一種大巖桐離體再生體系建立方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及園藝植物生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種大巖桐離體再生體系建立方法。
【背景技術】
[0002]大巖桐(■spec1sa)又名六雪尼、落雪泥、巴西芙蓉等,是苦苣苔科巖桐屬多年生球根草本花卉，塊莖扁球形，葉對生，肥厚而大，密生茸毛，花朵鐘狀，色彩豐富，大而美麗，是國慶用花的理想品種。大巖桐的栽培品種繁多，花色有藍、粉紅、白、紅、紫等，還有白邊監花，白邊紅花雙色和重辦花。常見品種有威廉皇帝、挑戰、火神等，世界各地均有栽培。大巖桐喜溫暖、不耐低溫，5°C以下難以越冬，培育抗寒品種有望實現非溫室越冬，擴大種植面積，降低生產成本。
[0003]目前，大巖桐種苗主要是通過種子、球根萌發、扦插等方式進行繁育。種種方式都有各自特色，主要缺點是繁殖系數低，這很大程度上影響了其規模化發展和市場化的要求。而植物組織培養技術具有加速育種進程、縮短繁殖時間、改良植物品質、節省空間、減少勞動、可終年生產、不受自然條件限制等特點，可有效解決大巖桐種苗繁殖耗時長、繁殖系數低的問題。因此，建立大巖桐離體再生技術體系，對推動優良大巖桐園藝品種在我國的生產及應用具有重要意義。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供出一種大巖桐離體再生體系建立方法，本發明以大巖桐幼嫩葉片為外植體，經過外植體消毒、不定芽誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗及移栽等步驟建立了一種大巖桐離體再生體系建立方法，從而實現了本發明的目的。
[0005]本發明的一種大巖桐離體再生體系建立方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗I?3h后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒I?1min,用無菌水沖洗4?6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0006](2)芽誘導培養:將步驟(I)處理后的葉片切成I X Icm2長的小塊并接種到誘導培養基上，先在25?28°C條件下全暗培養I?3天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至誘導形成不定芽。
[0007](3)增殖培養:將步驟(2)培養的葉片邊緣傷口處產生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養基上進行增殖培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?5天，然后置于每天光照10?13小時，光照強度為1500?25001x,置于培養溫度為25?28°C的條件下培養2?3周后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復切割進行繼代培養，以得到更多的不定芽。
[0008](4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養20天左右即開始生根。
[0009](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3?5天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基并在多菌靈溶液中浸泡8?10s，栽入由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予60%?80%的遮陰處理。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+0.5?2mg/L6-BA+0.1?lmg/L NAA+15?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養基為:MS+0.1?lmg/L ΝΑΑ+0.5?lmg/L6-BA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養基為:l/2MS+0.1?2mg/L NAA+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]與現有技術相比本發明的優點是:本發明通過植物組織培養方法短時間內獲得大量優質大巖桐種苗的方法。以大巖桐幼嫩葉片為外植體，經過外植體消毒、不定芽誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗及移栽等步驟建立了一種大巖桐離體再生體系建立方法，為滿足對大巖桐優質種苗的需求、加速大巖桐良種的推廣具有重要的現實意義。。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0015]實施例1:
(I)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗Ih后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次,再用0.1%升汞溶液消毒lmin，用無菌水沖洗4次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0016](2)芽誘導培養:將步驟(I)處理后的葉片切成I X Icm2長的小塊并接種到誘導培養基上，先在28°C條件下全暗培養I天，然后置于每天光照10小時，光照強度為15001x條件培養30天即可誘導形成不定芽，誘導率為96%。所述的誘導培養基為MS+0.Smg/L6-BA+0.3mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0017](3)增殖培養:將步驟(2)培養的葉片邊緣傷口處產生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養基上進行增殖培養，接種后先在28°C條件下全暗培養3天，然后置于每天光照10小時，光照強度為15001x，置于培養溫度為28°C的條件下培養14天后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復切割進行繼代培養，以得到更多的不定芽。所述的增殖培養基為MS+0.5mg/L NAA+lmg/L 6_BA+30g/L蔗糖+6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0018](4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在28°C條件下全暗培養3天，然后置于每天光照12小時，光照強度為15001x，培養溫度為28°C的條件下培養18天即開始生根，生根率
100% ο
[0019](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基并在多菌靈溶液中浸泡8s，栽入由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予60%的遮陰處理，移栽成活率為98%以上。所述的生根培養基為1/2MS+0.5mg/L NAA+15g/L鹿糖+3.5?g/L瓊脂，pH為5.8。
[0020]實施例2:
(I)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗Ih后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次,再用0.1%升汞溶液消毒lmin，用無菌水沖洗4次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0021](2)芽誘導培養:將步驟(I)處理后的葉片切成IXlcm2長的小塊并接種到誘導培養基上，先在28°C條件下全暗培養3天，然后置于每天光照11小時，光照強度為15001x條件培養28天即可誘導形成不定芽，誘導率為92%。所述的誘導培養基為MS+lmg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0022](3)增殖培養:將步驟(2)培養的葉片邊緣傷口處產生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養基上進行增殖培養，接種后先在28°C條件下全暗培養5天，然后置于每天光照11小時，光照強度為20001χ，置于培養溫度為28°C的條件下培養15天后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復切割進行繼代培養，以得到更多的不定芽。所述的增殖培養基為MS+0.3mg/L NAA+0.9mg/L 6_BA+30g/L鹿糖+6.0g/L瓊脂，pH為5.8。
[0023](4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在28°C條件下全暗培養3天，然后置于每天光照12小時，光照強度為15001x，培養溫度為28°C的條件下培養18天即開始生根，生根率100%。所述的生根培養基為1/2MS+0.8mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5?g/L瓊脂，pH為5.8。
[0024](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基并在多菌靈溶液中浸泡8s，栽入由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予60%的遮陰處理，移栽成活率為96%以上。
【主權項】
1.一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗I?3h后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒I?1min,用無菌水沖洗4?6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用; (2)芽誘導培養:將步驟(I)處理后的葉片切成IX Icm2長的小塊并接種到誘導培養基上，先在25?28°C條件下全暗培養I?3天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至誘導形成不定芽； (3)增殖培養:將步驟(2)培養的葉片邊緣傷口處產生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養基上進行增殖培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?5天，然后置于每天光照10?13小時，光照強度為1500?25001x，置于培養溫度為25?28°C的條件下培養2?3周后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復切割進行繼代培養，得到不定芽； (4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養20天左右即開始生根； (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3?5天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基并在多菌靈溶液中浸泡8?10s，栽入由營養土:沙土 = 3:1混合成的基質，保持濕度并給予60%?80%的遮陰處理。
2.根據權利要求1所述的一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+0.5 ?2mg/L6_BA+0.1 ?lmg/L NAA+15 ?30g/L 鹿糖+3.5 ?6.0g/L瓊脂，pH為5.4?5.8。
3.根據權利要求1所述的一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養基為:MS+0.1?lmg/L ΝΑΑ+0.5?lmg/L 6-BA+15?30g/L鹿糖+3.5?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
4.根據權利要求1所述的一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養基為:l/2MS+0.1?2mg/L NAA+15?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L瓊脂，pH為5.4 ?5.8。
【專利摘要】本發明公開了一種大巖桐離體再生體系建立方法，涉及大巖桐（Sinningia speciosa）通過植物組織培養方法短時間內獲得大量優質大巖桐種苗的方法。本發明以大巖桐幼嫩葉片為外植體，經過外植體消毒、不定芽誘導培養、增殖培養、生根培養、煉苗及移栽等步驟建立了一種大巖桐離體再生體系建立方法，為滿足對大巖桐優質種苗的需求、加速大巖桐良種的推廣具有重要的現實意義。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686328
【申請號】CN201510085884
【發明人】楊業云
【申請人】楊業云
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月21日