一種利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法。
【背景技術】
[0002]綠/ti QBambusa WAgaziiifcC/yre)屬于禾本科竹亞科莉竹屬，為優良的輿材兩用竹種。筍期5-11月，較長的筍期和較大的產量使其具有很高的經濟效益。另外，其竹材纖維長，劈篾性好，是造紙建筑的好材料。然而傳統的母竹移栽、埋鞭、扦插等方法，效率低，成本高。這一直都限制了優良竹種的大規模推廣。因此，采用合適的外植體，利用植物組織培養的技術來建立優良竹種的離體快速繁殖和再生體系一直是科學研究的方向。
[0003]竹類植物的組織培養起步于1968年，到現在已經先后對20余屬80多個竹種開展了組培研究，而且應用于生產實踐中。迄今為止，建立竹子再生體系所用的外植體大多是種胚、花藥、花序、筍、芽、莖段、葉鞘等，關于花芽再生的報道極少，有關對綠竹通過花芽再生途徑來實現植株的再生的研究未見有報道。

【發明內容】

[0004]針對現有技術中存在的問題，本發明利用綠竹的無菌花芽為外植體，經過愈傷組織誘導、增殖、分化、試管苗生根，移栽，建立其再生體系的方法。
[0005]本發明通過以下技術方案加以實現:
所述的一種利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法，其特征在于按下列步驟進行:
1)無菌花芽的獲得
選取健壯、生長力旺盛、無病斑的綠竹植株，切下側芽，經消毒處理后，在解剖顯微鏡下切下無菌芽尖為外植體，將芽尖接種在增殖培養基中，基本培養基為MS (Murashige andSkoog)，添加的外源激素為6-BA即6-節基腺嘌呤，濃度為Img.L %培養條件:光培養，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C，隨著繼代次數增加，竹子出現試管開花，取開花植株的花芽作為外植體，無菌花芽在原培養基中繼代培養；
2)愈傷組織誘導培養
誘導愈傷組織所用的花芽選用步驟I)已經建立好的無菌花芽體系，將0.05 - 0.1cm長的花芽接種于誘導培養基中:愈傷組織誘導基本培養基為MS培養基，添加的外源激素為2，4-D即2，4- 二氯苯氧乙酸，2，4-D濃度為2mg -L \并在誘導培養基中添加500 mg-L 1的水解酪蛋白、500 mg.L 1的脯氨酸和500 mg.L 1的谷氨酰胺；pH為5.7 ;誘導條件為:暗培養，溫度25±2°C ；
3)愈傷組織增殖培養
一個月后，將誘導出的致密愈傷組織轉移到新的培養基中增殖培養，愈傷組織增殖培養基同誘導培養基，pH為5.7 ;培養條件為:暗培養，溫度25±2°C ； 4)分化培養
將經過增殖培養的致密愈傷組織接種在分化培養中進行分化，分化培養基同誘導培養基，pH為5.7 ;培養條件為:光培養，光強24001uX，光周期16/8h，溫度25±2°C ；
5)生根培養
將從分化培養基分化出的再生植株長到3-5cm時移入生根培養基中進行生根；生根培養基為MS培養基，pH為5.7 ;培養條件為:光培養，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C ；
6)再生植株的移栽
一個月后，選取根長勢粗壯的再生苗進行馴化移栽，將其放在馴化室200001UX強光下煉苗一周，然后取出試管苗，用30-40 °C溫水洗凈根部的培養基，將植株移栽于混合培養基質中，并進行單株套袋，定期澆水，一周后剪去塑料袋兩角，兩周后完全脫袋，當植株長出新葉，生長穩定時移栽至溫室。
[0006]所述的是一種利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟I)中消毒處理是指用清洗劑清洗干凈，用體積分數為0.005的次氯酸鈉溶液浸泡lOmin，次氯酸鈉溶液中添加有吐溫-20，吐溫-20的添加量為每50ml次氯酸鈉溶液中添加一滴，然后用無菌水沖洗4-5次。
[0007]所述的一種利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟I)中無菌芽尖的長度為5-10mm。
[0008]所述的一種利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法，其特征在于步驟6)中溫水的溫度為30-40°C，混合培養基質由泥炭:珍珠巖:蛭石=1:1:1混合而成。
[0009]本發明利用花芽離體培養可在短期內獲得性狀豐富的單倍體，大大地縮短了育種周期，提高了選擇效率。利用花芽誘導的胚性愈傷組織作為轉基因受體，有望得到純合的、后代不會發生性狀分離的轉基因植株，加快竹類育種進程。通過建立較為完善的綠竹花芽無菌體系，采用綠竹花芽為實驗材料，方便可行，不受外界環境制約，便于建立綠竹的再生體系，為竹子后期的研究奠定了基礎。
【附圖說明】
[0010]圖1為花芽正在誘導的白色致密的愈傷組織圖；
圖2為變綠的愈傷組織分化形態圖；
圖3為愈傷組織分化出綠色芽形態圖；
圖4為綠竹再生苗生根形態圖；
圖5為煉苗移栽后的植株形態圖。
【具體實施方式】
[0011]以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，并給出【具體實施方式】。
實施例
[0012]利用綠竹花芽進行快速高效再生體系的建立方法，按下列步驟進行:
I)無菌花芽的獲得選取健壯、生長力旺盛、無病斑的綠竹植株，切下側芽，用體積分數為0.005的次氯酸鈉溶液浸泡lOmin，次氯酸鈉溶液中添加有吐溫-20，吐溫-20的添加量為每50ml次氯酸鈉溶液中添加一滴，然后用無菌水沖洗4-5次，在解剖顯微鏡下切下5-10mm的無菌芽尖為外植體，將芽尖接種在增殖培養基中，基本培養基為MS (Murashige and Skoog)，添加的外源激素為6-BA即6-芐基腺嘌呤，濃度為lmg/L ;培養條件:光培養，光強24001ux，光周期16/8h，溫度25±2°C。隨著繼代次數增加，竹子出現試管開花，取開花植株的花芽作為外植體，無菌花芽在原培養基中繼代培養；
2)愈傷組織誘導培養