專利名稱::石豆蘭提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域:
:本發明涉及具有抑制NO生成活性的石豆蘭提取物及其制備方法。
背景技術:
:困擾人們的日常炎性疾病包括,關節炎癥例如骨關節炎、類風濕性關節炎、類風濕性脊椎炎、痛風關節炎等;炎性皮膚病例如濕疹、牛皮癬、皮炎等;炎性眼疾例如眼色素層炎、結膜炎等;肺部疾病例如哮喘、支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合癥等;菌血癥、那毒素血癥、口瘡潰瘍、齦炎、胰腺炎等;胃腸道疾病例如節段性回腸炎、萎縮性胃炎、潰瘍性結腸炎、腹腔炎、消化性潰瘍、應激性腸道綜合癥例如由幽門螺旋桿菌感染而引起的粘膜炎癥或者由非甾體類抗炎藥引起的腸胃病等等。有關各種炎癥致病作用的機理是已知體內一氧化氮(N0)是介導細胞免疫和炎癥的毒性物質。其前體是左旋精氨酸(L-arg),L-arg末端胍基上的2個相同的氮原子之一在N0合成酶(N0S)的作用下生成N0。目前已經分離出三種不同類型的NOS,包括內皮NO合成酶(eN0S),神經元N0合成酶(nN0S)及誘導型NO合成酶(iN0S)。目前已知,巨噬細胞、肝細胞、平滑肌細胞、腺癌細胞以及上皮細胞均能表達iN0S。某些炎性細胞因子和微生物產物如脂多糖(LPS)則可誘導iN0S表達。iNOS—旦被誘導即可表達出高度活性,產生大量N0。因此,長時間以來,人們致力于尋找N0合成酶的抑制劑來治療與之相關的炎性疾病。但這些抑制劑大多局限于化學合成的物質,副作用較大。現有技術中未見從天然中草藥植物中提取抗炎活性物質的報道。石豆蘭(BulbophgllumradiatumLindl),蘭科植物,主要分布于中國長江以南的地區。在中國民間使用其新鮮植物(常用量820g),具有平喘、活血、消腫止痛、治療四肢麻痹等抗炎作用。但迄今為止,對于石豆蘭的化學成分及生物活性的研究報道較少。在中國專利公開號為CN1458154A"—種新的抗腫瘤化合物石豆蘭酚甲"中公開了一種化合物石豆蘭酚甲(bulbophylolA)的結構式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>[0008]在中國專利公開號為CN1458155A"—種新的抗腫瘤化合物石豆蘭酚乙"中公開了一種化合物石豆蘭酚乙(bulbophylolB)的結構式為在以上兩個專利申請說明書中通過核磁共振分析了所公開的化合物的基本數據,并以體外培養的宮頸癌HeLa細胞為模型考察所公開的化合物的抗腫瘤活性。都沒有涉及分離、確定石豆蘭中的抗炎活性成分。因此本發明從石豆蘭中提取具有明確抗炎活性的組分,其安全無毒,并能有效地抑制NO的生成,達到抗炎作用。發明公開本發明的發明目的是從藥用植物石豆蘭中提取具有明確抗炎活性的組分,其能有效地抑制NO的生成,達到抗炎作用。本發明提供了一種石豆蘭提取物l,其具有如下的結構式石豆蘭提取物l,其具有抑制NO生成的活性。本發明還提供了一種石豆蘭提取物2,其具有如下的結構式OH(!)CH3石豆蘭提取物2,其具有抑制NO生成的活性。本發明還提供了一種石豆蘭提取物3,其具有如下的結構式石豆蘭提取物3,其具有抑制NO生成的活性。本發明涉及一種從藥用植物石豆蘭(BulbophgllumradiatumLindl)中分離活性化合物的方法,其特征在于包含如下的步驟1)制備石豆蘭的乙醇提取物;經過乙醇浸泡提取重復2次,合并這些提取液,經減壓濃縮得到褐色粉末提取物;2)將該粉末提取物溶解在水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作為洗脫液分別提取;6[0026]3)對步驟2)中的乙酸乙酯、石油醚洗脫液利用柱層析進行分離;4)對步驟3)中收集到的洗脫液進行減壓濃縮,進一步分離精制;對步驟4)中分離得到化合物進行理化特性分析以確定其結構;對石豆蘭提取物進行NO生成抑制活性和毒性測試。其中,優選石豆蘭的乙醇提取液濃度是60%;其中,層析柱可以在硅膠柱或S印hadenLH-20柱中選擇;而洗脫劑可以在氯仿甲醇(體積比為ioo:o,95:5,90:io,85:15,80:20,70:30,60:40,50:50,o:100)、或正己烷乙酸乙酯(體積比為ioo:o,95:5,90:io,85:15,80:20,70:30,60:40,50:50,o:100)、或正己烷丙酮(體積比為100:o,95:5,90:10,85:15,so:20,70:30,60:40,50:50,0:100)中選擇。其中,減壓濃縮優選是在4(TC條件下進行的。其中,精制的方法為使用HPLC,流動相甲醇_H20=1:l,流速4ml/min,在室溫下制備;或HPLC(AQVSAILSS4251SenshuScientificCo、Ltd、10X250mm),流動相正己烷丙酮=7:3,流速4ml/min。室溫下制備。其中的理化特性分析技術包括核磁共振技術。其中,NO生成抑制活性測試是利用小鼠巨噬細胞系RAW264.7通過griess法進行分析的。其中的毒性作用是通過匪T細胞毒性試驗進行分析的。—種石豆蘭提取物6,其特征在它具有如下的理化參數13C_NMR丄H-NMR性狀無色油狀1136.2sEI-MS(m/z)2722102.4d6.36d(2.2)HR-EI-MS(m/z)實測值272.10543148.7s計算值272.10494133.3s分子量272.15143.5s分子式CieHi6046107.6d6.37d(2.2)UV入ma/eOHnm(log£)1'143.3s202(4.35)2'115.4d6.64m207(3.40)3'155.5s275(3.27)4'112.8d6.64mTDKBr—1IRv隨cm5'129.5d7.15t(7.6)3464,2950,6'121.0d6.78d(7.6)2858,2781,a37.9t2.81brs1632,1589a,37.7t2.81brs1350,9260CH356.5q3.85s0CH20101.2t5.82s7[0039]化合物6是從石豆蘭中按照上述方法分離得到的—種石豆蘭提取物7,其特征在它具有如下的理化參數<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>[0042]化合物7是從石豆蘭中按照上述方法分離得到的。本發明還涉及上述石豆蘭提取物1、2、3在制備治療與NO生成相關的炎癥的藥物中的應用。本發明所取得的有益技術效果是首次從石豆蘭中分離得到具有明確抗炎活性的提取物,其作為天然的NO生成抑制劑,克服了化學合成物質的毒副作用。最佳實施方式實施例1:提取物的制備與結構的確定1、石豆蘭的提取物制備將9.5kg的石豆蘭全草粉碎,加入60%乙醇(乙醇水=6:4)至55升,室溫浸泡12小時,然后再加熱回流1小時,得浸出液。其濾渣再一次用60%乙醇55升如上法提取,與上次提取液合并,在4(TC減壓濃縮,得到260.3g褐色粉末。把全部的粉末萃取物溶解于2升水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各2升分3次萃取,這些萃取液中的乙酸乙酯萃取物4(TC下減壓濃縮,得到32.6克的褐色粉末。將乙酸乙酯提取物32.6g上硅膠柱進行分離,洗脫劑分別為氯仿甲醇體積比(下同)=ioo:o,95:5,90:io,85:15,80:20,70:30,60:40,50:so,o:100,分別收集2升的洗脫液。收集氯仿甲醇=100:0的洗脫餾分,在4(TC下減壓濃縮得到濃縮物4.7314g。將所得濃縮物進行硅膠柱層析,收集氯仿甲醇=90:10的餾分,4(rc減壓濃縮,用正乙烷乙酸乙酯=90:IO重結晶,得無色針狀結晶化合物式(1)(490mg),未見文獻記載。收集氯仿甲醇=90:10的洗脫餾分,40。C減壓濃縮。利用S印hadenLH-20對濃縮物8.1625g進行分離,以氯仿甲醇=7:3為洗脫劑,每40ml為一餾分,收集第18至25餾分,4(TC減壓濃縮,得0.9056g濃縮物,然后上制備HPLC,流動相甲醇H20=1:1,流速4ml/min,在室溫下制備。紫外檢測波長254nm。收集保留時間分別為16分42秒與23分11秒的峰,每瓶5ml4(TC減壓濃縮收集的餾分,分別得無色針狀結晶化合物2(21.8mg)以及化合物3(22.lmg)。兩個化合物均未見文獻報道。收集乙酸乙酯萃取物的氯仿甲醇=90:io的洗脫液,在4(rc減壓濃縮,得到濃縮物8.1625g上S印hadenLH-20(PharmaciaBiochem,7X15cm)進行柱層析,以氯仿甲醇=1:1作為洗脫劑,每40ml為一個餾分。收集第21至42的餾分,4(TC減壓濃縮。將所得的1.0832g濃縮物上HPLC(AQVSAILSS4251SenshuScientificCo、Ltd、10X250mm),流動相正己烷丙酮=7:3,流速4ml/min;室溫下制備;紫外檢測波長254nm,收集保留時間分別為8分15秒、13分24秒、18分14秒的流分。40°C減壓濃縮收集液,得白色固體化合物4(11.6mg)。無色油狀化合物5(12.lmg)以及無色油狀化合物6(18.5mg),化合物4(Majumder,P.LandBasak.M.,TwobibenzylderivativesfromtheorchidCirrhopetalumandersonii,Phytochemistry,30(1),321-324(1991))及化合物5(Asahina,Hiroshi;Yoshikawa,Hiromichi;Shuto,Yoshihiro.EffectsofbatetesinIIIanditsanalogsongibberellicacid-d印endenta—amylaseinductioninembryolessbarleyseedsandoncressgrowth,Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,62(8),1619-1620,(1998).)為已知化合物,化合物6未見文獻報道。石油醚洗脫液濃縮得29.3g褐色粉末,進行硅膠柱(青島海洋化工廠)層析,洗脫劑為正己烷乙酸乙酯=ioo:o,95:5,90:io,85:15,80:20,70:30,60:40,50:50,0:100,分別收集2升。4(TC減壓濃縮95:5的洗脫液。將濃縮物1.2411g進行硅膠(青島海洋化工廠)柱層析,洗脫劑為正己烷丙酮=ioo:o,95:5,90:io,85:15,80:20,70:30,60:40,50:50,0:100,各收集300ml,40。C減壓濃縮90:10洗脫部分的第23至29餾分。將0.2101g濃縮物在正己烷與丙酮的混合溶劑中重結晶,得白色結晶化合物7(21.4mg)。化合物7未見文獻報道。2、確定結構式化合物1-7的性狀見表1,13C_NMR與力-NMR的數據見表2。并由以上數據最終確定了化合物的結構式。表1化合物1-3的性狀化合物1化合物2化合物39<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0058]表2化合物1-7的NMR數據(ppm、CDC13、500MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0060]<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>[0064]表2續<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中化合物1-3的結構確定如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>123實施例2抑制NO生成的活性由于干擾素r以及脂多糖剌激而產生的巨噬細胞對NO生成的阻礙效果(抑制NO生成的效果)通過下面的實驗方法求得。并且根據阻礙效果的IC5。(um)來評價NO生成的抑制效果。[0073]所用材料RAW264.7細胞(大日本制藥)N-l-鹽酸萘乙二胺(lg和光純藥)磺胺(500g和光純藥)Ham'sF12培養基(SIGMAN488500mL)IFN_Y(Geneyme/Techne100lig)脂多糖(LPS,055:B510mg,Sigma)磷酸(500ml和光純藥)DMSO(500ml和光純藥)96孔微滴定板(50/盒住友電木,商品名〔8096R〕)微滴定板記數器(BIO-RAD3550)NO生成抑制活性的試驗方法調整RAW264.7細胞的濃度至1-5X105個/ml,分注于96孔板,每孔2Q0ul,置于(A孵箱中,傳代l個小時。加入檢體后,加入脂多糖2ul。在C0J桴箱中培養16小時。調整最終濃度至干擾素r(IFN-r)O.33ng/ml,LPS100ng/ml。將檢體溶解于DMSO,調整含量至0.2%。在顯微鏡下觀察細胞并進行MTT實驗。細胞毒性通過MTT法、由鏡檢確定。MTT法是已知的常規方法。S卩,于96孔微滴定板,每孔200iU細胞濃度為1.0Xl()5細胞/ml,添加不同濃度的提取物或單體組分,將細胞培養16小時,加入MTT試劑,再培養4小時。棄上清,添加150iUDMSO,將生成的甲臜(formazane)完全溶解,測定570nm下的吸光度。利用griess法進行NO生成評價。取上清100ul,加入0.1%N-l-鹽酸萘乙二胺(N-l-N即hthyethylene-diamineDihyrochloride)溶液50ul,對胺基苯磺酰胺溶液50ul,室溫放置10分鐘。用分光光度計測570nm的0.D.值。在STD中,用亞硝酸鈉溶液(100,50,20,10,5,2,1,Oum)。供試藥用注射用水溶解。活性評價計算出N02—的量,代入下面的公式求出抑制效果抑制效果(%)={1-(X-Y)/(Z_Y)}X100X:在實驗化合物存在下,由IFN-Y和LPS誘導產生的N02—的量,Y;在實驗化合物、IFN-Y和LPS均不存在的情況下,誘導產生的N02—的量,Z:IFN-Y禾PLPS誘導產生的N02—的量。[0095]NO生成抑制效果的IC5。如下所示表3石豆蘭浸膏及萃取物的NO生成抑制試驗的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>水層浸膏表4單體的NO生成抑制試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求一種石豆蘭提取物1,其特征在于具有如下的結構式F2004800422775C00011.tif2.—種石豆蘭提取物2,其特征在于具有如下的結構式3.具有如下結構式3的石豆蘭提取物在制備治療與NO生成相關的炎癥的藥物中的用途4.一種從藥用植物石豆蘭中分離活性化合物的方法,其特征在于包括如下的步驟1)制備石豆蘭的乙醇提取物;經過乙醇浸泡提取重復2次,合并這些提取液,經減壓濃縮得到褐色粉末提取物;2)將該粉末提取物溶解在水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作為洗脫液分別提取;3)對步驟2)中的乙酸乙酯、石油醚洗脫液利用柱層析進行分離;4)對步驟3)中收集到的洗脫液進行減壓濃縮,進一步分離精制;其中,石豆蘭的乙醇提取液濃度是60%;其中,層析柱為硅膠柱或S印hadenLH-20柱;洗脫劑為體積比為100:0、95:5、90:io、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50或0:ioo的氯仿和甲醇;體積比為ioo:o、95:5、90:io、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50或0:ioo的正己烷乙酸乙酯;或體積比為ioo:o、95:5、90:io、85:15、80:20、70:30、60:40、50:50或o:ioo的正己烷丙酮;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中,減壓濃縮在4(TC條件下進行;其中,精制的方法為使用HPLC,流動相為甲醇H20=1:1,流速4ml/min,在室溫下制備;或HPLC,流動相為正己烷丙酮=7:3,流速4ml/min。5.—種石豆蘭提取物6,其特征在它具有如下的理化參數<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6.—種石豆蘭提取物7,其特征在它具有如下的理化參數<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>7.如權利要求1中所述石豆蘭提取物1或權利要求2中所述石豆蘭提取物2在制備治療與NO生成相關的炎癥的藥物中的應用。專利摘要本發明公開了一種從藥用植物石豆蘭中提取分離抑制NO生成活性的化合物的方法,包括步驟有制備石豆蘭的提取物;對上述提取物利用柱層析進行分離,收集洗脫組分;對收集到的洗脫餾分進行減壓濃縮,進一步分離精制;對精制得到的化合物進行理化特性分析以確定其結構;并進行NO生成抑制活性和毒性測試。發現精制得到的化合物具有抑制NO生成的活性。其中化合物1-3的結構確定如下。文檔編號C07D493/04GKCN1976937B發布類型授權專利申請號CN200480042277公開日2010年4月28日申請日期2004年3月4日發明者北中進,姚新生,張家欣,王乃利,王玨申請人:學校法人日本大學;王導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(2),非專利引用(2),