專利名稱:含細菌素乳酸菌培養物的生產方法及使用它保存食品的方法
技術領域：
本發明涉及1)一種含細菌素的乳酸菌培養物的生產方法，2)用含細菌素的乳酸菌培養物保存食品的方法，3)能夠產生細菌素的乳酸菌的篩選方法。
背景技術：
為了防止食品的腐敗和品質退化，在各種食品中加入食品防腐劑。這樣的食品防腐劑，迄今為止主要是使用化學合成的食品防腐劑。然而，化學合成食品防腐劑有時會涉及對光的安全性問題，例如持久性或毒性。為了解決這個問題，人們期望開發出來源于傳統食品的安全的抗菌物質。
同時，乳酸菌是傳統上已經用于生產各種發酵食品(包括發酵飲料)，例如醬油、豆瓣醬(日本豆醬)、泡菜和日本清酒等的有用的微生物。另外，乳酸菌已被用于生產發酵食品的加工。這歸因于，由于通過乳酸發酵而產生乳酸從而體系的pH降低，因此抑制了存在于生產過程和最終產品中的污染菌的生長，從而能防止這些食品腐敗和品質退化。另外，已經證明，由乳酸菌產生的抗菌物質對于防止食品的腐敗和品質退化也有用。
抗菌物質中，由各種細菌產生的蛋白質抗菌物質被稱為細菌素。由乳酸菌產生的各種細菌素中，乳鏈菌肽是被美國食品藥品管理局(FDA)批準的公認安全(GRAS)物質，同時也被世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)批準的具有抗菌活性的安全物質。此外，乳鏈菌肽在全世界50多個國家被用作為食品防腐劑。
然而，不利的是，包括乳鏈菌肽在內的已知的各種細菌素與蛋白酶在一起很容易分解。換句話說，在生產像清酒、醬油和豆瓣醬(日本豆醬)等發酵食品的過程中，細菌素很容易被由米曲霉等產生的蛋白酶分解。所以細菌素不能維持滿意的抗微生物活性。例如，據報導，在清酒的巴斯德氏滅菌法之前加入乳鏈菌肽的情況下(公開No.JP06-319516)和加入acidocin8912作為另一個細菌素種的情況下(公開No.JP06-319516)，不能獲得抗微生物效果，這是因為在未加工的清酒中，這些種的細菌素被諸如蛋白酶的酶分解。目前，還沒有報道表明乳酸菌產生抗蛋白酶的細菌素。
另外，經過處理的肉類產品，例如火腿和香腸，是由于存在于其原材料自身的微生物或在生產過程中污染微生物而自然發酵，因此可以賦予更好的風味和可保存性。為了穩定產品質量、縮短生產周期和防止有害微生物的生長，目前，已經開發了起子培養物方法(乳酸菌科學技術，聯合出版中心，1996年，239頁)。
例如，Chung等人披露了在乳鏈菌肽溶液中浸漬未煮過的肉的效果或在預先注射特定菌種的新鮮的可食用肉上放置乳鏈菌肽的效果。根據報告，用于新鮮的食用肉的乳鏈菌肽很快就失去了活性(Env.Microbiol.55(6)1329-1333頁(1989))。這是由于乳鏈菌肽在食用肉內被諸如組織蛋白酶的蛋白酶分解而很快失去抗菌活性。
為了防止類似上述乳鏈菌肽的酶分解，一項包括熱處理食用肉、隨后將諸如乳鏈菌肽的羊毛硫氨酸基細菌素施于熱處理食用肉的表面上的發明被報道(公開號JP06-22685)。然而，食用肉在加入乳鏈菌肽之前應該加熱處理。因此，該發明的使用范圍多少受到限制。
目前在食品工業上，迫切要求提供適用于各種食品包括發酵食品和經加工的肉類制品的抗蛋白酶細菌素。

發明內容
如上所述，乳酸菌傳統上已經用于處理各種食品包括發酵食品，而且從來沒有引起任何安全問題。另外，由乳酸菌產生的抗菌物質被認為比化學合成物質安全。因此，本發明的目的是提供1)一種含細菌素的乳酸菌培養物的生產方法；2)用含所述細菌素的乳酸菌培養物保存食品的方法；和3)能夠產生抗蛋白酶細菌素的乳酸菌的篩選方法。
為了解決這個課題，發明人對存在于諸如發酵牛奶等發酵食品中的乳酸菌進行了分離，并篩選了產生新的抗蛋白酶細菌素的菌株。因此，發明人成功地分離了產生那種物質的乳酸菌。發明人證實，由所述菌株產生的細菌素是新物質。以下詳細描述本發明。
(1)一種含抗蛋白酶的細菌素的乳酸菌培養物的生產方法。
(2)如(1)所述的方法，其中，乳酸菌屬于Weissella、小球菌屬、乳桿菌屬或白聯珠菌屬中的任何一個屬。
(3)在(2)中所述的方法，其中，屬于Weissella屬的乳酸菌是Weissella屬FERM P-19577、Weissella cibaria JCM12495，Wissella confusa JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleri JCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890或Weissella thailandensis JCM10694中的任何一個。
(4)在(2)中所述的方法，其中，屬于小球菌屬的乳酸菌是戊糖片球菌。
(5)在(2)中所描述的方法，其中，屬于乳桿菌屬的乳酸菌是植物乳桿菌、Lactobacillussalivarius或Lactobacillus pentosus中的任何一個。
(6)在(2)中所描述的方法，其中，屬于白聯珠菌屬的乳酸菌是Leuconostoe citreum、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc argentinum、Leuconostoccamosum或Leuconostoc mesenteroides中的任何一個。
(7)一種保存食物產品的方法，其中，(1)至(6)中任何一個所述的乳酸菌培養物被用于食品的生產過程。
(8)如(7)中所述的方法，其中，食品為發酵食品或加工過的肉類制品。
(9)一種篩選產生細菌素的乳酸菌的方法，其包括篩選所述細菌素即使在蛋白酶存在的情況下也具有抗菌活性的乳酸菌培養物的步驟。
以下詳細描述本發明。
在亞美尼亞，通常也作為一個長壽國家為人所知，現在已經知道了大量傳統上配制給病人的健康食品。例如，食品包括諸如Matsoon和Narine、干杏、紅葡萄酒、jyesiin和tiinaff的乳酸食品。發明人將注意力主要集中在亞美尼亞人們食用的發酵牛奶Matsoon和作為發酵食品原料的清酒曲(koji)上，展開研究工作。
在本發明中，“具有蛋白酶耐性的細菌素”或“耐蛋白酶細菌素”是指即使在有來源于米曲霉的蛋白酶存在的情況下仍然具有抗菌活性的細菌素。也包括其抗菌活性會被淀粉酶降低的細菌素。
乳酸菌培養物，包含“具有蛋白酶耐性的細菌素”或“耐蛋白酶細菌素”，是指形成指示菌株抑制區的培養物，在下述方法中將作具體說明(1)根據普通的培養法(或用于分離微生物的培養法)配制乳酸菌培養物。用氫氧化鈉溶液調節乳酸菌培養物的pH至pH5.5-6.0。隨后，在12,000rpm轉速下將培養物離心10分鐘，用一次性注射器過濾裝置“Dismic-25cs”，0.45μm的醋酸纖維素(ADVANTEC公司)過濾，濾液作為樣品。如果樣品的抗菌活性低，需要將樣品在室溫下減壓濃縮至4倍。必要時，濃縮至10倍。
(2)使用Listeria innocua ATCC33090T、Bacillus circulans JCM2504T、Bacillus coagulansJCM2257、Micrococcus luteus IFO12708、Bacillus subtilis JCM1465T、Bacillus subtilisIAM1381、Lactococcus lactis sub sp.Lactis ATCC19435、Enterococcus faecium JCM5804T、Enterococcus faecium JCM5803T、Lactobacillus plantarum ATCC14917T和Lactobacillus sakeiJCM1157T作為指示菌株，通過后述菌苔上點樣法(SPOT-ON-LAWN)或菌落形成單位數的測定來選擇具有最強抗菌活性的指示菌。
(3)酶，使用來源于曲霉(UMAMIZYME G，Amano Enzyme Co)的蛋白酶。
(4)在如(1)所述的樣品中添加10至100unit/ml的(3)所述的蛋白酶，在30℃下反應1小時以上。
(5)將表現出(2)中所述的最強抗菌活性的指示菌株涂在中厚板上，例如指示菌可以生長的MRS中厚板，在中厚板的中心處滴下0.01毫升如(4)所述的蛋白酶處理過的樣品，在適合指示菌生長的最適溫度下(對于Listeria innocua，凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，Enterococcus faecium或Pediococcus pentosaceus是37℃，對于其他菌是30℃)培養20至24小時。然后，可以觀察到指示菌的抑制區。
本發明的能夠產生耐蛋白酶的細菌素的乳酸菌是從發酵食品等中分離出來的。當然，也可以使用通過下述篩選方法獲得的具有抗菌活性的乳酸菌。換言之，任何產生耐蛋白酶的細菌素的乳酸菌都適宜使用，而對于從哪種菌中分離出來的沒有特殊的限制。根據發明人研究的結果，發現乳酸菌當中，Weissella屬、小球菌屬(Pediococcus)、Lactobacillus屬、Leuconostoc屬等產生所期望的耐蛋白酶細菌素。不言而喻，除上述以外，只要是能夠產生耐蛋白酶細菌素的乳酸菌，都可以使用。
通過在生產醬油、味噌和魚醬等各種發酵食品以及火腿、香腸等各種加工過的肉制品的工藝中使用含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物，所述含耐蛋白酶細菌素的培養物是通過培養能夠產生耐蛋白酶細菌素的乳酸菌而得到的，這樣就可以防止目標食物的腐敗和品質退化。細菌素可以分離后使用。或者，也可以不需分離直接將包含細菌素的培養物用作細菌素。由于分離等純化過程通常很麻煩，所以優選將乳酸菌培養物本身添加到生產各種發酵食品的工藝中。此外，含有耐蛋白酶細菌素的培養物在生產發酵食品、加工過的肉制品等的工藝中可以添加一次或多次。細菌素或液體培養基被分成多少份添加可以自由決定。
為獲得預期的包含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物，乳酸菌應該被培養。培養條件，例如培養溫度、培養次數、培養方法和培養基可以選擇通常用來培養乳酸菌的培養條件。另外，凝膠過濾等常規的分離和純化方法也可以用來分離。本發明的乳酸菌培養物是指含有被培養的乳酸菌的培養基或通過離心等除去所培養的乳酸菌的培養基。培養基可以是液體、固體或凝膠狀物。當使用液體培養基時，有時也寫成乳酸菌培養液。當然，乳酸菌培養物包括乳酸菌培養液。另外，本發明的乳酸菌培養物包括，通過噴霧干燥、冷凍干燥等得到的液體乳酸菌培養物的干粉，通過過濾、蒸發等得到液體乳酸菌培養物的濃縮液或糊狀物，通過凝膠過濾、層析法等得到的具有抗菌活性的液體乳酸菌培養物的一部分。
含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物可以被添加到任何食品中，對比并沒有特殊的限制。最好為，將培養物添加到在生產過程中引入微生物的發酵食品和加工過的肉制品中。
發酵食品包括醬油、魚醬、清酒、豆瓣醬、味噌、泡菜、乳酪等。這些只是一部分例子，含有耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物可以用于除上述例子之外的食品中。
發酵食品中，一直以來使用氯化鈉作為抑菌劑。由于近年來對低鹽飲食需求的增加以及通過在發酵作用中降低鹽或除去鹽可以加快蛋白質分解速率的優勢，已經開展了在發酵食品中使用諸如乳鏈菌肽的細菌素的研究工作。然而，由于乳鏈菌肽和各種細菌素被存在于生產過程中的蛋白酶分解，所以目前還沒有觀察到抑菌力。在這樣的生產發酵食品的工藝中，也可以使用含有耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物。
另外，加工過的肉制品包括，例如火腿和香腸。當然，這只是舉一些例子。含有耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物可以用于除上述例子之外的食品中。
添加了包含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物的食品，例如發酵食品和加工過的肉制品等，具有非常高的耐存儲性。
在以下的實施例中，描述作為本發明的一個重要方面的產生耐蛋白酶細菌素的乳酸菌的篩選方法，在這些實施例中，乳酸菌是從發酵食品Matsoon中分離出來的。
將從發酵食品之一的發酵牛奶Matsoon中收集的樣品在乳酸菌能夠生長的培養基中培養，所述培養基有例如MRS培養基(表1)或M17培養基(表2)，培養溫度為30℃至37℃，放入培養基的樣品量是0.5％。培養天數為1天、5天或10天。培養結束后，將培養液涂布在包含0.5％碳酸鈣的瓊脂培養基(瓊脂1.2％)上并培養。從產生的菌落中收集乳酸菌。
表1.MRS培養基的組成


表2.M17培養基的組成


將收集的乳酸菌按前述方法培養。接著，將來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)蛋白酶的Umamizyme G(Amano酶公司)經過濾后添加到MRS瓊脂培養基，在上述MRS瓊脂培養基的平皿內接種并培養這些乳酸菌24小時。隨后，將預先混合了指示菌株的LactobacilliAOAC培養基(表3)疊加在平皿上，培養24小時，形成指示菌株的抑制區。
表3.Lactobacilli AOAC培養基的組成




關于添加蛋白酶的方法，除了將蛋白酶混合在瓊脂培養基內的方法外，還可以使用例如以下方法。
1)將蛋白酶和指示菌株一起混合至培養基內的方法。
2)在瓊脂培養基上涂布蛋白酶的方法。
3)在培養乳酸菌菌落時添加蛋白酶的方法，在這種情況下，蛋白酶可以在開始培養時、在培養期間內、或培養結束后添加。
4)將樣品適量滴在混合了指示菌株的培養皿上，觀察抑制區形成的方法，其中，所述樣品是在培養乳酸菌菌落、然后將培養液中的菌體滅菌或殺死之后，添加了蛋白酶的樣品。再次說明，方法不局限于1)至4)所述的方法。另外，蛋白酶不局限于Umamizyme G。
然后，通過分析抗菌譜進行評價。采用菌苔上點樣法(spot-on-lawn)在培養皿上點樣具有抗菌活性的乳酸菌培養物的上清液，考察如下所述的抗菌活性，考查抗菌譜。
首先配制具有抗菌活性的樣品。將由上述方法獲得的具有抗菌活性的菌株培養液在10,000rpm下離心10分鐘，從而獲得培養物上清液。然后通過過濾器過濾上清液來獲得無菌樣品。將樣品每次稀釋2倍，直至配制成稀釋級數為211的稀釋系列。當活性比較低的情況下，在室溫下每次將樣品減壓濃縮2倍，逐漸配制濃度級數至2-3。
然后，培養欲混合在培養皿上來考查抗菌活性的指示菌株。在TSBYE培養基(表5和6)或MRS培養基上培養表4所示的指示菌株。桿菌屬和小球菌屬是用振蕩器培養而其他菌是靜置培養。另外，凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、李斯特菌屬(Listeria)、小球菌屬(Pediococcus)和腸球菌(Enterococcus)在37℃培養而其他菌則在30℃培養。
表4.評價抗菌活性指示菌株




表5.TSBYE培養基的成分


表6.TSB培養基的成分


此外，配制考查抗菌活性的平皿在121℃對10毫升MRS瓊脂培養基(瓊脂1.2％)和5毫升Lactobacilli AOAC瓊脂培養基(瓊脂1.2％)分別滅菌15分鐘，然后，保持溫度55℃。將滅菌后的MRS瓊脂培養基傾注在無菌的陪氏培養皿，然后放置在凈化操作臺上1小時。隨后，將50ml的指示菌株培養液混合在Lactobacilli AOAC瓊脂培養基，保持溫度為55℃。將培養液傾注在MRS平皿上。在凈化操作臺上打開平皿的蓋子(大約15分鐘)，干燥表面。
將如上所配制的10μl每一種具有抗菌活性的樣品滴加到平皿上。然后，蓋上蓋子，按照原樣放置大約一小時，干燥平皿。在適宜于各個指示菌株的溫度下培養平皿20小時，來考查抑制區的形成。這里，抗菌活性(AU/ml)定義如下
抗菌活性(AU/ml)＝(形成抑菌圈的最大稀釋比)×1000/10按這種方式進行了抗菌譜分析的樣品具有蛋白酶耐性，表現出廣泛的抗菌譜。
考查按上述方法篩選的乳酸菌菌株AJ110263的細菌學性質。根據16S核糖體DNA(rDNA)核苷酸序列的同源性分析(Altschul，S.F.Madden T.F.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.Miller，W.，Lipman，D.J.(1997)Gapped BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質數據庫查找程序(a new generation of protein database search programs)。核酸研究(Nucleic Acids Res.)。253389-3402.)。菌株具有與Weissella confusa菌株ATCC 1088198.22％的同源性(表7)。同源性評價使用保藏在美國標準菌庫(ATCC)的標準培養物(type culture)。
表7.菌株AJ110263的16S rDNA同源性


一般認為，菌株的基本特性(表8)與乳酸菌的一般性狀一致，且糖發酵模式(表9)與Weissella confusa的發酵模式相似。然而，根據菌株L-阿拉伯糖的發酵模式不同以及菌株在16S rDNA上不具有100％的同源性，可以認為菌株是不同于任何已知的菌的新菌株。因此，將菌株命名為Weissella sp.AJ110263。菌株保藏在國際專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)(IPOD)，高級工業科學技術國家研究院(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST))，保藏號是FERM P-19577。
表8.乳酸菌菌株AJ110263的基本特性




表9.乳酸菌菌株AJ110263的糖發酵特性


具體實施方式
現在結合以下實施例說明本發明。然而，本發明并不局限于這些實施例。
實施例1預先培養從發酵牛奶Matsoon中分離的Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)和來自典型培養物的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JCM5890、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)JCM1149、Lactobacillus salivariusJCM1231，然后在MRS培養基(表1)中培養。Weissella sp.在30℃培養而其他菌株則在37℃培養。在分別添加了表3所示的0U/ml(未添加)、200U/ml和400U/ml的Umamizyme G的MRS培養基上接種乳酸菌，培養24小時。
培養是這樣實施的在500毫升Sakaguchi燒瓶內裝入100毫升MRS培養基，然后接種100ml每一種前培養液，在100次/分的振蕩下振蕩培養。
接著，覆蓋混合了Lactobacillus sakei菌株JCM1157作為指示菌株的Lactobacilli AOAC培養基。將這些平皿培養24小時。從而，形成指示菌的抑制區(表10)。結果表明每個菌株都產生耐蛋白酶細菌素。
表10.產生PRB菌株的抑制區直徑(毫米)


Lactobacillus sakei strain JCM1157被用作指示菌株。表中的數值表示生長抑制區的直徑。
實施例230℃下在MRS培養基上培養Lactococcus lactis NCDO497(乳鏈菌肽A產生菌)和Lactococcus lactis NCIMB702054(乳鏈菌肽Z產生菌)。與實施例1同樣的方法，用Lactobacillus sakei菌株JCM1157作為指示菌株評價抗菌活性。
另外，用1000IU/ml的乳鏈菌肽A溶液(ICN Biomedical Inc.(ICN生物醫學公司))代替使用乳鏈菌肽產生菌，在MRS瓊脂培養基平皿上點樣10μl，評價抗菌活性。
在沒有蛋白酶的情況下，形成指示菌株的抑制區。在有蛋白酶存在的情況下，當蛋白酶濃度較高時(表11)活性降低。
表11.不產生PRB菌株的抑制區直徑(毫米)


Lactobacillus sakei strain JCM1157被用作指示菌株。表中的數值表示生長抑制區的直徑。
ND＝未檢出實施例3培養Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、Lactococcus lactis NCDO497(乳鏈菌肽A產生菌)和Lactobacillus sakei JCM 1157菌株。在10,000rpm下離心培養液10分鐘，來獲得培養物上清液。向上清液添加2000U/mlUmamizyme、用酶處理24小時后，用過濾器(DISMIC25CS，ADVANTEC；0.45μm)過濾上清液，配制無菌樣品。使用菌苔上點樣法(spot-on-lawn)考查抗菌譜。結果，與乳酸菌肽產生菌的培養液和不產生細菌素的Lactobacillus sakei JCM1157的培養液相比，Weissella sp.AJ110263(FERM P 19577)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885即使在經過蛋白酶處理后仍然保持抗菌活性(表12)。這表明Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus JCM5885)產生耐蛋白酶細菌素。
表12




培養液用蛋白酶處理后，用菌苔上點樣法評價上清液。數值表示抗菌活性。抗菌活性(AU/ml)＝(形成抑菌圈的最大稀釋比)×1000/10，ND＝未檢出實施例4按照實施例3所述的方法，用酶處理Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)JCM1149、Lactobacillus salivarius JCM1231、Leuconostoc citreum JCM9698、Leuconostocpseudomesenteroides JCM9696、JCM11045和Lactococcus lactis NCIMB702054(乳鏈菌肽Z產生菌)菌株的培養物上清液。枯草桿菌(Bacillus subtilis)IAM1381被用作指示菌株。使用與實施例3同樣的來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的Umamizyme G作為酶。另外，將來源于枯草桿菌(Bacillus subtilis)的α-淀粉酶(Wako Pure化學藥品有限公司)以100U/ml的量添加至乳酸菌培養液中，在30℃使其反應一小時以上。然后，按同樣的方法以枯草桿菌(Bacillus subtilis)IAM1381作為指示菌株，采用菌苔上點樣法評價抗菌活性，研究α-淀粉酶對抗菌活性的影響。如表13所示，Weisella sp.AJ110263(FERM P-19577)、Weissella cibariaJCM12495、Weissella confusa JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleriJCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890、Weissellathailandensis JCM10694、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JCM5885、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149、Lactobacillus salivarius JCM1231、Lactobacillus pentosusJCM1558、Leuconostoc citreum JCM9698、Leuconostoc pseudomesenteroides JCM9696、JCM 11045、Leuconostoc argentinum JCM11052、Leuconostoc carnosum JCM9695、和Leuconostoc mesenteroides JCM6124即使經過蛋白酶處理后仍然保持抗菌的活性。因此，發現這些菌株產生耐蛋白酶的細菌素。
表13.酶處理后的殘存抗菌活性


實施例5分別將大豆(10g)和純水(10毫升)放進六個錐形瓶(體積200ml)，在高壓鍋內120℃下滅菌30分鐘。冷卻后，添加0.04g曲霉(koji mold)(醬油用紫色1 NO.1菌)，30℃下靜置培養2天。將40毫升無菌純水添加到培養樣品(樣品No.1)中，40毫升鹽水添加至SampleNo.2中調整樣品含鹽量至18％，40毫升Lactococcus lactis NCIMB702054(乳鏈菌肽Z產生菌)培養物上清液添加至樣品No.3，以及40毫升Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)的培養物上清液添加至樣品No.4，40毫升Pediococcus pentosaseceus JCM5885的培養物上清液添加至樣品5，40毫升Lactobacillus salivarius JCM1231的培養物上清液添加至樣品6。用過濾器過濾過的6N鹽酸和6N NaOH調節產物混合物至pH6.5-7.0。
200μl在TSBYE培養基內30℃下用振蕩器振蕩培養20小時的枯草桿菌IAM1381另外地接種、充分混合、30℃下培養。在培養的第1、2、7天，收集培養液在GAM瓊脂培養基(GAM肉湯“NISSUI”，Nissui藥物有限公司)上計算枯草桿菌IAM1381的活細胞數。在純水樣品中存在的污染菌枯草桿菌IAM1381為每克108細胞以上。在18％的含鹽樣品中沒有發生污染。同時，在加入不含鹽的乳鏈菌肽上清液的情況下，在第1天及以后乳鏈菌肽被來源于曲霉的蛋白酶分解。因此，產生每克108細胞以上的污染，沒有觀察到抗菌效果。
然而，在使用Weissella sp.AJ110263(FERM P-19577)、Pediococcus pentosaseceusJCM5885和Lactobacillus salivarius JCM1231的上清液的情況下，從發酵的第1天到第7天都沒有觀察到污染菌枯草桿菌IAM1381(表14)。
表14.在醬油的生產工藝中使用細菌素代替鹽的測試


PRB耐蛋白細菌素實施例6將在MRS培養基上培養Lactococcus lactis NCIMB702054(乳鏈菌肽Z產生菌株)和Weissella sp.AJ11026(FERM P-19577)獲得的培養液用氫氧化鈉調節至pH5.5。接著，通過離心從調整過pH的培養物液體中除去菌以制備上清液。上清液和包含乳酸菌的培養液被用于下述實驗。
分別將5g日本牛肉青絲的肉餡放進六個無菌Falcon管(Becton Dickinson公司，體積50ml)、向肉中添加5毫升鹽水(樣品No.1)，向樣品No.2中添加5毫升18％鹽水，向樣品No.3中添加5毫升Lactococcus lactis NCIMB702054的上清液，向樣品No.4中添加5毫升Lactococcus lactis NCIMB702054培養液，向樣品No.5中添加5毫升Weissella sp.AJ11026的上清夜，向樣品No.6中添加5毫升Weissella sp.AJ11026的培養液。進而，將在TSBYE培養基內37℃靜置培養24小時的Listeria irmocua ATCC33090添加至樣品中，添加量為108cfu/ml，讓樣品在室溫下熟化。收集熟化一天和七天的樣品，在李斯特菌屬(Listeria)選擇培養基(Oxoid公司)上計算Listeria innocua ATCC33090的活細胞數。如表15所示，在鹽水樣品中，存在污染菌Listeia innocua ATCC33090數目為106cfu/ml以上，在18％鹽水樣品中，存在污染菌Listeia innocua ATCC33090數目為105cfu/ml以上。在加入培養物肉湯或產生乳鏈菌肽的乳酸菌的上清液的情況下，由于乳鏈菌肽被來源于肉類(組織蛋白酶)的蛋白酶分解，所以存在污染菌Listeia innocua ATCC33090的數目為106cfu/ml以上。然而，在使用培養肉湯或Weissella sp.AJ11026(FERM P-19577)的上清液的情況下，在熟化的第一天直到第七天污染菌Listeia innocua ATCC33090能夠被減少到103cfu/ml。
表15




PRB耐蛋白細菌素FFA游離氨基酸另外，考查了抗菌譜，結果表明，除Enterococcus faecium之外，細菌素對引起食物中毒的李斯特菌屬和生產醬油和味噌糊過程中有害的枯草桿菌具有生長抑制作用。
也考查對pH和溫度的穩定性，新的細菌素甚至在pH2至4的條件下也能保持大約50％的活性在pH2至pH11的很寬的范圍內，抗菌活性穩定。尤其，在pH4至pH6左右細菌素具有很強的抗菌活性。另外，甚至在100℃加熱10分鐘后，細菌素仍然保持大約50％的活性。因此，細菌素具有很好的熱穩定性。
工業實用性通過在發酵食品的生產過程中添加由例如Weissella sp.、戊糖片球菌、植物乳桿菌和Lactobacillus salivarius等產生的含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物，可以提供良好的保存食品的方法。
權利要求
1.一種含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物的生產方法。
2.如權利要求
1所述的方法，其特征在于，乳酸菌屬于Weissella屬、小球菌屬、乳桿菌屬或白聯珠菌屬中的任何一個屬。
3.如權利要求
2所述的方法，其特征在于，屬于Weissella屬的乳酸菌是Weissella sp.FERMP-19577、Weissella cibaria JCM12495，Wissella confusa JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleri JCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890或Weissella thailandensis JCM10694中的任何一個。
4.如權利要求
2所述的方法，其特征在于，屬于小球菌屬的乳酸菌是戊糖片球菌。
5.如權利要求
2所述的方法，其特征在于，屬于乳桿菌屬的乳酸菌是植物乳桿菌、Lactobacillus salivarius或Lactobacillus pentosus中的任何一個。
6.如權利要求
2所述的方法，其特征在于，屬于白聯珠菌屬的乳酸菌是Leuconostoc citreum、Leuconostoc pseudomesenteroides、Leuconostoc argentinum、Leuconostoccarnosum或Leuconostoc mesenteroides中的任何一個。
7.一種保存食品的方法，其特征在于，在食品的生產過程中使用如權利要求
1至6中任何一項所述的乳酸菌培養物。
8.如權利要求
7所述的方法，其特征在于，所述食品為發酵食品或加工過的肉制品。
9.一種產生細菌素的乳酸菌的篩選方法，它包括篩選即使在蛋白酶存在的情況下也具有抗菌活性的乳酸菌培養物的步驟。
專利摘要
通過培養諸如Weissella屬等的乳酸菌來生產含耐蛋白酶細菌素的乳酸菌培養物，在食品中使用所述培養物可以改進食品的耐存儲性。
文檔編號C12Q1/04GKCN1875110SQ200480032154
公開日2006年12月6日 申請日期2004年11月5日
發明者上原章敬, 取出恭彥 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan