等方面表現 出高度的相似，甚至不可區分，能夠向所有成體細胞、組織、器官分化，使其具備在器官組織 細胞移植、腫瘤治療、遺傳病修復、藥物篩選等領域能夠發揮重要的作用，因此iPSCs的誕生 給干細胞與再生醫學帶來前所未有的一場革命。
[0003] 我們將重編程因子導入細胞的方式分為病毒和非病毒介導兩種，經典的方法采用 病毒攜帶重編程基因，然而由于慢病毒或逆轉錄病毒會將其基因組插入整合到宿主基因組 中，存在染色質不穩定甚至細胞癌變的可能。2008年Stadtfeld等人使用非整合腺病毒載體 攜載四因子獲得了小鼠 iPSCsOniPSCddOOg年，Fusaki等人使用非整合的仙臺病毒獲得了 hiPSCs。盡管如此，有活性的病毒仍然只限于實驗研究，仍存在未知的臨床風險，Okita等人 于2008年報道使用普通真核表達質粒成功地獲取了 miPSCs，但是普通質粒極易丟失，需要 多次轉染，造成誘導效率極低，較難得到hiPSCs，不能廣泛應用相關研究。2009年俞君英報 道使用附加體質粒攜帶重編程因子獲得了hiPSCs，附加體質粒包含OriP/EBNAl (Epstein-Barr nuclear antigen-1)兩個DNA元件(本專利所涉及的附加體質粒，統一為包含OriP/ EBNAl元件的附加體質粒），其中EBNAl基因的表達產物可以結合到OriP元件上，使附加體質 粒比普通質粒在細胞內能更高效地復制，因此重編程過程中附加體質粒只需轉染一次即 可，然而附加體大約在2個月后便可完全丟失，迄今該技術已廣泛應用于體細胞非整合誘導 重編程。然而目前已報道廣泛使用的附加體質粒進行體細胞重編程的系統，均包含許多高 風險的致癌基因或因子中的至少一個，如c-MYC、SV40-LT、TP53抑制因子等致癌因子，使用 這些高風險因子得到的iPSCs可能存在諸如細胞致瘤的風險。iPSCs要在臨床上廣泛應用， 必須得到安全性高且適合大規模制備iPSCs的相關技術。

【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種安全性高、適合臨床 應用的非病毒iPSCs誘導組合物。
[0005] 實現本發明的目的可以通過采取如下技術方案達到：
[0006] -種非病毒iPSCs誘導組合物，包括若干重組質粒，所述若干重組質粒是由將表達 重編程因子?01]5?1、5(^2、61^51、1(1^4、]\^(^和118311丨1?-3028的0嫩序列構建到附加體質粒 所制得；
[0007] 所述]18&-11111?-3028的0麻序列為包含118&-11111?-302&、118&-11111?-30213、118&-11111?-302c、hsa-miR_302d中的任一種或兩種以上的序列。
[0008] 作為優選，采用II型啟動子連接并起始轉錄P0U5F1、S0X2、GLIS1、KLF4和MYCL的表 達。
[0009] 作為優選，采用EF-lα、CMV或CAG啟動子連接并起始轉錄P0U5Fl、S0X2、GLISl、KLF4 和MYCL表達。
[0010]作為優選，采用I型、II型或III型啟動子連接并起始轉錄hsa-miR-302s的表達。 [0011]作為優選，采用CMV、U6或Hl啟動子連接并起始轉錄hsa-miR-302s的表達。
[0012] 作為優選，所述重編程因子?〇1^1、3(^2、61^1、10^4和1^(^采用11^類或2六類共 表達元件，進行兩個或兩個以上表達蛋白的重編程因子基因在單啟動子下共表達。
[0013] 作為優選，所述重編程因子？01]5?1、5(^2、61^51、1(1^4和]\^(^采用11^51、11^52、 P2A或F2A共表達元件，進行兩個或兩個以上表達蛋白的重編程因子基因在單啟動子下共表 達。
[0014] 作為優選，將重編程因子P0U5F1和GLISl采用P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟 動子起始轉錄，KLF4和S0X2采用P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有 P0U5F1、GLIS1、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子 MYCL和hsa-miR-302s分別采EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一 附加體質粒。
[0015]作為優選，所述誘導組合物還包括MEK抑制劑、GSK-3I3抑制劑、組蛋白去乙酰化酶 抑制劑、賴氨酸特異性去甲基化酶抑制劑中一種或兩種以上。
[0016] 作為優選，所述MEK抑制劑為Η)0325901或Η)98059。
[0017] 作為優選，所述 GSK-30 抑制劑為 Tideglusib、CHIR-99021 或 TWS119。
[0018] 作為優選，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為丁酸鈉或丙戊酸鈉。
[0019] 作為優選，所述賴氨酸特異性去甲基化酶抑制劑為反苯環丙胺鹽酸鹽。
[0020] 本發明的另一目的在于提供一種試劑盒，包括上述的誘導組合物。
[0021] 相比現有技術，本發明的有益效果在于：
[0022] 1)本發明提供的非病毒1?3(^誘導組合物不加入高風險編程因子，如〇-1^(：、5￥40-LT、TP53抑制因子，適用于非病毒iPSCs的誘導培養，可很大程度上地降低臨床風險；
[0023] 2)本發明提供的誘導組合物能有效縮短誘導培養時間，在整個誘導過程中小分子 化合物刺激最短2天便能順利高效地最終獲得iPSCs。
【附圖說明】
[0024] 圖1為pCEP4質粒圖譜；
[0025]圖2為實施例1重組質粒圖譜；
[0026]圖3為實施例1的顯微鏡視野圖；
[0027]圖4為實施例1的細胞染色質核型鑒定圖；
[0028]圖5為實施例1的畸胎瘤鑒定圖；
[0029] 圖6為實施例1的多能性分子標記鑒定圖；
[0030] 圖7為實施例2的試驗組和對照組的AP染色效果圖；
[0031] 圖8為實施例3的核型異常率柱形圖；
[0032]圖9為實施例4的AP染色掃描圖；
[0033]圖10為實施例4的AP染色計數柱形圖；
[0034]圖11為實施例5的AP染色掃描圖；
[0035]圖12為實施例5的AP染色計數柱形圖；
[0036]圖13為實施例6的AP染色掃描圖；
[0037]圖14為實施例6的AP染色計數柱形圖；
[0038]圖15為實施例7的AP染色掃描圖；
[0039]圖16為實施例7的AP染色計數柱形圖；
[0040]圖17為實施例8的AP染色掃描圖；
[00411圖18為實施例8的AP染色計數柱形圖；
[0042]圖19為實施例9的AP染色掃描圖；
[0043]圖20為實施例9的AP染色計數柱形圖；
[0044] 圖21為實施例10第1組的重組質粒圖譜示例；
[0045] 圖22為實施例10第3組的重組質粒圖譜示例；
[0046] 圖23為實施例10第4組的重組質粒圖譜示例；
[0047]圖24為實施例10第5組的重組質粒圖譜示例；
[0048]圖25為實施例10的AP染色掃描圖；
[0049]圖26為實施例10的AP染色計數柱形圖。
【具體實施方式】
[0050]下面，結合附圖以及【具體實施方式】，對本發明做進一步描述。
[0051] 我們研發出一種使用附加體質粒在不加入高風險重編程因子，如c-MYC、SV40_LT、 TP53抑制因子等的情況下，使用安全性高的重編程因子組合，并在極短的低風險性小分子 化合物刺激條件下高效獲得MPSCs，使非整合iPSCs的獲取技術更能滿足臨床安全級別和 規模化生產所需求。
[0052] 以下【具體實施方式】中，如未特殊說明，所用到的試劑、質粒及基因均可通過市售途 徑或常規試驗手段獲得。
[0053]以下【具體實施方式】中，用到的試劑信息如下：
[0054] PD0325901(CAS號：391210-10-9)、PD98059(CAS號：167869-21-8),Tideglusib (CAS號：865854-05-3)，l-Azakenpaullone(CAS號：676596-65-9; 1-氮雜坎帕羅酮），CHIR-99021(CAS號：252917-06-9)，TDZD-8(CAS號：327036-89-5)，TWS119(CAS號：601514-19-6), AR-A014418(CAS號：487021-52-3)，AZD2858(CAS號：486424-20-8)，頂-12(CAS號：1129669- 05-1)，M 344(CAS號：251456-60-7),NCH 51(CAS號：848354-66-5)，NSC 3852(CAS號：3565-26-2; 5-亞硝基_8_羥基喹啉），Sodium Phenylbutyrate(CAS號：1716-12-7;4-苯基丁酸鈉 鹽），Pyroxamide(CAS號：382180-17-8 ;N-羥基-Ν'-3-吡啶基辛二酰胺），SBHA(CAS號： 38937-66-5;軟木肟酸），ScriptaicKCAS號：287383-59-9)，Sodium butyrate(CAS號：156-54-7 ; 丁酸鈉 ），Valproic acid，sodium salt (CAS 號：1069-66-5;丙戊酸鈉 ）Pifithr in-μ (CAS號：64984-31-2),Pifithrin-ahydrobromide(CAS號：63208-82-2),Tranylcypromine hydrochloride(CAS號：1986-47-6;反苯環丙胺鹽酸鹽）。
[0055] 本申請提供的方法適用于人的大部分體細胞或成體干細胞(又稱成體細胞），包括 但不限于腎上皮細胞。以下【具體實施方式】中，以下除了標注的適合多種細胞重編程外，均為 尿液中來源的細胞實施例;所采用的人的體細胞是尿液來源的腎上皮細胞，通過離心人的 尿液，收集人尿液來源腎上皮細胞并進行擴大培養得來，所有的尿液供體均簽署由廣州市 搏克腫瘤研究所倫理委員會審查通過的知情同意書。
[0056] 本申請提供的方法同樣還適用于人成纖維細胞或人間充質干細胞等成體細胞，這 些成體細胞均可通過商業購買途徑獲得。
[0057] 本申請中，所述的附加體質粒(或載體）中的"附加體"是由Episomal翻譯而來的， 又可譯為附加型（質粒或載體）、游離型質粒(質粒或載體）。以下【具體實施方式】中，所采用的 附加體質粒為Episomal-EBNAl/OriP質粒，均改造自pCEP4質粒，該附加體質粒來源于 Invitrogen pCEP4 Mammalian Expression Vector，貨號為V04450,其結構如圖 1 所不。本 申請中，P0U5F1 又名 0CT4;MYCL 又名 L-MYC。
[0058] 以下【具體實施方式】中，所采用的重編程因子名稱、種屬和基因登錄號、長度如下如 表所示：
[0059] 表1重編程因子名稱、種屬、登錄號和長度
[0061 ]以下具體實施例中，所述hsa-miR-302s的信息如下：
[0062]表2 hsa-miR-302s的信息
[0064]以下【具體實施方式】中，采用不同長度的hsa-miR_302s構建重組質粒，其中，其中不 同長度的hsa-miR-302s信息如下所示：
[0065] hsa-miR-302b(5'+75bp，3'+27bp)序列如SEQ ID No.l所示；
[0066] hsa-miR-302b(5'+150bp，3'+54bp)序列如SEQIDNo·2所示；
[0067] hsa-miR-302c(5'+27bp，3'+56bp)序列如SEQIDNo·3所示；
[0068] hsa-miR-302c(5'+54bp，3'+lllbp)序列如SEQIDNo·4所示；
[0069] hsa-miR-302a(5'+55bp，3'+56bp)序列如SEQ ID Νο·5所示；
[0070] hsa-miR-302a(5'+lllbp，3'+lllbp)序列如SEQ ID Νο·6所示；
[0071] hsa-miR-302d(5'+55bp，3'+31bp)序列如SEQ ID Νο·7所示；
[0072] hsa-miR-302d(5'+lllbp，3'+62bp)序列如SEQ ID Νο·8所示；
[0073] hsa-miR-302bcad(5'+75bp，3'+31bp)序列如SEQ ID Νο·9所示；
[0074] hsa-miR-302bcad(5'+150bp，3'+62bp)序列如SEQIDNo·10所示 ；
[0075] hsa-miR-302cluster(5'+75bp，3'+130bp)序列如SEQ ID No. 11 所不；
[0076] hsa-miR-302cluster(5'+150bp，3'+260bp)序列如SEQIDNo·12所示。
[0077] 以下【具體實施方式】中，采用c-MYC、SV40-LT和TP53抑制因子TP53shRNA構建到附加 體質粒或者將TP53抑制因子TP53siRNA通過轉染方式以進行對比試驗。其中TP53抑制因子 TP53shRNAl和TP53shRNA2分別構建到附加體質粒中并采用電轉方式進行實驗，TP53siRNAl 和TP53siRNA2采用脂質體轉染方式進行實驗；
[0078] 其中：
[0079] TP53shRNAl靶位點為5' -GACTCCAGTGGTAATCTAC-3' ；
[0080] TP53shRNA2靶位點為5' -GTCCAGATGAAGCTCCCAGAA-3' ；
[0081 ] TP53siRNAl購買自Santa Cruz Biotechnology，貨號為sc-45917;
[0082] TP53siRNA2購買自Cell Signalling Technology，貨號為#6231。
[0083] 以下【具體實施方式】中，通過AP染色、核型、畸胎瘤及流式細胞術多能性鑒定檢測 (簡稱FACS)各實施例是否能形成iPSCs及能否良好地維持iPSCs的染色體穩定、自我更新能 力以及多能性。
[0084] 1、AP染色法的具體操作步驟如下
[0085] a)細胞培養完后，吸棄培養基，IXPBS洗1遍;4%多聚甲醛室溫固定2min;
[0086] b)吸棄固定液，IXTBST洗3遍;AP buffer室溫平衡5min;
[0087] c)AP顯色液室溫避光顯色15min(5-15min，需克隆顏色變深而又無背景時終止，若 顏色未完全染色，可適當延長染色時間），吸棄顯色液，I X PBS洗兩遍，適量I X PBS覆蓋住細 胞，顯微鏡下觀察并計數。
[0088] 堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)是一種單酯磷酸水解酶，細胞質中的堿 性磷酸酶在堿性條件下能夠水解磷酸萘酚鈉產生α萘酚，后者與一種穩定的偶氮鹽發生反 應并呈現深紫色，以此判斷堿性磷酸酶的存在以及表達豐度。堿性磷酸酶在未分化的多能 干細胞中表達量很高，分化后的多能干細胞堿性磷酸酶活性下降，因此可以用堿性磷酸酶 染色(AP染色)實驗來判斷細胞是否為iPSCs克隆，并由此可以方便地根據AP陽性克隆效率 來判斷iPSCs產生的效率。
[0089]對于實施例1-2以及4_6，AP陽性克隆效率是基于電轉后傳代種到每組中的細胞數 量所決定的，即AP陽性克隆效率=AP陽性克隆數/電轉后每組每孔傳代細胞數量；
[0090] 對于實施例3以及7-10，AP陽性克隆效率是基于電轉細胞的總數決定的，即：AP陽 性克隆效率=AP陽性克隆數/電轉細胞量。
[0091] 核型鑒定方法
[0092] 1)實驗試劑：
[0093] 20yg/mL秋水仙素；PBS;生理鹽水；0.25 % trypsin; 0.075M氯化鉀溶液;MEF;卡諾 固定液;Giemsa染色液;3%Tr is 〇
[0094] 2)實驗用品：
[0095] 37 °C恒溫培養箱;移液槍（100μ1，ImL);低速離心機;恒溫水浴鍋;載玻片;膠頭滴 管;烘箱;酸缸;染色缸;顯微鏡。
[0096] 3)實驗步驟
[0097] 3.1)細胞準備
[0098] 生長狀態良好，去feed，無分化，生長密度在80~90 %之間。
[0099] 3.2)秋水仙素處理
[0100]培養終止前在培養基的量加入濃度為20yg/mL的秋水仙素，使其終濃度為0.2yg/ mL，37°C培養箱中處理100~130min。
[0101] 3.3)低滲處理
[0102] 秋水仙素處理完后，先吸棄培養液，用PBS洗兩次，加入0.5mL0.25 %胰酶消化，輕 輕敲打培養皿，使未脫落的細胞脫落，加入ImL MEF終止消化，用吸管吸取轉移入15mL離心 管，離心（1200rpm，5min)，收集細胞。然后加入37°C預熱的0.075mol/L KCL溶液7mL，用吸管 吹打成細胞懸液，置37°C水浴處理18-28min。
[0103] 3.4)預固定
[0104] 新鮮配制卡諾固定液（甲醇冰醋酸3:1配制），用膠頭滴管加入約ImL固定液進行預 固定3min〇
[0105] 3.5)固定
[0? 06] 預固定后，1200r/min離心5min，棄上清，加入約7mL新鮮的固定液，用膠頭滴管輕 輕打勾，于37°C水浴固定40min。
[0107] 3.6)滴片
[0108]固定完成后，1200r/min離心5min，然后用膠頭滴管吸棄大部分固定液，留部分固 定液(根據細胞的量確定留液多少）重懸細胞，距離載玻片30cm左右距離滴片。注意使用冰 凍干凈的載玻片進行滴片。
[0109] 3.7)烤片
[0110]滴片后馬上把載玻片移進75°C烘箱烘3h。
[0111] 3.8)染色(G 顯帶）
[0112] 往55mL生理鹽水加入0.03g胰酶粉，輕輕搖勻，用3 %Tris調節其PH約為7.2。將制 片放入胰酶消化液處理8秒后，迅速放入生理鹽水終止其消化，再放入Giemsa染液染色5~ IOmin，然后用鑷子夾出玻片，用自來水輕輕沖洗兩面，室溫干燥或電吹風吹干。
[0113] 3.9)鏡檢
[0114] 待玻片干后，在顯微鏡下檢查，先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀 察。
[0115] 3.10)分析(對染色體數目，帶型進行分析），每個細胞共分析20個分裂視野，若染 色體數出現異常數的次數大于或等于3，則為異常。
[0116] FACS檢測多能性標記物(Marker):
[0117] 1)用0.25%胰酶消化細胞，離心，之后用PBS重懸細胞，轉移到1.5mL的EP管中。
[0118] 2)加入200yL 1% 多聚甲醛，37°C，5-10min。
[0119] 3)離心，用PBS洗1次，之后加入200yL 90%預冷后的甲醇，冰上30min。
[0120] 4)離心，用 PBS 洗 2 次。加一抗(抗體 1:50 稀釋），加 50yL，37°C，30min。
[0121 ] 5)離心，用PBS洗1-2次，加二抗(抗體1:500稀釋），加 IOOyL，37°C，30min，加二抗要 避光。
[0122] 6)用PBS洗1次，之后用300yL PBS重懸，過濾，上機，收488(綠色）或568(紅色）陽性 細胞。
[0123] 本發明采用流式細胞術檢測多能性標記物0CT4、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81的表 達；
[0124] 其中，1)0CT4是多能干細胞最核心的轉錄因子，在分化的細胞或其他成體干細胞 中幾乎不表達或極低表達，其被作為多能干細胞最重要的分子標記特征。
[0125] 2) SSEA4是階段特異性胚胎抗原，在人多能干細胞表面大量表達，是一種糖脂類抗 原表位，人多能干細胞分化會導致SSEA4表達降低，因此，它也經常被用作多能干細胞分子 標記的特征。
[0126] 3)Tra-l_60和Tra-1-81是高分子量的糖蛋白抗原，是多能干細胞表面抗原，在多 能干細胞中是高表達的，其用作多能干細胞多能性分子標記。
[0127] 因此，可通過FACS鑒定0CT4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81四種抗原的表達，以判斷 包括iPSCs在內的人多能干細胞的屬性分子標記特征。
[0128] 畸胎瘤鑒定方法
[0129] 1)細胞生長至75%-80%，用IV型膠原酶消化10min，DMEM/F12輕洗3遍，用機械法 將細胞刮落。
[0130] 2)加入 DMEM/F12，100g 離心 5min。
[0131] 3)在冰上先將Matr ige 1與DMEM/F12按1:2混勻，再與細胞進行混勻。
[0132] 4)將混合物注射入NOD-SCID小鼠四肢的肌肉或皮下，待畸胎瘤長至一定大小進行 取瘤，并進行HE染色及分析。
[0133] 5)畸胎瘤染色后三個胚層代表分析：
[0134] 外胚層:黑色素細胞分化;放射狀排列的神經組織分化等。
[0135] 中胚層:肌肉組織分化;軟骨組織分化;脂肪組織分化等。
[0136] 內胚層:腺體分化;腔狀腸上皮組織分化等。
[0137] 實施例1
[0138] 本實施例1提供一種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0139] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒中，得到重組質粒；
[0140] 其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No. 12所不；
[0141] 其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒;其重組質粒圖譜如圖2所示；
[0142] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養15天，得到iPSCs;所 述人的體細胞為從尿液中分離的腎上皮細胞。
[0143] 步驟2)中，具體操作如下：
[0144] a)電轉:使用胰酶消化腎上皮細胞，取步驟1)得到的重組質粒加入到腎上皮細胞， 將重組質粒電轉入腎上皮細胞，電轉后將細胞種于包被有細胞外基質的細胞培養板中；
[0145] 所述細胞培養板可采用Matrigel或其他人多能干細胞培養細胞外基質;通常一個 培養體系中，取2-10yg重組質粒和50-400萬腎上皮細胞；
[0146] b)誘導培養:步驟1)進行后1-3天或待細胞貼壁匯合率達30%以上，換人多能干細 胞培養基繼續誘導培養，約15-30天iPSCs克隆成熟后，使用AP染色鑒定iPSCs陽性克隆數， 并計算AP陽性效率；
[0147] 經AP染色檢測，AP陽性克隆濃度達到38個/2 X IO5個細胞每孔。其采用顯微鏡(4 X 物鏡)觀察iPSCs的顯微鏡視野圖如圖3所示，展現出使用本實施例的方法誘導獲得的iPSCs 的形態與胚胎干細胞一致，在體外培養具備自我更新的能力；
[0148] 體細胞重編程過程中會因各種因素導致誘導所得的iPSCs染色體(質)核型出現異 常，可能導致腫瘤或其他異常細胞的發生。G帶染色體核型分析即通過吉薩母染料染色后使 染色體顯帶（即G帶），然后對染色體進行計數、配對及排列來進行染色體的核型分析，以此 來判斷iPSCs的核型是否正常。本實施例得的iPSCs細胞染色質核型鑒定結果如圖4所示，鑒 定結果顯示iPSCs核型正常，說明采用本實施例提供的方法可以獲得核型正常的iPSCs;
[0149] iPSCs與其他多能干細胞一樣具有向三胚層所有類型的細胞分化的能力，在免疫 缺陷小鼠體內通過皮下或肌肉注射多能干細胞，可以自發分化為包含三個胚層的畸胎瘤， 以此判斷其具備多能干細胞的多能性(如三胚層分化能力）。畸胎瘤鑒定結果如圖5所示，表 明本實施例獲得的iPSCs可以向外中內三個胚層分化，由左至右分別為內胚層(腸樣上皮分 化），中胚層(軟骨分化），外胚層(放射狀排列的神經組織和黑色素細胞），表明其具有多能 性；
[0150]多能性分子標記鑒定結果如圖6所示，使用FACS分別鑒定獲得的iPSCs中0CT4、 SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81的表達情況，結果顯示多能性分子標記均在90%以上，說明使 本方法獲得的iPSCs具備多能干細胞的分子標記特征。
[0151] 實施例2
[0152] 本實施例是在實施例1的基礎上，在步驟2)的誘導培養過程中，加入小分子化合物 刺激誘導重編程過程。
[0153] -種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0154] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和11831^1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒中，得到重組質粒；
[0155] 其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No. 12所不；
[0156] 其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒；
[0157] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養15天，得到iPSCs;
[0158] 其中，在誘導培養day〇-day8天，每天向誘導培養中加入0·5μΜ PD0325901、3yM CHIR-99021、0.25mM丁酸鈉和2μΜ的反苯環丙胺鹽酸鹽的混合物，作為試驗組；以不加入小 分子化合物誘導培養基作為對照組。
[0159] 本實施例中，試驗組和對照組的AP染色效果圖如圖7所示。由圖7可知，在誘導培養 過程中，試驗組的誘導培養條件下的誘導效率遠高于對照組，加入小分子化合物誘導培養 條件更具有優勢。加入小分子化合物能有效刺激誘導重編程過程，提高iPSCs的誘導重編程 效率。
[0160] 實施例3
[0161] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，該方法中，除了重編程因子0CT4、S0X2、 61^151、1〇^4、1^-]^(：和11831^1?-3028以外，還同時研究抑制因子(3-]^(：、5￥40-1^或了？53對 iPSCs的影響，以研究不同的重編程因子對iPSCs核型的影響。
[0162] 其中，分別將c-MYC、SV40-LT或TP53shRNA構建到附加體質粒，或將TP53抑制因子 TP53siRNA直接轉染體細胞，或者直接向體細胞中加入Pifithr in-μ或Pifithr in-a hydrobromide〇
[0163] -種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0164] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，作為對照組，即第1組；在對照組的基礎上，將下表所示添加抑制因子C-MYC、SV40-LT或TP53shRNA同時構建到附加體質粒或將TP53抑制因子TP53siRNA直接轉染體 細胞，或者直接向體細胞中加入Pifithrin-μ或Pifithrin-a hydrobromide等方式進行的 試驗組作為第2-12組，得到重組質粒；
[0165] 表3抑制因子的組合表
L0167」其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒。其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No. 12所不；
[0168] 將表3中的(：-1^(：、3￥40-1^或了?538111?祖構建到另一新的附加體質粒，其中，(3-1^〇 和SV40-LT采用EF-Ia連接并起始轉錄，其共表達元件為P2A;TP53shRNA采用U6啟動子連接 并起始轉錄；
[0169] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，或將TP53siRNA轉染體細胞，或者直 接向體細胞中加入Pif ithrin-μ或Pif ithrin-ahydrobromide，進行誘導培養15天，得到 iPSCso
[0170]經AP染色檢驗，第1-12組的核型異常率柱形圖如圖8所示;從圖8可知，沒有加入抑 制因子的第1組的核型異常率最低，約為6%，而加入TP53抑制因子Pif ithrin-μ的第3組，在 只加1種抑制因子的試驗組中，核型異常率相對最高;從第10-11組與第12的比較可知，加入 3種抑制因子的核型異常率相對加入2種抑制因子的高。
[0171] 實施例4
[0172] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，在實施例1的基礎上，對不同的小分子 化合物對iPSCs的影響，用AP染色法檢測誘導效率。
[0173] -種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0174] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和11831^1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0175] 其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒;其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No. 12所不；
[0176] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養，在誘導培養的day〇-day8,分別加入如下表所示的小分子化合物，得到iPSCs。
[0177] 表4小分子化合物加入組合表 LU_i /7」 壯：&川狀仰市1」介1」的濃皮刀0.邱《;
[0180] b) GSK-30抑制劑的濃度為3μΜ;
[0181] c)組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為0.25mM;
[0182 ] d)賴氨酸特異性去甲基化酶抑制劑的濃度為2μΜ;
[0183]經AP染色檢驗，第1-13組的AP染色掃描圖如圖9所示，AP染色計數柱形圖如圖10所 示，以上結果表明，本發明公開的4個種類的小分子化合物均能較好地促進細胞進行重編 程，其中，相對地，第13組的陽性克隆的效率最高，即同時加入4個種類的小分子化合物能較 好地促進細胞重編程過程。
[0184] 實施例5
[0185] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，在實施例1的基礎上，對比不同濃度的 小分子化合物對iPSCs的影響，然后用AP染色法檢測誘導效率。
[0186] -種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0187] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0188] 其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒;其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No. 12所不；
[0189] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養，在誘導培養的day〇-day8,分別加入如下表所示的濃度的小分子化合物，得到iPSCs。
[0190] 表5不同濃度的小分子化合物對誘導培養的影響
[0192] 第1-16組的AP染色掃描圖如圖11所示，其AP染色計數柱形圖如圖12所示，從左至 右依次為第1-16組，上述AP染色結果表明，不同濃度的小分子化合物均可有效促進誘導過 程中細胞進行重編程。較理想的ro〇325901濃度為0.5μΜ，較理想的CHIR-99021濃度為3μΜ， 較理想的丁酸鈉濃度為0.25mM、較理想的反苯環丙胺鹽酸鹽濃度為2μΜ。
[0193] 實施例6
[0194] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，對比小分子化合物的加入時間對iPSCs 培養的影響，然后用AP染色法檢測誘導效率。
[0195] -種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0196] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0197] 其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒;其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No. 12所不；
[0198] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養，在如下表所述的時 間，每天加入〇.5μΜ PD0325901、3yM CHIR-99021、0.25mM丁酸鈉和2μΜ反苯環丙胺鹽酸鹽的 混合物，得到iPSCs。
[0200] 注:D表示天數，DO表示試驗處理當天，以此類推。
[0201]第1-11組的AP染色掃描圖如圖13所示，AP染色計數柱形圖如圖14所示，上述AP染 色結果表明，在誘導培養的期間加入小分子化合物的時間對細胞重編程過程沒有顯著的影 響。其中第4組的陽性克隆效率最高，即小分子化合物較理想的加入時間為誘導培養的當天 至第8天。
[0202] 實施例7
[0203] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，對比不同長度的hsa-miR_302s對iPSCs 培養的影響，用AP染色法檢測誘導效率。
[0204] -種非病毒iPSCs誘導方法，包括以下步驟：
[0205] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0206] 其中，將重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接并使用EF-Ia啟動子起始轉錄，將含有0CT4、 GLISl、KLF4和S0X2四個基因的DNA序列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子L-MYC和 hsa-miR-302s分別通過EF-Ia啟動子和CMV啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加 體質粒；
[0207] 其中，hsa-miR-302s的信息如下表所示：
[0208]表6 hsa_miR-302s信息
[0210] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養，在誘導培養的DayO-Day8,每天加入0.5μΜ PD0325901、3μΜ CHIR-99021、0.25mM丁酸鈉和2μΜ反苯環丙胺鹽酸鹽 的混合物，得到iPSCs。
[0211]第1-12組的AP染色掃描圖如圖15所示，AP染色計數柱形圖如圖16所示，上述AP染 色結果表明，不同長度的hsa-miR-302s對重編程過程沒有顯著的影響。其中，第9-10組的 hsa_miR-302bcad 是 118&-11111?-30213、118&-11111?-302(3、118&-11111?-302&和118&-11111?-302(1四種的組 合，相對于第1-8組單一的hsa-miR-302s陽性克隆效率較高;第11-12組為在上述四種的組 合基礎上增加了 hsa-miR-367，其誘導培養得到的陽性克隆效率更高。
[0212] 實施例8
[0213] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，對比啟動子對iPSCs培養的影響，然后 用AP染色法檢測誘導效率。
[0214] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0215] 其中，將表達重編程因子0CT4和GLISl通過P2A共表達元件連接到一個啟動子上起 始轉錄，KLF4和S0X2通過P2A共表達元件連接到一個啟動子上起始轉錄，將0CT4、GLIS1、 KLF4和S0X2構建到同一個附加體質粒;L-MYC和hsa-miR-302s構建到另一附加體質粒。
[0216] 其中，采用如下表所示的啟動子連接并起始轉錄編碼表達蛋白的基因（0CT4、 50父2、61^51、1(1^4和1^-]\^〇和非編碼表達蛋白的基因11831^1?-3028;其中，所述11831^1?- 302s為hsa-miR-302cluster，其序列如SEQIDNo·12所示；
[0217] 表7啟動子組合表
[0219] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養15天，其中，在誘導培 養的Day〇-Day8，每天加入0 · 5μΜ PD0325901、3μΜ CHIR-99021、0 · 25mM丁酸鈉和2μΜ反苯環 丙胺鹽酸鹽的混合物，得到iPSCs。
[0220]第1-5組的AP染色掃描圖如圖17所示，AP染色計數柱形圖如圖18所示；由圖18可 知，由不同啟動子組合分別構建而來的質粒均可以對細胞進行誘導重編程；當采用啟動子 EF-Ia連接并啟動轉錄編碼表達蛋白的基因，且采用啟動子CMV連接并啟動轉錄hsa-miR-302s，陽性克隆的效率最高。
[0221] 實施例9
[0222] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，對比不同共表達元件對iPSCs培養的影 響，然后用AP染色法檢測誘導效率。
[0223] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和118311丨1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0224] 其中，重編程因子0CT4、S0X2、GLIS1和KLF4在進行兩個或兩個以上表達蛋白的重 編程因子基因在單啟動子下共表達時，共表達元件如下表所示：
[0225] 表8共表達元件組合
[0227] 其中，在構建到附加體質粒過程中，將0CT4、GLIS1、KLF4和S0X2構建到同一個附加 體質粒，L-MYC和hsa-miR-302s構建到另一附加體質粒；用EF-Ia啟動子連接并起始轉錄編 碼表達蛋白的基因（0CT4、S0X2、GLIS1、KLF4和L-MYC)，用CMV啟動子連接并起始轉錄hsa-miR_302s表達;其中，所述hsa_miR-302s為hsa_miR-302cluster，其序列如SEQ ID No · 12所 示；
[0228] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養15天，其中，在誘導培 養的Day〇-Day8，每天加入0 · 5μΜ PD0325901、3μΜ CHIR-99021、0· 25mM丁酸鈉和2μΜ反苯環 丙胺鹽酸鹽的混合物，得到iPSCs。
[0229] 第1-4組的AP染色掃描圖如圖19所示，AP染色計數柱形圖如圖20所示；由圖20可 知，由不同的共表達元件分別構建而來的質粒均可以對細胞進行誘導重編程;第3組的陽性 克隆效率最高，即當采用P2A共表達元件時，細胞的誘導重編程效率較高。
[0230] 實施例10
[0231] 本實施例提供一種非病毒iPSCs誘導方法，對比重編程因子與附加體質粒的組合 對iPSCs培養的影響，然后用AP染色法檢測誘導效率。
[0232] 1)將表達重編程因子 0(^4、5(?2、61^51、1(1^4、1^-]^(：和11831^1?-3028的0嫩序列構 建到附加體質粒，得到重組質粒；
[0233] 其中，在進行兩個或兩個以上表達蛋白的重編程因子基因（0CT4、S0X2、GLIS1、 KLF4和L-MYC)在單啟動子下共表達時通過P2A共表達元件連接到一個啟動子上起始轉錄； 第1、3-5組的重組質粒圖譜示例見圖21-24;
[0234] 表9重編程因子與附加體質粒的組合
[0236] 注:a)此處KLF4的長度為1440bp，除特別注明以外，KLF4的長度為1413bp;
[0237] 其中，在構建到附加體質粒過程中，用EF-Ia啟動子連接并起始轉錄編碼表達蛋白 的基因（0(^4、5(^2、61^51、1(1^4和1^-]\^〇，用01^啟動子連接并起始轉錄11831^1?-3028表 達;其中，所述hsa-miR-302s為hsa-miR-302cluster，其序列如SEQIDNo·12所不；
[0238] 2)將步驟1)得到的重組質粒導入人的體細胞，進行誘導培養15天，其中，在誘導培 養的Day〇-Day8，每天加入0 · 5μΜ PD0325901、3μΜ CHIR-99021、0 · 25mM丁酸鈉和2μΜ反苯環 丙胺鹽酸鹽的混合物，得到iPSCs。
[0239] 第1-5組的AP染色掃描圖如圖25所示，其陽性克隆效率的柱形圖如圖26所示；由圖 26可知，重編程因子構建至不同數量的附加體質粒，均可對細胞進行重編程;第4組的陽性 克隆效率最高，即將0CT4、GLIS1、KLF4和S0X2構建到同一個附加體質粒，L-MYC和hsa-miR-302s構建到同一附加體質粒，細胞的誘導重編程效率較高。
[0240] 對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各 種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發明權利要求的保護范 圍之內。
【主權項】
1. 一種非病毒iPSCs誘導組合物，包括若干重組質粒，所述若干重組質粒是由將表達重 編程因子?01]5?1、5(^2、61^51、1(1^4、]\^(^和11831^1?-3028的0嫩序列構建到附加體質粒所 制得； 所述118&-11111?-3028的0財序列為包含118&-11111?-302&、118&-11111?-30213、118&-11111?-302(3、 hsa-miR_302d中的任一種或兩種以上的序列。2. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，采用II型啟動子連接并 起始轉錄 P0U5F1、S0X2、GLIS1、KLF4 和 MYCL 的表達。3. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，采用EF-la、CMV或CAG啟 動子連接并起始轉錄P0U5F1、S0X2、GLIS1、KLF4和MYCL表達。4. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，采用I型、II型或III型啟 動子連接并起始轉錄hsa-miR-302s的表達。5. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，采用CMV、U6或H1啟動子 連接并起始轉錄hsa-miR-302s的表達。6. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述重編程因子P0U5F1、 S0X2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES類或2A類共表達元件，進行兩個或兩個以上表達蛋白的 重編程因子基因在單啟動子下共表達。7. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述重編程因子P0U5F1、 S0X2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES1、IRES2、P2A或F2A共表達元件，進行兩個或兩個以上表 達蛋白的重編程因子基因在單啟動子下共表達。8. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，將重編程因子P0U5F1和 GLIS1采用P2A共表達元件連接并使用EF-la啟動子起始轉錄，KLF4和S0X2采用P2A共表達元 件連接并使用EF-la啟動子起始轉錄，將含有?01]5?1、61^151、1〇^4和5(?2四個基因的0嫩序 列共同構建至一附加體質粒;將重編程因子MYCL和hsa-miR-302s分別采EF-la啟動子和CMV 啟動子起始轉錄，并將其DNA序列構建至一附加體質粒。9. 如權利要求1所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述誘導組合物還包括 MEK抑制劑、GSK-30抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、賴氨酸特異性去甲基化酶抑制劑中 一種或兩種以上。10. 如權利要求9所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述MEK抑制劑為 PD0325901或PD98059。11. 如權利要求9所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述GSK-30抑制劑為 Tideglusib、CHIR-99021或TWS119。12. 如權利要求9所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述組蛋白去乙酰化酶 抑制劑為丁酸鈉或丙戊酸鈉。13. 如權利要求9所述的非病毒iPSCs誘導組合物，其特征在于，所述賴氨酸特異性去甲 基化酶抑制劑為反苯環丙胺鹽酸鹽。14. 一種試劑盒，其特征在于，包括如權利要求1-13任一項所述的誘導組合物。
【文檔編號】C12N15/85GK105861447SQ201610411335
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月13日
【發明人】王淋立, 陳月花, 宋立兵, 關春燕
【申請人】廣州市搏克生物技術有限公司, 王淋立