Jc病毒的檢測方法、試劑盒及其應用
【專利摘要】本申請公開了JC病毒的檢測方法,包括如下步驟：采用磁珠法從人類尿液樣本提取JCV DNA，獲得待測樣本；PCR擴增反應；采用熒光定量PCR儀檢測反應結果，熒光信號收集時設定為Taqman熒光探針JCV?FP5’端熒光基團對應的熒光素，在60℃收集熒光信號。本申請還提供一種檢測JC病毒的試劑盒。本發明的檢測方法敏感性高，最低檢出可達到500copies/mL；同時，本發明的檢測方法的特異性很好，不和其他的病毒發生交叉反應，例如BK病毒(BKV)，丙肝病毒(HCV)，人巨細胞病毒(HCMV)，和乙型肝炎病毒(HBV)。
【專利說明】
JC病毒的檢測方法、試劑盒及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種病毒的檢測方法、試劑盒及其應用，具體講，設及JC病毒的檢測方 法、試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] JC病毒屬乳多空病毒科多瘤病毒種人類多瘤病毒分支，與人類多瘤病毒SV40(恒 河猴病毒)和JC病毒基因組的大小結構及DNA序列非常類似，沒有包膜，外被衣殼蛋白，內含 一環狀的小雙鏈DNA。
[0003] JC病毒(JCV)是一種機會感染性病原，正常人群中血清學陽性率高達80% W上。 JCV可通過分娩(胎盤）、哺乳或長期共同生活接觸從母親傳播給子女，也可通過呼吸道、消 化道傳播。感染后多W潛伏狀態存在，當宿主免疫功能低下時可重新激活。JCV具有明顯的 嗜神經性特點，嚴重免疫抑制患者感染JCV后可引起進行性多灶性腦白質病(PML)。
[0004] JCV也可致腎移植患者的多瘤病毒相關性腎病(PVAN)。器官移植后，免疫抑制劑的 使用是誘導多瘤病毒激活復制的重要原因，其中，40% W上的腎移植患者可檢測到JCV的復 制。PVAN被認為是影響腎移植手術成功與否最關鍵的因素之一，因此通過監測腎移植患者 體內的JCV載量，可用于腎移植術后JCV感染的的早期診斷，對預防JCV感染造成的多瘤病毒 相關性腎病(PVAN)和進行性多灶性腦白質病(PML)具有一定意義。
[0005] 運用電鏡、病毒分離、抗原檢測和PCR等技術診斷多瘤病毒感染很容易，其中定量 PCR技術可檢測出病毒載量。國外研究認為，利用聚合酶鏈式反應(PCR)對尿液、血液或腦脊 液特異性地檢測JCV DNA是PVAN或PML早期診斷及預測的最佳方法。PCR技術檢測方法的靈 敏度為75%，特異度高達96%。巧光定量pa?比常規PCR具有更高的靈敏度、特異性，操作更 加快速、方便，同時可W區分JCV與服V的感染，是用于JCV DNA檢測的理想手段。
[0006] 巧光定量PCR技術是一種集PCR技術、巧光信號檢測和數據分析于一體的核酸定量 檢測技術。巧光定量PCR使用了特異性探針，能夠對祀序列進行特異性的識別，具有引物探 針雙重控制，在擴增指數期進行定量，具有很高的特異性、靈敏性，準確性及假陽性率低等 特點。
[0007] 由于巧光PCR法不受生物個體因素影響，具有高度靈敏度、特異性，具有簡單、快 速、易于自動化等優點，可W進行單個或成批樣品的檢測，適合基層單位的推廣，因而非常 有希望成為JCV DNA的常規檢測方法，從而用于JC病毒相關性疾病的預測及治療監測。
[000引本產品采用實時巧光定量PCR技術，用于定量檢測人類晨尿樣本中的JC病毒DNA。 WJC病毒保守基因序列為檢測目的片段，該檢測不得作為患者病情單獨的評價指標，必須 結合臨床表現和其他實驗室檢測指標對患者病情進行評價，還可通過對患者JCV DNA水平 和變化情況的監測，用于評估抗病毒治療的應答和治療效果監測。
[0009] 目前，國內外臨床應用JC病毒巧光定量PCR主要如下：
[0010] 1.核酸提取方法:磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法。
[0011] 2.定量標準品：大多數標準品不參與核酸提取，不能全面真實反映核酸提取和擴 增，不能對待測樣本進行準確定標。
[0012] 3.陽性質控品和臨界陽性質控品：大多數定量檢測試劑盒未設置陽性質控品和臨 界陽性質控品，不能很好監控核酸提取與擴增。
[0013] 使用本發明中的JC病毒核酸測定試劑盒(PCR-巧光探針法），使用磁珠提取方法， 可W有效進行核酸提取，在本發明中，我們使用的定量標準品、陽性質控品及臨界陽性質控 品均來源于滅活陽性尿液樣本，可W與待測樣本同時進行提取與擴增，從而可W全程監控 樣本提取與擴增，從而對待測樣本進行準確定標。
【發明內容】
[0014] 本申請解決的主要問題是提供一種JC病毒的檢測方法及試劑盒，W解決無法實現 的技術問題。
[0015] 為了解決上述技術問題，本發明公開了 JC病毒的檢測方法，包括如下步驟：
[0016] 待測樣本獲取：
[0017] 采用磁珠法從人類尿液樣本提取JCV DNA，獲得待測樣本；
[001引 PCR擴增反應：
[0019] 將提取的JCV DNA加到PCR反應混合液中，進行PCR擴增；
[0020] 所述PCR反應混合液，包括:PCR反應液、JCV引物探針混合液，
[0021] 所述JCV引物探針混合液，包括，上游引物:JCV-F，下游引物:JCV-R，Taqman巧光探 針JCV-FP，純化水；
[0022] 所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID N0:1所示的堿基序列；
[0023] 所述下游引物1〇^?包含如569 10^:2所示的堿基序列；
[0024] 所述化qman巧光探針JCV-FP包含如SEQ ID ^):3所示的堿基序列，所述化9111曰11巧 光探針JCV-FP5 '端有巧光報告基團，3 '端有巧光澤滅基團；
[0025] 結果檢測：
[0026] 采用巧光定量PCR儀檢測反應結果，巧光信號收集時設定為化qman巧光探針JCV- FP5'端巧光基團對應的巧光素，在6(TC收集巧光信號。
[0027] 進一步地，所述PCR擴增反應的條件為:37°C，2min; 95°C，3min;然后，94°C，10s，60 °C，35s，10個循環;然后，94°C，10s，60 °C，35s，35個循環；25 °C，Imin。
[0028] 進一步地，所述JCV引物探針混合液，還包括：內標上游引物，內標下游引物，內標 探針。
[0029] 進一步地，所述PCR擴增反應，還包括:平行設置JCV陰性質控品、JCV陽性質控品、 JCV臨界陽性質控品和JCV定量標準品I~IV反應組，所述JCV陰性質控品為無菌生理鹽水； 所述JCV臨界陽性質控品為濃度1.0X104copies/mL的JCV陽性尿液樣本;JCV陽性質控品為 濃度1.0 X 106copies/mL的JCV陽性尿液樣本;JCV定量標準品I~IV，包括JCV定量標準品I、 JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。
[0030]進一步地，所述的化qman巧光探針的巧光報告基團選自6-簇基巧光素、六氯-6-甲 基巧光素、VIC巧光染料、四氯-6-簇基巧光素、簇基-X-羅丹明、6-簇基四甲基羅丹明、橫酷 羅丹明、6-簇基-4'，5-二氯-2'，7'-二甲氧基巧光素班巧酷亞胺醋、花菁3、花菁5或花菁5.5 中的至少一種;所述巧光澤滅基團選自6-簇基四甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基） 苯甲酸、黑桐澤滅劑1、黑桐澤滅劑2或黑桐澤滅劑3中的至少一種。
[0031] 進一步地，所述PCR反應液，包括UDG酶防污染體系，所述UDG酶防污染體系，包括： UDG酶及加 TP。
[0032] 本申請還提供檢測JC病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的上游引 物:JCV-F，下游引物:JCV-R，Taqman巧光探針JCV-FP，
[0033] 所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID N0:1所示的堿基序列；
[0034] 所述下游引物1〇^?包含如569 10^:2所示的堿基序列；
[0(X3日]所述化9111曰11巧光探針1〇^斗?包含如569 10^:3所示的堿基序列。
[0036] 進一步地，該試劑盒還包括：內標上游引物、內標下游引物、內標探針、JCV陰性質 控品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品和JCV定量標準品I~IV，其中JCV陰性質控品無 菌生理鹽水，JCV定量標準品I~IV的待測模板分別為JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、 JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。
[0037] 進一步地，其特征在于，所述試劑盒包括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脫液、磁珠、蛋 白酶K、助沉劑、JCV引物探針混合液、PCR反應液、JCV定量標準品、JCV陽性質控品、JCV臨界 陽性質捏品、JCV陰性質捏品、JCV內柄質捏品，各組分含量為：
[00；3 引
[0039] 本申請提供的檢測JC病毒的試劑盒，用于JC病毒的檢測。
[0040] 與現有技術相比，本發明所述的JC病毒的檢測方法、試劑盒，達到了如下效果：
[0041] 1.本發明中磁珠法實現了人類尿液樣本中JCV提取操作，磁珠法有效快速的提取 了樣本DNA。
[0042] 2本發明中所設及的試劑盒中設置陽性質控品、臨界陽性質控品、定量標準品均為 尿液樣本，參與核酸提取及擴增，全面真實反映待測樣本核酸提取和擴增，對待測樣本進行 準確定標。
[0043] 3.本發明使用尿巧酶(UDG)防污染體系，經加熱可W選擇性地降解U-DNA，則方止 先前PCR擴增產物的污染。
[0044] 4.本發明采用內標質控體系，內標參與樣本提取與擴增，用于監測反應體系可能 存在的抑制因素。內標模板與祀基因無同源性，內標探針選擇的是與祀基因探針沒有沖突 的另一檢測通道。
[0045] 5.本發明的檢測方法敏感性高，最低檢出可達到500copies/mM同時，本發明的檢 測方法的特異性很好，不和其他的病毒發生交叉反應，例如BK病毒(BKV)，丙肝病毒化CV)， 人巨細胞病毒化CMV)，和乙型肝炎病毒化BV);
[0046] 6.本發明的檢測方法反應快速，一般1.5到2小時即可得到檢測結果，并且成本低， 適合于大規模臨床開展。從而實現對JC病毒的快速、有效且準確的定量檢測，因而能保證及 時的病例診治及治療效果監測。
【附圖說明】
[0047] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0048] 圖1是本發明實施例2所述JC病毒定性檢測結果圖；
[0049] 圖2是本發明實施例3所述JC病毒定量檢測標準品檢測結果圖；
[0050] 圖3是本發明實施例3所述JC病毒定量檢測標準品和待測樣品檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0051] 如在說明書及權利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定組件。本領域技術人員應 可理解，硬件制造商可能會用不同名詞來稱呼同一個組件。本說明書及權利要求并不W名 稱的差異來作為區分組件的方式，而是W組件在功能上的差異來作為區分的準則。如在通 篇說明書及權利要求當中所提及的"包含"為一開放式用語，故應解釋成"包含但不限定 于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內，本領域技術人員能夠在一定誤差范圍內解決所述 技術問題，基本達到所述技術效果。說明書后續描述為實施本申請的較佳實施方式，然所述 描述乃W說明本申請的一般原則為目的，并非用W限定本申請的范圍。本申請的保護范圍 當視所附權利要求所界定者為準。
[0052] W下結合附圖對本申請作進一步詳細說明，但不作為對本申請的限定。下文為了 敘述方便，下文中所稱的％""右上""下"等與附圖本身左、右、上、下等方向一致。
[0化3]實施例1
[0054] 本實施例提供待測樣本獲取的方法：
[0055] 采用磁珠法從人類尿液樣本提取JCV DNA，獲得待測樣本。磁珠法提取核酸使用獨 特的裂解液和蛋白酶K迅速裂解細胞并滅活細胞內核酸酶，然后基因組DNA選擇性吸附于磁 珠，再通過一系列快速的漂洗-分離的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等 雜質去除，最后用雙蒸水即可將純凈基因組DNA從磁珠上洗脫。
[0056] 1、磁珠法從人類尿液樣本提取JCV DNA所用試劑及成分
[0化7] (1)裂解液：100血用量為例，鹽酸脈40.47g、S (徑甲基)氨基甲燒0.5132g、氯化鋼 0.0932g、吐溫-20 6.78mL，加入16mL純水，于恒溫加熱磁力攬拌器中約70°C加熱攬拌至完 全溶解，泡沫消除后定容至lOOmL后，鹽酸調節至抑7.0。
[0058] 此外，關于裂解液配制成分中鹽酸脈可替換成異硫氯酸脈、=(徑甲基）氨基甲燒 可替換成=巧圣甲基)氨基甲燒鹽酸鹽、吐溫-20可替換成曲拉通100。
[0059] (2)洗液1:100血用量為例，^巧圣甲基)氨基甲燒鹽酸鹽0.5731g、乙二胺四乙酸二 鋼0.1353g，加入純水約80mL，溶解后純水定容至終體積lOOmL后，NaOH溶液調節液體pH至 6.5。
[0060] 此外，關于洗液1配制成分可=巧圣甲基)氨基甲燒鹽酸鹽可替換成=巧圣甲基)氨 基甲燒，乙二胺四乙酸二鋼可替換成乙二胺四乙酸。
[0061] (3)洗液2:純水。
[0062] (4)洗脫液：1001111^用量為例，^(徑甲基）氨基甲燒0.1211邑，10.001111^011^￡01八， 70mL純水，溶解均勻，鹽酸調節為P冊.5，定容。
[0063] (5)磁珠:購買商品化磁珠。
[0064] (6)蛋白酶K:將購買商品化蛋白酶K稀釋至20mg/mL。
[0065] (7)助沉劑:將購買商品化助沉劑。
[0066] 2、采用磁珠法從人類尿液樣本提取JCV DNA具體方法如下：
[0067] ①使用前向裂解液中加入2.4mL異丙醇，向洗液1中加入5.4mL乙醇，洗液2中加入 8.4mL乙醇，搖勻后若裂解液中有不溶物，請于70°C下溫育至溶解，冷卻后即可使用。
[006引②將尿液送檢管振蕩15s，徹底混勻后立即取ImL至1.5mL離屯、管中（若樣本不足 1血，請用生理鹽水稀釋一定倍數后移取ImL)，13000rpm離屯、lOmin后小屯、棄去上清(可殘余 1化L左右液體W免移棄目的物），注意避免觸碰離屯、管底。
[0069] 另外，對于JCV陰性質控品、JCV臨界陽性質控品、JCV陽性質控品及定量標準品I- IV按如下處理：融化并振蕩混勻后取200uL各加到1.5mL離屯、管中，補加生理鹽水至ImL， 13000巧m離屯、lOmin后小屯、棄去上清。
[0070] ③向離屯、管內加入10化蛋白酶K、化L助沉劑、300化裂解液，2化L磁珠(每次吸取前 需顛倒或使用移液器吹吸混勻磁珠），扣L內標質控品，縱滿振蕩混勻各離屯、管10s，于室溫 輕柔顛倒混勻lOmin，使磁珠和核酸充分結合。
[0071] ④將離屯、管放在磁分離架上，反復顛倒磁分離架將離屯、管蓋上的磁珠沖洗下來， 靜置Imin后棄去上清液。
[0072] ⑤加入5(K)化洗液1，縱滿振蕩3~5s使磁珠重新懸浮，然后置于磁分離架上，反復 顛倒磁分離架將離屯、管蓋上的磁珠沖洗下來，靜置Imin后棄去上清液。
[0073] ⑥加入5(K)化洗液2,縱滿振蕩3~5s使磁珠重新懸浮，然后置于磁分離架上，反復 顛倒磁分離架將離屯、管蓋上的磁珠沖洗下來，靜置Imin后棄去上清液，并盡量吸棄管底殘 余液體，驚干5min。
[0074] ⑦加入50化洗脫液，用移液槍緩慢吹打管壁上的磁珠使之浸于洗脫液中，55°C溫 育5min，期間輕輕晃動溶液兩次。
[0075] ⑧將離屯、管置于磁分離架上靜置Imin，磁分離后及時將上清液轉移至新的無核酸 酶離屯、管中，此上清即為提取到JCV DNA，即待測樣本。
[0076] 實施例2
[0077] JC病毒的定性檢測
[0078] 本實施例2提供一種JC病毒的定性檢測方法：
[0079] 1、JCV DNA的PCR擴增反應
[0080] 1)JCV DNA的PCR擴增反應所用試劑及成分
[0081] (l)JCV引物探針混合液：
[0082] JCV引物探針混合液具體組成成分為：上游引物:JCV-F(5化M)0.化L，下游引物： JCV-R( 50yM) 0.化L，legman 巧光探針 JCV-FP( 20yM) 0. ，純化水 3.化L。
[0083] 優選JCV引物探針混合液的組分為:上游引物JCV-F( 50iiM) 0.6化，下游引物JCV-R (50iiM)0.化L，hginan巧光探針JCV-FP(20iiM)0.扣L，內標上游引物（20iiM)0.扣L，內標下游 引物(20yM)0.^L，內標探針（1化]\〇0.37化1^，純化水1.92化1^。
[0084] 所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID N0:1所示的堿基序列；
[0085] 所述下游引物1〇^?包含如569 10^:2所示的堿基序列；
[0086] 所述化qman巧光探針JCV-FP包含如SEQ ID ^):3所示的堿基序列，所述化9111曰11巧 光探針JCV-FP 5'端有巧光報告基團，3'端有巧光澤滅基團。
[0087] 所述的Taqman巧光探針JCV-FP的巧光報告基團選自6-簇基巧光素（6- carbo巧'111〇'63。6111，6斗41)、六氯-6-甲基巧光素、￥1(：巧光染料、四氯-6-簇基巧光素、簇 基-X-羅丹明、6-簇基四甲基羅丹明、橫酷羅丹明、6-簇基-4 '，5-二氯-2 '，7 二甲氧基巧光 素班巧酷亞胺醋、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一種;所述巧光澤滅基團選自6-簇基四 甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基）苯甲酸、黑桐澤滅劑l(Black Hole Quencher 1， B冊1)、黑桐澤滅劑2或黑桐澤滅劑3中的至少一種；
[0088] 優選的，當巧光澤滅基團選自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸時，巧光報告基 團選自6-簇基巧光素、四氯-6-簇基巧光素、6-簇基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基巧光素班 巧酷亞胺醋、六氯-6-甲基巧光素、花菁3中的至少一種；
[0089] 當巧光澤滅基團選自6-簇基四甲基羅丹明時，巧光報告基團選自6-簇基巧光素、 四氯-6-簇基巧光素、6-簇基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基巧光素班巧酷亞胺醋或六氯-6- 甲基巧光素中的至少一種；
[0090] 當巧光澤滅基團選自黑桐澤滅劑1時，巧光報告基團選自6-簇基巧光素、四氯-6- 簇基巧光素、6-簇基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基巧光素班巧酷亞胺醋、六氯-6-甲基巧光 素或花菁3中的至少一種；
[0091] 當巧光澤滅基團選自黑桐澤滅劑2時，巧光報告基團選自6-簇基四甲基羅丹明、花 菁3、簇基-X-羅丹明或橫酷羅丹明中的至少一種；
[0092] 當巧光澤滅基團選自黑桐澤滅劑3時，巧光報告基團選自花菁5或花菁5.5中的一 種。
[0093] 最優選的，所述巧光報告基團為6-FAM;所述巧光澤滅基團為B冊1。
[0094] (2)PCR 反應液：
[00 巧]PCR反應液組成為：10Xreaction buffer 扣L，10mM dNTP Mix 4 化，Taq DNA Polymerasel.2]iL，UDG 0.2]iL，10mM 加 TP化L，純化水 13.6化。
[0096] 2)JCV DM(待測樣本)PCR反應
[0097] (1)按W下比例進行JCV PCR反應混合液配制與加樣:PCR反應液25化，JCV引物探 針混合液扣L加到PCR管中，振蕩混勻，將提取好的待測樣本20化加到上述PCR管中，進行PCR 擴增。
[009引（2)PCR反應的反應條件設置為：37°C，2min; 95°C，3min;然后，94°C，10s，60°C， 35s，10個循環;然后，94°C，10s，60°C，35s(巧光收集），35個循環;25°C，Imin。
[0099] 2、PCR反應結果判讀(JC病毒的定性檢測結果分析）
[0100] 本實施例2采用最優方案，即JCV引物探針混合液含內標，所述Taqman巧光探針 JCV-FP的巧光報告基團為6-FAM;巧光澤滅基團為B冊1。
[0101] 本實施例2采用AB 口 500巧光定量PCR儀，巧光信號收集時設定為對應巧光素，本實 施例設定為FAM、VIC巧光素，巧光信號收集設在60°C。
[0102] JCV引物探針混合液有無內標，不影響待檢樣品通道曲線的響應，即JC病毒檢出為 陽性時，待檢樣品對應通道會出現S型曲線;JC病毒檢出為陰性時，待檢樣品對應通道不出 現S型曲線。
[0103] 本實施2采用JCV引物探針混合液含內標，所述化qman巧光探針JCV-FP的巧光報告 基團為6-FAM;巧光澤滅基團為B冊1的方案，因此檢測結果會包含內標通道曲線：
[0104] 如果內標通道出現S型曲線，同時FAM通道檢測無 S型曲線，判定為JCV陰性;如果內 標通道出現S型曲線，同時FAM通道檢測有S型曲線，判定為JCV陽性。利用上述方法對14例JC 病毒尿液樣本、5例健康人尿液樣本，2例丙肝病毒化CV)血液樣本、2例JC病毒尿液樣本、2例 人巨細胞病毒化CMV)血液樣本，共計25份臨床樣本進行檢測，結果如圖1所示：
[0105] 其中，14例檢測均為陽性，表現為：內標通道出現S型曲線，同時FAM通道檢測有S型 曲線健康人尿液樣本，丙肝病毒化CV)，人巨細胞病毒化CMV)，JC病毒(JCV)檢測均為陰性， 表現為：內標通道出現S型曲線，同時FAM通道檢測無 S型曲線。
[0106] 本實施例2采用內標質控體系，內標參與樣本提取與擴增，用于監測反應體系可能 存在的抑制因素。內標模板與祀基因無同源性，內標探針選擇的是與祀基因探針沒有沖突 的另一檢測通道。
[0107] 實施例3
[0108] 本實施例2提供一種JC病毒的定量檢測方法：
[0109] 1、JCV DNA的PCR擴增反應
[0110] 1)JCV DNA的PCR擴增反應所用試劑及成分
[0111] (l)JCV引物探針混合液：
[011 ^ JCV引物探針混合液的組分為:上游引物:JCV-F (50山0 0.6化，下游引物:JCV-R巧0 咖)0.6化，Taqman巧光探針JCV-FP(20山00.5化，內標上游引物（20山00.5化，內標下游引物 (20咖)0.5化，內標探針（1化M)0.37扣L，純化水1.92扣L。所述所述上游引物JCV-F包含如 SEQ ID NO: 1所示的堿基序列；
[0113] 所述下游引物1〇^?包含如569 10^:2所示的堿基序列；
[0114] 所述化〇111311巧光探針1〇^斗?包含如569 10^:3所示的堿基序列，所述巧光報告 基團為6-FAM;所述巧光澤滅基團為B冊1。
[011引 （2)PCR反應液：
[0116] PCR反應液組成為：10Xreaction buffer 扣L，10mM dNTP Mix 4 化，Taq DNA Polymerasel.2]iL，UDG 0.2]iL，10mM 加 TP化L，純化水 13.6化。
[0117] (3)JCV定量標準品：
[0118] 定量標準品均為生理鹽水稀釋后尿液樣本，濃度分別為:JCV定量標準品1(2.5X l〇8copies/mL)、JCV定量標準品 n ( 2.5 X lO^copies/mL)、JCV定量標準品虹（2.5 X l〇6copies/mL)、JCV定量標準品IV(2.5 X l〇5copies/血）。
[0119] (4) JCV陽性質控品：
[0120] JCV陽性質控品為生理鹽水稀釋后尿液樣本，濃度為2.5X106copies/mL。
[0121] (5)JCV臨界陽性質控品
[0122] JCV臨界陽性質控品為生理鹽水稀釋后尿液樣本，濃度為1 X 104copies/mL。
[0123] (6) JCV陰性質控品：
[0124] JCV陰性質控品為滅菌生理鹽水。
[0125] (7)JCV內標質控品：
[01%] JCV內標質控品為體外構建的重組質粒。
[0127] 2)JCV DNA(待測樣本)PCR反應
[012引 （1)按W下比例進行JCV DNA PCR反應混合液配制與加樣:PCR反應液25化X(n巧： 四個定量標準品和一個JCV陰性質控品、一個JCV臨界陽性質控品、一個JCV陽性質控品），每 管加 JCV引物探針混合液扣レ振蕩混勻，每份30化分至PCR管中，將提取好的待測樣本(該待 巧附本為定性檢測為陽性的樣本)及質控品20化加到上述PCR管中，進行PCR擴增。
[0129] (2)設置 PCR 擴增反應條件:37°(：，2111111;95°(：，3111111;然后，941：，1〇3,60°(：，353，10 個循環;然后，94°C，10s，60°C，35s談光收集），35個循環;25°C，Imin。
[0130] 2、PCR反應結果判讀(JC病毒的定量檢測結果分析）
[0131] 采用AB 口 500巧光定量PCR儀，巧光信號收集時設定為FAM巧光素，巧光信號收集設 在 60°C。
[0132] 結果判斷：
[0133] (1)如果內標通道沒有出現S型曲線，檢測結果無效，應重新檢測。高濃度樣本(Ct 值《10)，由于競爭抑制，內標通道無 S型曲線屬于正常情況。
[0134] (2)如果內標通道出現S型曲線，同時FAM通道檢測無 S型曲線，則檢測報告為"低于 試劑盒最低檢出限（500copies/mLr。
[0135] (3)如果內標通道出現S型曲線，同時FAM通道檢測有S型曲線，則有如下解釋：
[0136] (4)如果待檢樣本測定值顯示<500copies/mL，則報告為"低于試劑盒最低檢出限 (500copies/mL)"。
[0137] (5)測定值在5 X l〇2copies/mL~1 X l〇3copies/mL之間的樣本，直接報告數值，并 注明"供參考"。
[013引 （6)測定值在1 X 103copies/mL~1 X 109copies/mL之間的樣本，直接報告所測定的 數值；
[0139] (7)測定值> 1 X l〇9copies/mL的樣本，則報告為"高于1.0 X l〇9copies/ml；'，如果 需要精確定量結果，可將樣本用陰性質控品稀釋至線性范圍后重新測定，并根據下面公式 計算樣本濃度，結果注明為可報告數值。
[0140] 可報告數值(最終樣本濃度）=稀釋后濃度X稀釋倍數
[0141] 稀釋倍數=(樣本量+稀釋液量)/樣本量。
[0142] 利用JCV定量標準品檢測所生成的標準曲線計算待測樣本的濃度(copies/mL)。檢 測反應時，將標準品按如下賦值，JCV定量標準品I(5X107copies/mL)、JCV定量標準品n (5 X l〇6copies/mL)、JCV定量標準品虹巧 X l〇5copies/mL)、JCV定量標準品IV(5 X l〇4copies/ mU與樣品同時檢測，如圖2為定量標準品擴增曲線，圖3為標準品與待測樣本擴增曲線。根 據定量標準品濃度與檢測結果Ct值，系統自動生成一條標準曲線。根據待測樣品的檢測Ct 值，可計算出樣品中祀基因的濃度。
[0143] 利用上述方法對6例JC病毒尿液樣本進行定量檢測，通過計算機生成的標準曲線。 計算圖3中6個待測樣本(如圖3所示，除4個標準品曲線外的6個曲線為待測樣本曲線)從左 至右濃度分別為:尿液樣本分別:3.4 X l〇8copies/mL、5 X l〇5copies/mL、6 X l〇3copies/mL、 4X l〇3copies/血、3 X l〇5copies/血、5 X l〇2copies/mL。
[0144] 結果驗證:將檢測陽性的擴增產物進行基因測序，測序結果經BLAST比對后證實為 JC病毒基因序列。
[0145] 實施例4
[0146] 本實施例4提供一種檢測JC病毒的試劑盒。
[0147] 檢測JC病毒的試劑盒，包括：上游引物JCV-F，下游引物JCV-R，Taqman巧光探針 JCV-FP，
[0148] 所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID N0:1所示的堿基序列；
[0149] 所述下游引物1〇^?包含如569 10^:2所示的堿基序列；
[0150] 所述化9111曰11巧光探針1〇^斗?包含如569 10^:3所示的堿基序列。
[0151] 優選的，該試劑盒還包括：內標上游引物、內標下游引物、內標探針。內標質控體系 參與提取與擴增。用于監測反應體系可能存在的抑制因素。內標模板與祀基因無同源性，內 標探針選擇的是與祀基因探針沒有沖突的另一檢測通道。
[0152] 優選的，該試劑盒，還包括:JCV陰性質控品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品 和JCV定量標準品I~IV，其中JCV陰性質控品無菌生理鹽水，JCV定量標準品I~IV的待測模 板分別為JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。
[0153] 優選的，JCV定量標準品I~IV、JCV臨界陽性質控品、JCV陽性質控品的構建方法包 括W下步驟：
[0154] (1)提取臨床尿液樣本，經定量后選取高濃度尿液樣本；
[01W] (2)使用滅菌后生理鹽水將所定量高濃度尿液樣本進行稀釋，稀釋成4個梯度2.5 X 108~2.5 X 105copies/mL，分別作為試劑盒的JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定 量標準品III、JCV定量標準品IV，另分別稀釋至2.5 X 106copies/mL和1 X 104copies/mL作為 試劑盒的JCV陽性質控品和JCV臨界陽性質控品。
[0156] 優選的，該試劑盒，包括:裂解液、洗液1、洗液2、洗脫液、磁珠、蛋白酶K、助沉劑、 JCV引物探針混合液、PCR反應液、JCV定量標準品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品、JCV 陰性質巧品、JCV內柄;質巧品。
[0157] 優選的，各組分組成及制造方法為：
[015引（1)裂解液：100血用量為例，鹽酸脈40.47g、S(^甲基)氨基甲燒0.5132g、氯化鋼 0.0932g、吐溫-20 6.78mL，加入16mL純水，于恒溫加熱磁力攬拌器中約70°C加熱攬拌至完 全溶解，泡沫消除后定容至lOOmL后，鹽酸調節至抑7.0。分裝量為4.8mL/瓶。
[0159] 此外，關于裂解液配制成分中鹽酸脈可替換成異硫氯酸脈、=(徑甲基)氨基甲燒 可替換成=巧圣甲基)氨基甲燒鹽酸鹽、吐溫-20可替換成曲拉通100。
[0160] (2)洗液1:100血用量為例，^巧圣甲基)氨基甲燒鹽酸鹽0.5731g、乙二胺四乙酸二 鋼0.1353g，加入純水約80mL，溶解后純水定容至終體積lOOmL后，NaOH溶液調節液體pH至 6.5。分裝量為6.6mL/瓶。
[0161] 此外，關于洗液1配制成分可=巧圣甲基)氨基甲燒鹽酸鹽可替換成=巧圣甲基)氨 基甲燒，乙二胺四乙酸二鋼可替換成乙二胺四乙酸。
[0162] (3)洗液2:純水。分裝量為3.6mL/瓶。
[0163] (4)洗脫液：1001111^用量為例，^(徑甲基）氨基甲燒0.1211邑，10.001111^011^￡01八， 70mL純水，溶解均勻，鹽酸調節為抑8.5，定容。分裝量為1200化/管。
[0164] (5)磁珠:購買商品化磁珠直接分裝。分裝量為48化L/管。
[0165] (6)蛋白酶K:將購買商品化蛋白酶K稀釋至20mg/mL直接分裝。分裝量為24化L/管。
[0166] (7)助沉劑:將購買商品化助沉劑直接分裝。分裝量為19化L/管。
[0167] (8) JCV引物探針混合液:JCV引物探針混合液具體組成成分為:上游引物JCV-F巧0 咖)0.6化，下游引物JCV-R (50咖)0.6化，Taqman巧光探針JCV-FP (20山1) 0.5化，內標上游引 物（20咖)0.5化，內標下游引物（20咖)0.5化，內標探針（10咖)0.37扣L，純化水1.92化L。分 裝量為120化/管。
[0168] (9)PCR反應液：PCR反應液組成為：10 X reaction buff e巧化，lOmM dNTP Mix 化 L，Taq DNA Polymerasel.2化，UDG 0.化L，10mM 加 TP化L，純化水 13.6化。分裝量為600化/ 管。本發明含有UDG酶防污染體系。
[0169] 為了防止污染，本發明含有UDG酶防污染體系。特選取含UDG酶及加 TP的體系，其作 用原理為:在PCR反應中W加 TP替代dTTP滲入DNA中，就會形成含加 TP堿基的PCR擴增產物， 而UDG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U基的糖巧鍵，從而降解該PCR擴增產物。
[0170] (lO)JCV定量標準品：定量標準品均為生理鹽水稀釋后尿液樣本，濃度分別為:JCV 定量標準品1(2.5 X l〇8copies/mL)、JCV定量標準品n (2.5 X lO^copies/血）、JCV定量標準 品虹（2.5 X l〇6c〇pies/mL)、JCV定量標準品IV(2.5 X l〇5copies/mL)。分裝量為600化/管。
[0171] (ll)JCV陽性質控品：JCV陽性質控品為生理鹽水稀釋后尿液樣本，濃度為2.5 X 106copies/mL。分裝量為600化/管。
[0172] (12)JCV臨界陽性質控品：JCV臨界陽性質控品為生理鹽水稀釋后尿液樣本，濃度 為1 X 104copies/mL。分裝量為600化/管。
[0173] (13)JCV陰性質控品:JCV陰性質控品為滅菌生理鹽水。分裝量為60化L/管。
[0174] (14)JCV內標質控品:JCV內標質控品為體外構建的重組質粒。分裝量為13化L/管。
[0175] 優選的，該試劑盒組成為，裂解液、洗液1、洗液2、洗脫液、磁珠、蛋白酶K、助沉劑、 JCV引物探針混合液、PCR反應液、JCV定量標準品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品、JCV 陰性質巧品、JCV內柄;質巧品，各組分含量為：
[0176；
上述檢測JC病毒的試劑盒，應用于JC病毒的檢測。該檢測可W為定性檢測和/或定量檢測。
[0177； 0178 0179 0180 0181 * 0183
[0179] 與現有技術相比，本發明所述的JC病毒的檢測方法、試劑盒，達到了如下效果：
[0180] 2.本發明中磁珠法實現了人類尿液樣本中JCV提取操作，磁珠法有效快速的提取 了樣本DNA。
[0181] 2本發明中所設及的試劑盒中設置陽性質控品、臨界陽性質控品、定量標準品均為 尿液樣本，參與核酸提取及擴增，全面真實反映待測樣本核酸提取和擴增，對待測樣本進行 準確定標。
[01劇 5.本發明使用尿巧酶(UDG)防污染體系，經加熱可W選擇性地降解U-DNA，則方止 先前PCR擴增產物的污染。
[0183] 6.本發明采用內標質控體系，內標參與樣本提取與擴增，用于監測反應體系可能 存在的抑制因素。內標模板與祀基因無同源性，內標探針選擇的是與祀基因探針沒有沖突 的另一檢測通道。
[0184] 5.本發明的檢測方法敏感性高，最低檢出可達到500copies/mM同時，本發明的檢 測方法的特異性很好，不和其他的病毒發生交叉反應，例如BK病毒(BKV)，丙肝病毒化CV)， 人巨細胞病毒化CMV)，和乙型肝炎病毒化BV);
[0185] 6.本發明的檢測方法反應快速，一般1.5到2小時即可得到檢測結果，并且成本低， 適合于大規模臨床開展。從而實現對JC病毒的快速、有效且準確的定量檢測，因而能保證及 時的病例診治及治療效果監測。
[0186] 由于方法部分已經對本申請實施例進行了詳細描述，運里對實施例中設及的系統 與方法對應部分的展開描述省略，不再寶述。對于系統中具體內容的描述可參考方法實施 例的內容，運里不再具體限定。
[0187] 上述說明示出并描述了本申請的若干優選實施例，但如前所述，應當理解本申請 并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環境，并能夠在本文所述申請構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識 進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離本申請的精神和范圍，則都應在本申 請所附權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. JC病毒的檢測方法，包括如下步驟： 待測樣本獲取： 采用磁珠法從人類尿液樣本提取JCV DNA，獲得待測樣本； PCR擴增反應： 將提取的JCV DNA加到PCR反應混合液中，進行PCR擴增； 所述PCR反應混合液，包括:PCR反應液、JCV引物探針混合液， 所述JCV引物探針混合液，包括，上游引物:JCV-F，下游引物：JCV-R，Taqman熒光探針 JCV-FP，純化水； 所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID N0:1所示的堿基序列； 所述下游引物兀￥-1?包含如3￡〇10勵:2所示的堿基序列； 所述Taqman熒光探針JCV-FP包含如SEQ ID NO: 3所示的堿基序列，所述Taqman熒光探 針JCV-FP5 '端有熒光報告基團，3 '端有熒光淬滅基團； 結果檢測： 采用熒光定量PCR儀檢測反應結果，熒光信號收集時設定為Taqman熒光探針JCV-FP5' 端熒光基團對應的熒光素，在60°C收集熒光信號。2. 根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增反應的條件為： 37°(：，21^11;95°(：，3111111 ;然后，94°(：，108,60°(：，358，10個循環；然后，94°(：，108,60°(：，358,35 個循環；25°C，lmin。3. 根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述JCV引物探針混合液，還 包括：內標上游引物，內標下游引物，內標探針。4. 根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增反應，還包括： 平行設置JCV陰性質控品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品和JCV定量標準品I~IV反應 組，所述JCV陰性質控品為無菌生理鹽水;所述JCV臨界陽性質控品為濃度1.0X10 4c〇Pies/ mL的JCV陽性尿液樣本;JCV陽性質控品為濃度1.0 X 106c〇p i e s/mL的JCV陽性尿液樣本;JCV 定量標準品I~IV，包括JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標 準品IV。5. 根據權利要求1所述JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述的Taqman熒光探針的熒光 報告基團選自6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧 基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4 '，5-二氯-2 '，7 二甲氧基熒光 素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一種;所述熒光淬滅基團選自6-羧基四 甲基羅丹明、4-(4_二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬滅劑1、黑洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑 3中的至少一種。6. 根據權利要求1所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應液，包括UDG酶 防污染體系，所述UDG酶防污染體系，包括:UDG酶及dUTP。7. 檢測JC病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的上游引物:JCV-F，下游引 物:JCV-R，Taqman 熒光探針 JCV-FP， 所述上游引物JCV-F包含如SEQ ID N0:1所示的堿基序列； 所述下游引物兀￥-1?包含如3￡〇10勵:2所示的堿基序列； 所述Taqman熒光探針JCV-FP包含如SEQ ID NO:3所示的堿基序列。8. 根據權利要求7所述的檢測JC病毒的試劑盒，其特征在于，還包括：內標上游引物、內 標下游引物、內標探針、JCV陰性質控品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品和JCV定量標 準品I~IV，其中JCV陰性質控品無菌生理鹽水，JCV定量標準品I~IV的待測模板分別為JCV 定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。9. 根據權利要7或8任一項所述的檢測JC病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： 裂解液、洗液1、洗液2、洗脫液、磁珠、蛋白酶K、助沉劑、JCV引物探針混合液、PCR反應液、JCV 定量標準品、JCV陽性質控品、JCV臨界陽性質控品、JCV陰性質控品、JCV內標質控品，各組分 含量為：10. 權利要求7-9任一項所述的檢測JC病毒的試劑盒，用于JC病毒的檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK106048093SQ201610622750
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月2日
【發明人】葉鋒, 劉明坤, 余榮
【申請人】北京思爾成生物技術有限公司