專利名稱:植物懸浮培養物高效轉化和再生的方法
植物懸浮培養物高效轉化和再生的方法
發明領域
本發明一般地涉及植物遺傳工程，更特別地，涉及農桿菌(Agrobacterium)介導 的轉化方法。
發明背景
在整個申請中，各種專利、公開的專利申請和出版物均作為參考。這些專利、公開 的專利申請和出版物公開的內容在此全文引入本申請作為參考，以用來更加完整地描述本 發明所屬技術領域：
的現有技術水平。出版物的全部著錄項目都可在權利要求
書前的參考書 目的列表中找到。
棉花是一種重要的經濟作物。每年的棉花纖維產品給世界農業經濟帶來數十億美 元的收益。盡管從1987年起就可進行棉花的基因轉化(Firoozabady等，1987)，但現今所 使用的方法效率仍然很低，而且花費很大，這是由于轉化細胞再生為植株的效率非常低，以 及花的授粉能力很低。另外冗長的再生過程也使得效率更加低下。
現在已有幾種利用棉花外植體進行農桿菌介導的轉化的方法，所述外植體例如子 葉(Firoozabady 等，1987)、胚軸(Umbeck 等，1987 ；美國專利號 5，004，863 和 5，159，135 ； 歐洲專利公開號EP 0 270 355)、葉柄(國際專利公開號W0 00/77230A1)和根(國際專利 公開號W0 00/53783)。另外也已經報道了用于棉花植株再生和轉化的改進方法，其中使用 了胚軸過渡區(hypocotyl transition zone) (W0 98/15622)、苗端(W0 89/12102和美國專 利號5，164，310)和頂生的或結節的分生組織(W0 97/43430)。或者，棉花外植體可通過微 粒轟擊轉化，例如，胚軸(W0 92/15675 和 EP 0 531 506 ;McCabe 和 Martinell，1993)和胚 懸浮培養物(Finer 和 Mc Mullen，1990)。
上述提到的絕大多數方法利用體細胞胚發生(somatic embryogenesis)的再生途 徑，其中需要起始、成熟和萌芽的冗長過程。體細胞胚愈傷組織或胚懸浮培養物通過農桿菌 介導的(美國專利號6，483，013 ；5，583，036)或通過微粒轟擊(Finer和McMullen, 1990) 進行的轉化充分地縮短了再生過程。然而，從體細胞胚轉變為正常帶根小植株的轉化率是 非常低的，這嚴重阻礙了轉化進程。
除再生之外，人們一直在尋找與植物(如棉花)轉化密切相關的將T-DNA傳遞到 宿主基因組的更為有效的方法。在了解農桿菌的毒力和T-DNA接合方面已經進行了廣泛的 研究。現在，人們認識到在T-DNA傳遞給植物細胞之前，農桿菌細胞必須通過由宿主分泌的 化學因子介導的復雜的信號傳導機制識別并將自身黏附到宿主細胞上，，其中所述化學因 子的產生由機械損傷誘導。這些化學因子由一系列酚類化合物組成，例如乙酰丁香酮、芥子 酸(3，5 二甲氧基-4-羥基肉桂酸)、丁香酸(4-羥基-3，5 二甲氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羥 基-3-甲氧基肉桂酸)、兒茶酚(1，2_ 二羥基苯)、對羥基苯甲酸(4-羥基苯甲酸)、間 二羥基苯甲酸(2，4_ 二羥苯甲酸)、原兒茶酸(3，4_ 二羥基苯甲酸)、吡咯沒食子酸(2，3， 4-三羥基苯甲酸)、沒食子酸(3，4，5_三羥基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羥基苯醛) (美國專利號6，483，013)。已經發現組成型表達的virG突變蛋白(virGN54D)能提高農桿 菌的毒力和轉化效率(Hansen等，1994)。同樣地，可激發農桿菌毒力的化合物例如乙酰丁香酮或胭脂堿極大地提高棉花莖尖(Veluthambi等，1989)和在固體培養基上繁殖的體細 胞胚愈傷組織(U.S. Pat. No. 6，483，013)的轉化效率。其中一個實例是大量真菌的成功轉 化，其中所述真菌不能分泌誘導農桿菌毒力的化合物，使得T-DNA接合必須使用乙酰丁香 酮(Bundock 等，1995 ；de Groot 等，1998)。
盡管已經經過許多的努力和嘗試去改進轉化方法，但目前的技術仍舊是低效、耗 時和花費巨大的。因此，一些植物，例如棉花，在對其植物發育和組織分化的分子機制的認 識上遠遠落后于其它主要農作物。很明顯，目前的轉化技術與特別是棉花的重大的經濟價 值不協調，至今還沒有重大突破。
在絕大部分植物(包括棉花)中，轉化方法主要使用農桿菌將T-DNA傳遞給局限 在小表面積即外植體或愈傷組織的切割表面中的宿主細胞(美國專利號6，483，013)。這極 大的限制了基因轉化的發生率，因為絕大多數宿主細胞沒有與T-DNA供體直接接觸。因此， 只有大約20-30%的外植體被轉化(Firoozababy等，1987 ；Cousins等，1991)。以前，曾經有 人成功轉化了細胞懸浮培養物，其利用的是在AT-管@或培養瓶中的液體培養基中進行共 培養(美國專利號5，583，036)。雖然沒有顯示具體的轉化率，但我們發現這種方法的轉化 率仍然很低(
圖14)。這個方法的主要問題可能在于在豐富液體培養基中進行培養時農桿 菌細胞可能難以表達毒力基因，并且在持續攪拌的情況下很難粘附至植物細胞，因此T-DNA 的接合效率很低。
與在植物轉化中主要應用的外植體相比，懸浮培養物中的細胞是作為單個細胞或 一小簇細胞團出現的。當前，缺乏處理和轉化這些材料的有效技術。最近的研究提示液體 培養基中培養的真菌細胞在多孔膜上共培養時可被轉化，所述膜平鋪在使農桿菌毒力最 優化的半固體培養基上面(W0 02/00896 ；Bundock 等，1995 ；Piers 等，1996 ；de Groot 等， 1998)。使用膜或過濾介質(filter)有雙重的好處。其可以有效地持續過濾掉過量的液體， 能夠將T-DNA受體和供體細胞集中起來，同時能夠使共培養物和培養基之間的營養物質、 礦物質和信號傳導化合物有效擴散。
Finer(1988 ；EP0317512B1)在低生長素含量的液體培養基(MS鹽，維生素B5， 0. lmg/1 2，4-D或0.5mg/l毒莠定，2%蔗糖)中使用源自子葉或胚軸外植體的未分化的愈 傷組織起始胚發生。隨后將胚組織在含有較高生長素濃度(5mg/l 2,4-D)的類似液體培養 基中進行繁殖/維持。如果提供谷氨酰胺，則這樣制備的懸浮組織在液體培養基中可發育 為成熟的胚。
Rangan等(美國專利號5，583，036和5，244，802)使用源自子葉、胚軸外植體 或是在固體培養基上產生的合子胚的未分化的愈傷組織在高水平生長素的固體培養基 (l-10mg/l)中起始體細胞胚形成，并將胚愈傷組織維持在高水平生長素(l-10mg/l)的液 體培養基中。所述培養物包含各種尺寸的胚細胞團塊的混合物，并且需要定期過濾以去除 大的團塊。
Trolinder和G00din(1987)在不含激素的液體培養基中起始胚發生，并在相同 的培養基中維持懸浮培養物。這種懸浮培養物中的細胞具有異源發育階段，并以分泌暗化 (darkening)、抑制生長的化合物的大團塊形式存在。
Levee等，(1999)，和美國專利申請公開號US2002/0100083A1、US2002/0083495A1、 和US2002/0092037A1涉及在共培養松樹細胞中膜的使用。
5[0015]本領域需要改進的和更有效的由農桿菌介導的植物轉化和再生的方法，所述植物 如棉花、玉米、大豆、小麥、水稻和大麥。
發明概述
為了克服先前報道的與植物(特別是棉花)轉化方法相關的問題，本發明提供 了由農桿菌介導的將T-DNA與懸浮培養的細胞或愈傷組織接合的高效植物轉化方法。在 此描述的方法使用膜或過濾介質作為共培養T-DNA供體和受體的固相支持物。特別地， 本發明提供用于生產轉基因植物的方法，其中包括提供原胚植物細胞(proembryogenic plant cell)以及在液體培養基中培養所述細胞以產生細胞懸浮培養物。在多孔的固 相支持物上將所述懸浮培養物與攜帶包含外源基因和選擇性標記的載體的根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)培養物共培養，所述農桿菌能將該外源基因和選擇性標記 穩定轉移進所述細胞的基因組中。由此生成細胞群，從中選擇出表達所述外源基因的細胞 并使之再生為轉基因植物。
一方面，使用綠色熒光蛋白(GFP)作為可視標記，發現棉花細胞培養物能夠以令 人驚訝的高效率轉化(多至200卡那霉素抗性愈傷組織形成單位/200mg細胞)，并且能夠 以比先前報道的高得多的效率再生成能育植物。
本發明的另一方面，先前未使用過的組織，例如從成熟種子切下的棉花根部或莖 尖，被用于具有胚發生能力的懸浮培養的細胞的起始培養和維持培養。
目前，已經公開了兩種涉及通過農桿菌介導的T-DNA接合進行的棉花體細胞胚材 料轉化的方法，分別是美國專利申請號5，583，036和6，483，013的內容。美國專利申請號 5，583，036涉及轉化懸浮培養物的方法，其通過在液體培養基中共培養棉花胚愈傷組織和 攜帶包含感興趣的基因的Ti質粒的根癌農桿菌進行。美國專利申請號6，483，013涉及棉 花胚愈傷組織的轉化方法，所述胚愈傷組織在高生長素含量的固體培養基中進行起始培養 和繁殖培養，并在固體培養基上與根癌農桿菌共培養。兩種方法都使用體細胞胚發生以再 生為能育棉花植株。這里，如同所指出的，本發明提供了用于懸浮細胞培養物轉化和其再生 為能育植株的方法，是上述方法的改進。特別地，使用在多孔固相支持物如膜或過濾介質上 進行的共培養技術極大地提高了植物的轉化效率。本發明的其他方面包括使用各種培養基 組合物。
附圖簡述
圖1顯示PZP111-35S :GFP的基因構成。L和R分別代表左右邊界。植物選擇標 記基因(NPTII)受CaMV 35S啟動子和35S終止子的調控，GFP受35S啟動子和Nos終止子 的調控。
圖2顯示在懸浮培養物中繁殖的原胚愈傷組織(S4)的結構。
圖3顯示懸浮培養物和溶液的暗化。(A)顯示一直在LM1中培養的培養物S16 ； (B) 顯示在四種不同培養基(LM1、LM2、LM3和LM4)中輪流培養的培養物S16。
圖4顯示細胞分裂素對體細胞胚產量的影響。約0. lmg的愈傷組織平鋪在MS培 養基(基礎)上，或平鋪在添加了 0. 01mg/l NAA(NAA)、lmg/16BA(BA)、lmg/l 2IP 或 lmg/1 玉米素核糖核苷(ZR)的MS培養基上。S5和S16是兩種懸浮培養物。一個月后記錄體細胞 胚的數目。所示結果代表三個重復平板組的平均值。
圖5描述了對于在R1培養基中經過兩次傳代培養并在R2培養基中經過一次傳代培養的S5懸浮培養物，玉米素核糖核苷對體細胞胚產生的影響。平板所示如下(A)在所有 的傳代培養中沒有添加玉米素核糖核苷；(B)在第一次傳代培養中加入lmg/1玉米素核糖 核苷(只顯示兩個區域)；(C)在第一次和第二次傳代培養中加入lmg/1玉米素核糖核苷； (D)在三次傳代培養中都加入lmg/1玉米素核糖核苷。
圖6顯示T-DNA受體細胞和供體細胞在尼龍膜(Hybond-N)上的共培養。
圖7 (A)顯示在R1固體培養基上分區(in sectors)選擇；(B)在液體培養基中培 養筏(culture raft)上的選擇；(C)顯示共培養5天后轉化的GFP+細胞。
圖8顯示在選擇培養基R1上培養一個月后的轉化的GFP+胚(A)和胚組織(B)。
圖9顯示共培養4個月后的發芽的胚(A)和胚樣組織⑶。
圖10顯示源自胚樣組織的帶有多個芽的小植株。
圖11顯示源自發芽的體細胞胚的盆栽的小植株(potting ready plantlet)。
圖12顯示共培養7-8個月后健壯開花的植株。
圖13顯示來自轉基因成熟葉的GFP+葉子(左組)和來自未轉化的成熟株的背景 熒光。
圖14顯示在R1選擇培養基中培養一個月后的愈傷組織部分。(A)顯示按照美國 專利號5，583，036中描述的方法共培養后的結果。(B)顯示根據本發明的方法獲得的結果。
圖15顯示㈧來自野生型植株(Coker312)的新鮮花粉；(B)源自S16的轉基因 植株的新鮮花粉；(C)發育不全的棉桃(boll)(源自同一植株)，其含有一些帶有延長纖維 的已受精的胚珠；(D)用野生型花粉對相同的植株傳粉10天后膨大的棉桃。
發明詳述
本發明一般涉及生產轉基因植物(優選棉花、玉米、大豆、小麥、水稻和大麥，最優 選為棉花)的方法，，所述轉基因植物通過將至少一種感興趣的基因的一個拷貝整合到核 基因組中而表達該基因。特別地，本發明提供生產轉基因植物的方法，所述方法包括提供原 胚植物細胞，并在液體培養基中培養所述細胞以產生細胞懸浮培養物。在多孔固相支持物 上，將所述細胞懸浮培養物與攜帶包含外源基因和選擇標記的載體的根癌農桿菌培養物共 培養，所述農桿菌能將所述外源基因和選擇標記穩定轉移進所述細胞的基因組中。從而共 培養產生細胞群。可以從中選擇出表達所述外源基因的細胞，并將其再生為轉基因植物。 在一個實施方案中，所述原胚細胞衍生自、獲自愈傷組織或是愈傷組織的一部分。所述多孔 固相支持物優選為膜或過濾介質，優選至少包括尼龍、硝化纖維、纖維素或玻璃纖維中的一 種。在一個實施方案中，所述固相支持物浸泡在液體培養基中。在另外一個可選實施方案 中，所述固相支持物置于合適的固體培養基上。載體可以是質粒例如Ti或Ri質粒。本發 明的方法是已知的農桿菌介導的轉化方法的改進。
如果需要，可以使用本領域已知的方法將所得到的轉基因(轉化的)植株與感興 趣的種質回交。本發明方法使用的植物細胞可源自任何植物，沒有限制，但優選為棉花、 玉米、大豆、小麥、水稻和大麥，最優選為棉花。優選的棉花品種包括陸地棉(Gossypium hirsutum)和海島棉(Gossypium barbadense)。其它植物，包括其它雙子葉植物，也適合用 本發明的方法轉化。
在本發明的方法中，所述液體培養基可以是低生長素含量的培養基(范圍例如從 約0到約0. lmg/1 NAA)。除非有其他說明，在本文所述方法的培養步驟中使用的培養基可以是任何適合所述培養的培養基。在本領域有許多這樣的培養基是已知的并可以獲得。細 胞選擇通過化學或遺傳學方法進行，可以包括使用報道構建體作為選擇標記。這些選擇方 法在本領域是已知的。在一個優選的實施方案中，所述報道構建體組成型表達綠色熒光蛋 白。特別優選的報道構建體是PPZP111-35S :GFP。
在一個實施方案中，所述原胚細胞通過對植物種子進行滅菌、使所述種子萌發以 生成植物組織、從所述植物組織獲得外植體、以及從所述外植體誘導形成愈傷組織獲得。所 述種子可在漂白劑溶液中滅菌，優選包含約30 %漂白劑的溶液。可在MS培養基上使所述種 子萌發，萌發時間大概需要約4-14天。所述外植體優選為根或莖尖(shoot tip)。
本發明的方法進一步包括誘導愈傷組織形成和在固體培養基上起始體細胞胚發 生，這段過程需要約一到三個月的時間。此外，這些方法進一步包括誘導愈傷組織分化生成 原胚組織，這樣的分化可優選地在不含激素的固體培養基上經過一段長到足夠生成原胚組 織的時間進行，所述原胚組織優選在低生長素含量的液體培養基或一系列液體培養基中懸 浮、維持和繁殖。
上述懸浮培養材料優選在具有不同生長素含量和氮源的一系列新鮮培養基中定 期傳代培養，優選的間隔時間為約3天到約30天。上述使用的液體培養基優選含有補充 了低濃度的生長素的MS鹽和維生素B5，所述低濃度的生長素優選為約0-0. lmg/1 NAA和 /或約0-lmg/l毒莠定。如果提供，可選擇的氮源優選為氨基酸，例如谷氨酰胺和/或天冬 酰胺，優選的濃度為約0. l-5g/l。上述固體或液體培養基優選pH為約5. 8-約6. 5，優選約 6. 0-約6. 4。懸浮培養物可在約26-約32°C、光照周期為約16個小時的條件下于振蕩平臺 上維持。
本文描述的共培養可進一步包括在低磷酸鹽液體培養基中使所需農桿菌菌株生 長，所述培養基優選補充了合適濃度的毒力誘導試劑的MinAB培養基，使所述農桿菌菌株 生長至密度優選為約0. 1-0. 5個0D600單位，從而提供具有預誘導的毒力的農桿菌。所述培 養物可以在有益于T-DNA受體細胞良好生長并增強農桿菌毒力表達的液體培養基中重建。 或者，農桿菌菌株可通過在農桿菌基因組或農桿菌中的Ti或Ri質粒載體中插入上述基因 而工程化為組成型表達活性virA突變體。
懸浮培養材料可在液體培養基中重建，所述液體培養基適于表達農桿菌vir基因 并在多孔固相支持物如膜或過濾介質上與上述制備的農桿菌培養物混合。這種混合物可 在持續光照下培育約1-5天。在一個實施方案中，所述細胞或愈傷組織被轉移至補充了合 適的抗生素以抑制未轉化植物細胞和農桿菌細胞生長的不含激素的培養基。所述多孔固相 支持物可以是如所描述的膜或過濾介質，并且可以平鋪在合適的固體培養基上或浸在合適 的液體培養基中，所述培養基優選含有補充了維生素B5和作為氮源的蔗糖和/或丙三醇 的MS鹽或MinAB鹽。這些培養基優選pH為約5. 7-約6. 5，優選約5. 7-約5. 9。優選在約 18-26°C、在穩定的或持續光照下進行共培養。
農桿菌培養物可以是新鮮制備的或低溫保存在例如約0-20% DMS0中、約0_90% 丙三醇中或約0-5M山梨糖醇或其任意組合中。
一方面，本發明還提供了從原胚懸浮培養材料再生完整植株的方法。這些方法包 括誘導所述懸浮培養材料再次進入胚發育和胚增殖階段，所述誘導通過將預先與農桿菌共 培養或未與農桿菌共培養的懸浮培養的材料置于不含激素并增加了 KN03的基于MS的培養
8基中，并例如每隔約3-4周在相同組分的培養基中定期傳代一段足以產生前球狀胚到球狀 胚的時間進行。同樣，可以例如約每隔3-4周進行進一步的定期傳代，所述傳代在增加了 謂03并補充了氨基酸的固體培養基中，優選基于MS的培養基中培養約4-12周進行，所述氨 基酸優選為濃度約0. l-5g/l的谷氨酰胺和天冬酰胺。接下來可以在合適的培養基中誘導 形成根和真葉，然后將所得到的小植株轉移到土罐中產生開花植物。此處所述的培養基可 以補充合適的抗生素以抑制進行共培養時未轉化的細胞和農桿菌細胞的生長。所述傳代可 在液體培養基、帶有支撐膜的液體培養基、固體培養基或其它合適的培養基中進行。這些培 養基的PH優選約5. 7-約6. 5，更優選約6. 0-約6. 4。此處涉及的棉花或其它植物細胞、體 細胞胚和小植株優選在約25-32°C、光照周期為約16小時條件下培養。可以不經過預先沖 洗而選擇共培養的材料。
本發明還提供一種方法，作為本文已描述的方法的擴展和補充，所述方法用于拯 救不育植株和加速產生商品化品種，該方法包括用來源于同品種或特定感興趣的種質的合 子種子的花粉進行植株(包括雄性不育株)的人工授粉。在需要或必要時，可以在后續的 世代中進行持續的回交。
在優選的方法中，所述農桿菌包括virA基因變體。所述virA基因變體可整合到 農桿菌的基因組或摻入載體中。
在已描述的方法中，可以通過加入細胞分裂素來促進細胞再生為植株。尤其對于 棉花來說，所述細胞分裂素優選是玉米素或其衍生物。此外，在一個實施方案中，原胚植物 細胞在包含低濃度的2，4-D和細胞分裂素的固體培養基上進行起始培養。所述原胚細胞也 可以在不含激素的液體培養基和/或低生長素含量的液體培養基中增殖。
將外源基因導入農桿菌而使其可以穩定地轉移進與所述農桿菌接觸的植物或 植物組織中的技術是本領域已知的。優選使用所謂的“去毒(disarmed)”農桿菌菌株或 Ti質粒，即，其中負責野生型農桿菌導致的冠癭病的腫瘤特征形成的基因已被除去或滅 活的菌株或質粒。在文獻中可見大量去毒農桿菌菌株的實例(例如，pAL4404、pEHAlOl 和pEH105 (Walkerpeach & Veltern，1994))。更優選使用所謂二元載體系統，例如 5油1切吐00汁等1990，1995所描述的。二元載體系統允許在大腸桿菌中操作攜帶要導入植 株中的外源基因的質粒，這使得載體構建的過程更易于進行。
類似地，載體構建(包括構建包含希望導入植物的外源基因的嵌合基因)可用本 領域熟知的技術進行。嵌合基因應包含在希望表達的宿主中有活性的啟動子。例如，有利 的是具有一系列選擇標記，以便在轉化過程的不同階段選擇轉化的細胞。將選擇標記(例 如賦予抗生素如卡那霉素、頭孢噻肟或鏈霉素抗性的基因)與在細菌中有活性的啟動子相 連，可使得能選擇出含有所述標記的細菌(即轉化子)。與植物活性啟動子(如CaMV35S啟 動子或T-DNA啟動子如NPT II N0S啟動子)連接的另外一種選擇標記可使得能選擇轉化 的植物細胞。希望導入植物細胞的外源基因應包含與編碼序列功能性相關的植物活性啟動 子，從而該啟動子在轉化的植物中驅動所述基因的表達。同樣，植物活性啟動子如CaMV 35S 啟動子、NPT II N0S啟動子或很多其他組織特異性啟動子是本領域熟知的，且選擇合適的 啟動子屬于本領域常識。
本發明的方法可用于產生表達任意數目外源基因的轉基因植物，并且不限于所選 的基因。所需外源基因的選擇取決于研究者的目的，在本領域中已知許多可用于本發明的
9所需基因(例如，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)毒素基因家族、除草劑抗 性基因如賦予草甘磷抗性的莽草酸合酶基因、美國專利5，188，642、或賦予2，4_ 二氯苯氧 乙酸(2,4-D)抗性的2，4-D單加氧酶基因(Bayley等，1992)、雄性不育基因如美國專利 5，741，684 (Fabijanski等)的反義基因、或甚至是美國專利5，723，765 (Oliver等)描述的 精細作物保護系統)。
正如本文表明的，本發明特別提供了使用不同懸浮起始培養和維持培養過程的方 法。作為一個非限制性例子，從成熟棉花種子切下的根和莖尖作為外植體在細胞分裂素和 低濃度2，4-D存在下用于誘導形成愈傷組織。通過將其轉移到不含激素、含有高KN03含量 的固體培養基上開啟體細胞胚生成發育途徑。選擇的愈傷組織的懸浮培養物可以在具有 相似組分的補充了低濃度的生長素(0.01mg/l NAA)的液體培養基中進行起始培養。基于 將愈傷組織轉移到液體培養基的時間，這些培養物可在早期胚發育的各個階段進行維持培 養。如果一直使用同樣的培養基，則產生的細胞培養物會暗化。然而，針對這個問題的有效 解決方案包括在四種不同培養基中輪流培養。這使得培養物經歷簡短的細胞分化_增殖循 環過程，這是由于氮源減少的情況下胚的發育增強特性(Davidonis和Hamilton，1983)。這 樣制備的細胞培養物具有很好的發育同步性和均一的微黃色。不同細胞系的胚發生能力是 不同的。
進一步提供了促進細胞培養物再生為體細胞胚的培養基組合物，其通過加入細胞 分裂素而顯著提高早期胚發育。已經發現細胞分裂素在體細胞胚生成中起著重要的作用 (Xing等，1999 ；Sagare等，2000，Tokuji和Kuriyama，2003)。然而，從未報道過其可用于棉 花的再生。已發現細胞分裂素，尤其是玉米素核糖核苷，在植物再生的早期階段使用時，能 夠顯著提高體細胞胚的形成。合理使用該激素可以縮短再生為完整小植株的時間，這是由 于至球形胚階段的胚的轉化提高以及葉子的發育加快。先前，懸浮細胞的再生或者通過在 液體培養基中培養進行，或者通過將其均勻地平鋪在固體培養基上進行(Finer，1988 ；EP 0317512B1, US5, 583,036).兩種方法都與合子胚的天然發育環境相差極大。而且，材料需 要重復傳代，因此使用平鋪的愈傷組織是很繁瑣的工作，并且在再生過程中生長較慢的轉 化子可能會被選出。而本發明通過部分包埋進各個分區中的固體培養基中而簡化了懸浮培 養的細胞/愈傷組織的處理過程，這易于傳代培養物之間的物質轉移，而且所述細胞如此 聚團可以防止在固體培養基中培養期間發生脫水。
已知環境pH和溫度影響農桿菌的毒力。最優的毒力大約出現在pH5.7，25°C以下 (Rogowsky，等，1987 ；Fullner和Nester，1996)。本發明已經考慮了這些因素以配制與已用 于高效轉化纖維狀真菌的培養基不同的培養基(Bimdock等，1995 ；de Groot等，1998)，以 使植物細胞(特別是棉花)健康生長。與預誘導的培養物在約24°C下進行共培養。或者， 農桿菌菌株可工程化為表達virA突變體(McLean等，1994)。
根據前面的描述，本領域普通技術人員可最大程度地實施本發明。因此下面的實 施例只是例證性的，而不應被解釋為在任何方面限制如在后面的權利要求
書中所列出的本 發明。
報道構建體，即組成型表達綠色熒光蛋白(GFP)的pPZPlll-35S :GFP(Xu等，未公 開的數據)(圖1)，用于例證本發明的技術過程以及檢測所述方法的有效性。正如所指出 的，本發明也可以使用其它合適的標記。[0059]實施例1
從外植體產生棉花懸浮細胞培養物
在30%漂白劑溶液中浸泡棉花種子45-90分鐘滅菌。在用水徹底清洗后，種子在 28°C于水中浸潤一天，然后在28°C、16小時光照條件下于SGM培養基上進一步溫育4_14 天。將根切成小段(3_5mm)，并使之在SM1培養基上培養約1個月以使愈傷組織發育。或 者，可以從種子上切下胚的莖尖，用于誘導愈傷組織。將所述愈傷組織從外植體上分離，進 一步在SM1培養基上培養約1個月。為了誘導體細胞胚，將愈傷組織轉移到SM2培養基上， 每隔3-4周傳代到新鮮培養基上，直到獲得松散結構化的微黃色或者微紅色愈傷組織。將 多至200mg的分離的愈傷組織置于合適容器中(例如250ml錐形瓶或圓筒組織培養容器) 的50ml LM1培養基中，并在28°C于振蕩平臺(120RPM)上以16小時光照周期培養。通過 將15ml培養物(在穩定的培養物中約2ml細胞量)轉移到另外容器中的35ml新鮮培養基 中對細胞/愈傷組織進行傳代，典型地每隔7-14天進行。循環使用四種液體培養基(LM1、 LM2、LM3 禾口 LM4)。
實施例2
將感興趣的基因導入到棉花細胞中
將感興趣的基因通過農桿菌介導的T-DNA接合送遞至棉花細胞中，其通過對新鮮 的經過傳代的棉花懸浮培養物和攜帶包含目的基因和顯性選擇標記的合適的Ti或Ri載體 的農桿菌培養物進行共培養實現。混合物共點樣于平鋪在SIM1或SIM2平板上的一片多孔 膜或濾紙上，培養足以產生所需數量的轉化的棉花細胞的時間。或者，可以用已浸泡過液體 培養基的3-4片濾紙代替所述固體培養基。為了獲得最好的結果，使用按照描述制備的用 于纖維狀真菌轉化的預誘導的農桿菌培養物，盡管一般的細菌培養物也能使用(de Groot 等，1998)。
實施例3
從轉化的細胞再生為轉基因棉花植株
共培養后，細胞轉移到補充了合適的抑制未轉化的棉花細胞以及所粘附的農桿菌 細胞的抗生素的R1培養基上。也可通過可視化標記選擇轉化的植物細胞。共培養的棉花 細胞不需要清洗，并且可以轉移到選擇固體培養基如callus AsectorsO上(一般100-150/ 共培養物)。或者，每份共培養物可作為整體轉移到缺乏phytagel的相同培養基中的培養 筏(culture raft)上(圖7)。液體培養基中的培養通常限制在最初的3_4周。在這之后， 優選轉移到固體R1培養基上。通常需要在R1培養基上進一步培養3-4周，以便獲得多個 胚。如果沒有看到未分化的胚，則需要在R1培養基中進一步培養。隨后，將具有抗生素抗 性的球形胚階段或更晚階段的胚在R2培養基上培養3-4周，并重復一次。在R2培養基上 進行第二次培養時可以去除抗生素。將發育完全的胚(不帶根，帶有子葉)或無明顯子葉 的綠色胚樣組織轉移到R3培養基，然后再將完整的小植株轉移到R4培養基。在約3-4周 后，將小植株種植到土罐中。
實施例4
懸浮細胞培養物的制備
棉花種子(Coker 312)在30%漂白劑(Clorox)溶液中浸泡45分鐘滅菌，隨后用 水清洗兩次，在28°C于水中浸潤一天。種子進一步在28°C、16小時光照周期下于SGM培養基上培養4天。將白色的根切成小段(3-5mm)，使之在SM1培養基上培養約1個月形成愈傷 組織。將愈傷組織從外植體上分離，在同樣的培養基上進一步培養約1個月。將愈傷組織轉 移到SM2培養基，每隔大約3-4周傳代到新鮮培養基上，直到獲得松散結構化的愈傷組織。 將約200mg分離的愈傷組織放置在250ml錐形瓶中的50ml LM1培養基里，在28°C以16小 時光照周期于振蕩平臺(120RPM)上培養。每7-14天通過將每份15ml的培養物(在穩定 的培養物中約2ml細胞/愈傷組織量)轉移到另外容器中的35ml新鮮培養基中對懸浮培 養物進行傳代。在所選擇的5個愈傷組織中，在四種不同培養基(LM1、LM2、LM3和LM4)中 循環進行傳代培養時，有三個穩定為由各種尺寸的愈傷組織組成的旺盛生長的微黃色培養 物。在掃描電鏡下檢查時，所述愈傷組織顯示沒有或有限的胚結構(圖2)。如果一直使用 單一的培養基，可發生嚴重的變棕或變暗現象(圖3)。當將培養物S4和S5轉移到固體培 養基R1上時，它們都成功地發育為體細胞胚。
實施例5
細胞懸浮培養物的制備
棉花種子在30%漂白劑(Clorox)溶液中浸泡45分鐘滅菌，隨后用水清洗兩次，在 28°C于水中浸潤一天。種子進一步在28°C、16小時光照周期下于SGM培養基上培養4天。 將白色的根切成小段(3_5mm)，使之在SM1培養基上培養1個月形成愈傷組織。將愈傷組 織從外植體上分離，在同樣培養基上進一步培養約1個月。將愈傷組織轉移到SM2培養基 上，每隔3-4周傳代到新鮮培養基上，直到獲得松散結構化的愈傷組織。將多至200mg分離 的愈傷組織放置在250ml錐形瓶中的50ml LM1培養基里，在28°C以16小時的光照周期于 振蕩平臺(120RPM)上培養。每7天通過將每份15ml的培養物(在穩定的培養物中約2ml 細胞/愈傷組織的量)轉移到另外容器的35ml新鮮培養基中對懸浮培養物進行傳代。在 所選擇的3個愈傷組織中，在四種不同培養基(LM1、LM2、LM3和LM4)中循環進行傳代培養 時，有兩個穩定為由各種尺寸的愈傷組織組成的旺盛生長的微黃色愈傷組織。將培養物S15 和S16轉移到固體培養基R1上時，它們都成功地發育為體細胞胚。
實施例6
懸浮細胞培養物的制備
棉花種子在30%漂白劑(Clorox)溶液中浸泡45分鐘滅菌，隨后用水清洗兩次， 在28°C于水中浸潤24小時。種子進一步在28°C、16小時光照周期下于SGM培養基上培養 4天。將白色的根切成小段(3-5mm)，使之在SM1培養基上培養約1個月形成愈傷組織。另 外，從滅菌種子上切下胚的莖尖，與根外植體一樣用于誘導愈傷組織。一個月后，切下兩種 外植體頂端的微黃色愈傷組織，在相同的培養基中再培養一個月。將愈傷組織轉移到SM2 培養基，每3-4周傳代到新鮮培養基上，每3-4周傳代到新鮮培養基上，直到獲得松散結構 化的愈傷組織。將約200mg分離的愈傷組織放置在250ml錐形瓶中的50ml LM1培養基里， 在28°C以16小時的光照周期于振蕩平臺(120RPM)上培養。每7天通過將每份15ml的培 養物(在穩定的培養物中約2ml細胞/愈傷組織的量)轉移到另外容器的35ml新鮮培養 基中對懸浮培養物進行傳代。所有7個所選擇的愈傷組織均穩定為旺盛生長的微黃色愈傷 組織。
實施例7
細胞分裂素對早期胚發育的影響
12[0079]將約0. lg的懸浮培養的愈傷組織平鋪在補充了含有lmg/1 6BA、2IP或玉米素核 糖核苷的0. 01mg/l NAA的R1培養基上。培育5周后，記錄球形胚階段或更晚階段的胚的數 目。在兩種測試的培養物(S5和S 16)中，玉米素核糖核苷的處理使胚產量顯著增加(圖 4)。
實施例8
細胞分裂素對早期胚發育的影響
將原胚愈傷組織置于含或不含lmg/1玉米素核糖核苷的R1培養基中。在含玉米素 核糖核苷的R1培養基上培養愈傷組織1-3個月。可觀察到在玉米素核糖核苷處理的平板 上胚數目和尺寸顯著增加，而且在繼續暴露于玉米素核糖核苷時，其效果更加顯著(圖5)。
實施例9
用誘導后的農桿菌培養物轉化懸浮培養物
通過電穿孔，將二元T-DNA載體pPZPl 11-35S :GFP導入根癌農桿菌菌株AGL1中。 用IM培養基將菌株的飽和培養物稀釋5倍，然后在28°C下培養6個小時，直到達到約0.3個 OD600單位。將約0. 5ml的懸浮培養物S5以及在LM1、LM2、LM3或LM4上培養的S5與0. 2ml 農桿菌培養物混合，并共點樣于平鋪在補充了 100 u M乙酰丁香酮的R1培養基上的Hybbond N膜(Amersham Pharmacia)上。在24°C、持續光照下共培養3天后，用懸浮培養基(例如， 含100mg/l卡那霉素和450mg/l頭孢噻肟的LM1)沖洗尼龍膜上的愈傷組織。將整個膜轉 移到補充了 100mg/l卡那霉素和300mg/l頭孢噻肟的R1或R2培養基上，在28°C以16小時 光照周期培養。一個月后可見GFP陽性愈傷組織。將剩余的農桿菌培養物分成每份0. 5ml, 并且加入等體積的14% DMS0。在-80°C下冷凍保存細菌儲備物，備用。
實施例10
懸浮培養物的轉化
在使用前，將冷凍的AGL1培養物試管解凍后離心收集細菌細胞。用0.5ml C1培 養基(pH 5.7)重懸細菌團，然后與0.5ml (約0.2g細胞量)細胞懸浮培養物混合，共點樣 于平鋪在 CP1 培養基(pH 5.7)上的 Hybond-N 膜(Amersham Pharmacia)或 Whatman 4 濾 紙上。一個膜上可同時進行多個(3-4)獨立的共培養(圖6)。共培養后，轉移細胞/愈傷 組織(沒有清洗)至補充了 100mg/l卡那霉素和200mg/l頭孢噻肟的R1培養基，在28°C以 16小時光照周期培養。每個共培養分成多至160塊區域(sector)，每塊區域代表單一的大 型愈傷組織或一小簇微型愈傷組織(圖7A)。或者，將整個共培養物轉移到補充了 100mg/l 卡那霉素和200mg/l頭孢噻肟的LM1培養基上的培養筏上(圖7B)。在選擇培養基上第5 天就可以看到可分辨的綠色熒光點(圖7C)。在R1培養基中培養4周后，將卡那霉素抗性 區域分別轉移至補充了同樣抗生素的固體R1培養基上。同時，將液體培養的愈傷組織轉移 至固體選擇培養基R1。在共培養后的不同時間點，在熒光顯微鏡下觀察每個區域的綠色熒 光。大約在一個月后出現GFP陽性體細胞胚(圖8)。共培養3個月后，在每個共培養物中 發現多至38塊區域含有綠色熒光陽性胚。GFP呈陽性但尚未形成體細胞胚的區域比上述數 字高出幾倍。兩種類型的共培養支持物都取得了滿意的結果，總結如表1所示。
13

實施例11
用pPZPlll_35S :GFP構建體轉化懸浮培養物
將冷凍的攜帶pPZPlll-35S :GFP的AGL培養物的試管解凍，然后離心收集細菌細 胞。將細胞團重懸在Cl(pH 5.7)中。用C1培養基沖洗懸浮培養物(S4，S5和S16)。約 0. 5ml培養物與0. 4ml農桿菌懸浮液混合，共點樣于平鋪在CP1培養基(pH 5. 7)上的尼龍 膜上。共培養后，將愈傷組織(沒有清洗)轉移至補充了 100mg/l卡那霉素和200mg/l頭 孢噻肟的R1培養基上，在28°C以16小時光照周期培養。將每個共培養物分成多至160塊 區域，每塊區域代表單一的大型愈傷組織或一小簇微型愈傷組織。或者，將整個共培養物轉 移至補充了 100mg/l卡那霉素和200mg/l頭孢噻肟的LM1培養基上的培養筏上。在選擇培 養基中兩個月后，將卡那霉素抗性區域轉移至補充了含有相同抗生素的lmg/1玉米素核糖核苷的新鮮的R1平板上，繼續培養4. 5周。將卡那霉素抗性愈傷組織轉移至補充了 50mg/l 卡那霉素和200mg/l頭孢噻肟的R2培養基上。在不含抗生素的R2培養上這樣重復兩次，選 擇有可能在第一次在R2培養基上培養時就會出現的大的、生長旺盛的胚或綠色愈傷組織， 并轉移至R3培養基上。胚可能發芽并長出根和真葉(圖9A)。有趣的是，玉米素處理使得 許多沒有子葉的不正常胚和甚至是綠色組織(如圖9B所示)發育出芽。經常情況下，長出 多個芽(圖10)。長出真葉的小植株在3-4周后更茂盛，并繼續在R4培養基中培養使葉和 根進一步發育(圖11)。將帶有6-8片葉子的小植株轉移到土罐中，大約在共培養后的7-8 個月，植株開始開花(圖12)。約77%的成株是GFP熒光陽性(圖13)。從每一共培養物可 生成多達26株健壯的植株。用Southern印跡分析分析了其中18個推定的轉化體，其中17 個呈GFP轉基因陽性(95% )，7個含有單一轉基因(39%)。具體的轉化結果如表2所示。
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實施例
養培養基的PH的影響
前制備的農桿菌儲存液離心收集菌體，分別用pH 5. 2、5. 7、5. 9和6. 2的C1
懸浮細胞與0. 4ml農桿菌懸浮液混合，然后共培養于相應的固體培養基
共培 將先
2)上的尼龍膜上。每種條件進行3組共培養。在R1選擇培養基上培養
約 0. 2mg pH 5. 2-6.
18個月后，記錄顯示GFP熒光區域的數目。使用pH大于5. 2的培養基獲得顯著更好的結果。 當C1的pH分別為5. 2,5. 7和6. 2時，呈GFP熒光陽性的愈傷組織區域的比率平均分別為 71%、81%禾口 83%0
實施例13
共培養方法的比較
為了確定本發明的方法獲得高效轉化率的因素，我們使用基本上如先前公開的方 法(US5，583，036)轉化我們的懸浮細胞培養物。在LB培養基中制備T-DNA供體(攜帶 PPZP111-35S :GFP的AGL1菌株)。離心收集細菌細胞，用補充了 lmg/1 NAA的MS培養基重 懸浮至0. 5個0D600單位。將約0. 2g懸浮培養物(S5和S16)與在錐形瓶中的2ml新鮮的 農桿菌培養物混合，于28°C下放置兩個小時以使農桿菌細胞粘附到懸浮細胞上。在去除液 體培養基后，向燒瓶中加入10ml補充了 lmg/1 NAA的MS培養基。在振蕩平臺(lOOrpm)上 培養細胞18個小時。用MS培養基沖洗懸浮細胞(兩次)，分區域置于R1選擇培養基上。 在平行試驗中，如實施例9所述，制備相同的新鮮未冷凍的農桿菌菌株。如實施例10所述， 共培養S5和S16培養物。在R1選擇培養基上培養30天后，記錄體細胞胚的數目。在使 用我們的方法進行共培養后，約64% (S5)和83% (S16)的愈傷組織區域呈GFP熒光陽性， 而當在振蕩的錐形瓶中的液體培養基中進行共培養后，相應比率降為只有(S5)和13% (S16)(圖14)。使用本發明的共培養方法，很明顯卡那霉素抗性區域長的更大，其中發育的 胚也更多。
實施例14
轉基因植物繁殖能力的恢復
通過本文公開的方法獲得了能自花授粉的轉基因植物，盡管在花粉發育中可見到 某些缺陷(圖15)。因此，優選人工授粉產生種子。在用源自種子的植株的花粉進行授粉 時，源自S16的絕大多數植株都是能育的(圖15)。這是有利的，因為經常需要回交以生產
商品化品種。[0105]本文所用的簡寫和術語[0106]MS 鹽(Murashige and Skoog,1962)[0107]332. 02mg/l CaCl2[0108]170mg/l KH2P04[0109]1900mg/l KN03[0110]180. 54mg/l MgS04[0111]128. 4mg/lNaH2P04[0112]1650mg/lNH4N03[0113]0. 025mg/l CoC12.6H20[0114]0. 025mg/l CuS04. 5H20[0115]36. 7mg/l FeNaEDTA[0116]6. 20mg/l H3B04[0117]0.83mg/l KI[0118]16. 9mg/l MnS04.H20[0119]0. 25mg/l Na2Mo04. 2H20[0120]8. 60mg/l ZnS04. 7H20
B5維生素
100mg/l 肌醇
lmg/1 煙酸
lmg/1鹽酸吡哆醇，
10mg/l鹽酸硫胺
SGM 半濃度MS鹽和半濃度B5維生素，0. 02mg/l NAA, 0. Img/1MET (多效 trizazole), 5g/l 葡萄糖，2g/l phytogel, pH 6. 0
SMI :MS 鹽，B5 維生素，0. lmg/1 激動素，0. 05mg/l 2，4_D，30g/l 葡萄糖，2g/l phytogel, pH 6. 2
SM2 :MS 鹽，B5 維生素，1.9g/l KN03，30g/l 葡萄糖，2. 5g/l phytogel, pH 6.4
LM1 :MS 鹽，B5 維生素，1. 9g/l KN03，0. 0lmg/1 NAA，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4
LM2 不含 NH4N03 的 MS 鹽，B5 維生素，1. 9g/l KN03,0. Olmg/INAA, 30g/l 葡萄糖， lg/1谷氨酰胺，0. 5g/l天冬酰胺，
PH 6. 4
LM3 :MS 鹽，B5 維生素，0. 05mg/l NAA，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4
LM4 :MS 鹽，B5 維生素，0. 0lmg/1 NAA，0. 5mg/l 毒莠定，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4
C1
2. 05g/l K2HP04
1. 45g/l KH2P04
0. 6g/lMgS04-7H20
0. 5g/l(NH4)2S04
0. 5g/l NH4N03
0.01g/l CaCl2
2g/l 葡萄糖
0. 5mg/lZnS04-7H20
0. 5mg/l CuS04-5H20
0. 5mg/l H3BO3
0. 5mg/lMnS04-H20
0. 5mg/l NaMb04-2H20
lmg/1 FeS04
B5維生素
0.0 lmg/1 NAA
0. 5mg/l 毒莠定
40mM MES
0.5% 丙三醇
0-100 iiM 乙酰丁香酮
pH5. 7-6. 0
CP4 :C1，力口 4g/l phytogel
200156]R1 :MS 鹽，B5 維生素，1.9g/l KN03，30g/l 葡萄糖，pH 6. 4，2. 8g/lphytogel。
0157]R2 不含NH4N03的MS鹽，B5維生素，1. 9g/l KN03，30g/l葡萄糖，lg/1谷氨酰胺， 5g/l天冬酰胺，pH 6.4,2. 8g/l phytogel
0158]R3 :MS, B5 維生素，30g/l 葡萄糖，0. 01mg/l NAA，3g/l phytogel, pH6. 4
0159]R4 半濃度MS，B5維生素
0160]MinAB
0161]2. 05g/l K2HP04
0162]1. 45g/l KH2P04
0163]0. 6g/l MgS04-7H20
0164]0. 3g/l NaCl
0165]0. 5g/l(NH4)2S04
0166]0. 5g/l NH4N03
0167]0.01g/l CaCl2
0168]2g/l葡萄糖
0169]0. 5mg/l ZnS04-7H20
0170]0. 5mg/l CuS04-5H20
0171]0. 5mg/l H3BO3
0172]0. 5mg/l MnS04-H20
0173]0. 5mg/l Mb04-2H20,
0174]lmg/1 FeS04
0175]pH 7. 0
0176]IM
0177]2. 05g/l K2HP04
0178]1. 45g/l KH2P04
0179]0. 6g/l MgS04-7H20
0180]0. 3g/l NaCl
0181]0. 5g/l(NH4)2S04
0.5g/lnh4no3[0183]0.Olg/1CaCl2[0184]0.5mg/1ZnS04--7H20[0185]0.5mg/1CuS04--5H20[0186]0.5mg/1h3bo3[0187]0.5mg/1MnS04--h2o[0188]0.5mg/1NaMBOr2H20,[0189]lmg/1FeS04
0190]0.5%丙三醇
0191]2g/l葡萄糖
0192]100-200 u M 乙酰丁香酮
0193]40mM MES
21[0194]pH 5. 7
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權利要求
一種生產轉基因棉花植物的方法，所述方法包括a)提供原胚棉花細胞；b)在液體培養基中培養所述原胚細胞以產生細胞懸浮培養物；c)提供攜帶包含外源基因和選擇標記的載體的經預誘導的根癌農桿菌培養物，所述農桿菌能將所述外源基因和選擇標記穩定轉移進植物細胞的基因組中，其中所述對根癌農桿菌的預誘導是毒力預誘導；d)將所述細胞懸浮培養物的一部分與所述農桿菌培養物的一部分混合；e)在持續光照的條件下，將所述細胞懸浮培養物與所述農桿菌培養物的混合物在與共培養培養基接觸的多孔固相支持物上共培養1-5天，由此產生其中一些細胞用所述外源基因和選擇標記轉化的細胞群，其中所述共培養培養基不包含來自懸浮培養物的細胞；f)從所述細胞群中選擇表達所述外源基因的細胞；g)通過體細胞胚發生將所選擇的細胞再生為轉基因棉花植物。
2.權利要求
1的方法，其中所述原胚細胞衍生自愈傷組織。
3.權利要求
1的方法，其中所述固相支持物選自膜和過濾介質。
4.權利要求
1的方法，其中所述多孔固相支持物包括尼龍、硝化纖維、纖維素和玻璃纖 維中的至少一種。
5.權利要求
1的方法，其中所述棉花選自由陸地棉(Gossypiumhirsutum)和海島棉 (Gossypium barbadense)組成的一組。
6.權利要求
1的方法，其中所述農桿菌的預誘導通過在毒力誘導試劑的存在下培養所 述農桿菌來進行。
7.權利要求
1的方法，其中所述農桿菌的預誘導通過培養組成型表達活性virA突變基 因的農桿菌來進行。
8.權利要求
1的方法，其中所述原胚棉花細胞如下獲得 從棉花植物獲得外植體；從所述外植體誘導愈傷組織形成；和 從所述愈傷組織產生原胚組織。
9.權利要求
8的方法，其中所述原胚組織通過啟動愈傷組織的體細胞胚發生而從愈傷組織產生。
10.權利要求
8的方法，其中所述原胚組織通過誘導愈傷組織的分化而從愈傷組織產生。
11.權利要求
8的方法，其中所述外植體如下獲得 對棉花種子進行滅菌；將所述種子萌發以生成用作外植體的植物組織。
12.權利要求
11的方法，其中所述植物組織是根或莖尖。
13.權利要求
1的方法，其中所述固相支持物通過浸泡在液體共培養培養基中而與共培養培養基接觸。
14.權利要求
1的方法，其中所述固相支持物通過置于固體共培養培養基上而與共培養培養基接觸。
15.權利要求
1的方法，其中步驟(e)中的共培養培養基包含MinAB鹽、B5維生素，乙酰丁香酮，葡萄糖和甘油。
16.權利要求
1的方法，其中步驟(e)中的共培養培養基包含MS鹽、B5維生素，乙酰丁 香酮，葡萄糖和甘油。
17.權利要求
1的方法，進一步包括將所述轉基因棉花植物與感興趣的棉花種質回交。
專利摘要
本發明提供了通過農桿菌(Agrobacterium)介導的將T-DNA接合到懸浮培養的細胞或愈傷組織的高效植物轉化方法。本文描述的方法使用膜或過濾介質(filter)作為多孔固相支持物，用于T-DNA供體和受體的共培養。
文檔編號C12N15/82GKCN1946849 B發布類型授權 專利申請號CN 200480042792
公開日2010年10月13日 申請日期2004年4月20日
發明者紀良輝, 蔡林 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),