蘋果葉片再生體系的建立方法
【專利說明】蘋果葉片再生體系的建立方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及蘋果葉片再生體系的建立方法。
【背景技術】
[0003]自1989年James等采用葉盤法首次通過農桿菌介導的方式獲得了蘋果的轉基因植株以來，葉盤轉化法已成為開展蘋果遺傳轉化的主要方法。國內外學者雖然獲得了元帥、皇家嘎拉和新喬納金等蘋果品種的轉基因植株，但是由于蘋果離體再生能力較差、轉化體系不夠完善、遺傳轉化效率不高等問題的制約，獲得蘋果轉基因植株難度比較大。因此，建立高效的離體再生體系是蘋果遺傳轉化的基礎。“長富2號”是我國主栽蘋果優良品種之一，但由于該品種的再生率較低，只有60%左右，一直沒有開展該品種遺傳轉化方面的研宄。

【發明內容】

[0004]本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，從培養基篩選、激素配比、培養技術等方面進行研宄，提供了 “長富2號”蘋果葉片高效再生體系的建立方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:蘋果葉片再生體系的建立方法，包括以下步驟:
1)壯苗培養:采用的壯苗培養基為MS培養基+6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸
0.lmg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH6.0 ;培養容器為150mL三角瓶，每瓶分裝壯苗培養基50ml ;培養條件為光照強度30001x，培養溫度25_28°C ;培養40_50d的試管苗葉片用做再生材料；
2)試管苗處理和接種:步驟I)中培養40-50d的健壯試管苗，在無菌條件下操作，取中部2?3枚生長良好的葉片，用剪刀將葉片兩側葉緣剪掉，將其剪成0.8cmX0.8cm的方塊，葉正面朝上接種在不定芽分化培養基上，每瓶中接種5塊葉片；所采用的不定芽分化培養基為MS培養基+萘乙酸0.3 mg/L+6-芐氨基腺嘌呤3.0 mg/L+ TDZ植物生長調節劑1.0mg/L +聚乙烯吡咯烷酮150mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH6.0 ;培養容器為150mL三角瓶，每瓶分裝不定芽分化培養基50ml，121°C滅菌20min ;培養條件為:接種后暗培養3周，培養溫度為20-25°C，然后置于光下培養，光照強度1000-20001x，光周期為16h/8h，培養溫度 25-28 0C ；
3)待步驟2)培養的葉片產生的不定芽生長到0.5-lcm時，將其轉接到步驟I)所述的壯苗培養基中進行培養，發育得到獨立的試管苗；
4)待步驟3)得到的獨立的試管苗生長到1cm時，將其剪切為長度2cm的莖段，再轉接到生根培養基上進行培養，發育得到完整的蘋果試管苗；所述生根培養基的組成為:1/2MS培養基+吲哚丁酸0.2mg/L+吲哚乙酸0.5mg/L+葡萄糖25g/L+瓊脂6g/L，pH 6.0，培養條件與步驟2)相同。
[0006]進一步的，上述的蘋果葉片再生體系的建立方法，所述蘋果品種為“長富2號”蘋果O
[0007]再生率(％)=再生芽葉片外植體數/接種葉片外植體數X 100 ；
再生系數=分化芽數/已分化芽的葉片數。
[0008]本發明的有益效果為:本發明提供的蘋果葉片再生體系的建立方法，建立了 “長富2號”蘋果葉片高效再生體系，葉片不定芽再生率達100%，再生系數達5以上，生根率達86%以上，可滿足蘋果開展遺傳轉化的要求。
【附圖說明】
[0009]圖1為“長富2號”蘋果葉片不定芽再生情況。
[0010]圖2為“長富2號”蘋果試管苗生根情況。
【具體實施方式】
[0011]實施例1:
“長富2號”蘋果葉片再生體系的建立方法，包括以下步驟:
1)壯苗培養:采用的壯苗培養基為MS培養基+6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸
0.lmg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L, pH6.0 ;培養容器為150mL三角瓶，每瓶分裝壯苗培養基50ml ;培養條件為光照強度30001x，培養溫度25_28°C ;培養40_50d的試管苗葉片用做再生材料；
2)試管苗處理和接種:步驟I)中培養40-50d的健壯試管苗，在無菌條件下操作，取中部2?3枚生長良好的葉片，用剪刀將葉片兩側葉緣剪掉，將其剪成0.8cmX0.8cm的方塊，葉正面朝上接種在不定芽分化培養基上，每瓶中接種5塊葉片，如圖1所示；所采用的不定芽分化培養基為MS培養基+萘乙酸0.3 mg/L+6-芐氨基腺嘌呤3.0 mg/L+ TDZ植物生長調節劑1.0 mg/L +聚乙烯吡咯烷酮150mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L, ρΗ6.0 ;培養容器為150mL三角瓶，每瓶分裝不定芽分化培養基50ml，121°C滅菌20min ;培養條件為:接種后暗培養3周，培養溫度為20-25°C，然后置于光下培養，光照強度1000-20001x，光周期為16h/8h，培養溫度 25-28°C ；
3)待步驟2)培養的葉片產生的不定芽生長到0.5-lcm時，將其轉接到步驟I)所述的壯苗培養基中進行培養，發育得到獨立的試管苗；
4)待步驟3)得到的獨立的試管苗生長到1cm時，將其剪切為長度2cm的莖段，再轉接到生根培養基上進行培養，發育得到完整的蘋果試管苗，如圖2所示；所述生根培養基的組成為:1/2MS培養基+吲哚丁酸0.2mg/L+吲哚乙酸0.5mg/L+葡萄糖25g/L+瓊脂6g/L，pH6.0，培養條件與步驟2 )相同。
[0012]技術關鍵點:
1、從培養健壯的試管苗取葉片作為外植體是提高葉片不定芽再生的基礎，生長細弱的試管苗葉片質量差，作為外植體培養時容易褐化死亡；
2、接種時，葉片的正面向上、葉片的背面接觸培養基，否則，容易產生愈傷組織，不利于不定芽的發生；
3、產生的不定芽伸長到0.5-lcm時，及時轉接到壯苗培養基上進行培養，使其盡快發育為獨立的試管苗；
4、試管苗長到1cm時，剪切為長度為2cm的莖短，轉接到生根培養基上培養，使其發育為完整的蘋果試管苗。
[0013]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.蘋果葉片再生體系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)壯苗培養:采用的壯苗培養基為MS培養基+6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.lmg/L +蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH6.0 ;培養容器為150mL三角瓶，每瓶分裝壯苗培養基50ml ;培養條件為光照強度30001x，培養溫度25_28°C ;培養40_50d的試管苗葉片用做再生材料； 2)試管苗處理和接種:步驟I)中培養40-50d的健壯試管苗，在無菌條件下操作，取中部2?3枚生長良好的葉片，用剪刀將葉片兩側葉緣剪掉，將其剪成0.8cmX0.8cm的方塊，葉正面朝上接種在不定芽分化培養基上，每瓶中接種5塊葉片；所采用的不定芽分化培養基為MS培養基+萘乙酸0.3 mg/L+6-芐氨基腺嘌呤3.0 mg/L+ TDZ植物生長調節劑1.0mg/L +聚乙烯吡咯烷酮150mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.0g/L，pH6.0 ;培養容器為150mL三角瓶，每瓶分裝不定芽分化培養基50ml，121°C滅菌20min ;培養條件為:接種后暗培養3周，培養溫度為20-25°C，然后置于光下培養，光照強度1000-20001x，光周期為16h/8h，培養溫度 25-28 0C ； 3)待步驟2)培養的葉片產生的不定芽生長到0.5-lcm時，將其轉接到步驟I)所述的壯苗培養基中進行培養，發育得到獨立的試管苗； 4)待步驟3)得到的獨立的試管苗生長到1cm時，將其剪切為長度2cm的莖段，再轉接到生根培養基上進行培養，發育得到完整的蘋果試管苗；所述生根培養基的組成為:1/2MS培養基+吲哚丁酸0.2mg/L+吲哚乙酸0.5mg/L+葡萄糖25g/L+瓊脂6g/L，pH 6.0，培養條件與步驟2)相同。
2.根據權利要求1所述的蘋果葉片再生體系的建立方法，其特征在于，所述蘋果品種為“長富2號”蘋果。
【專利摘要】本發明公開了蘋果葉片再生體系的建立方法，包括以下步驟：1）壯苗培養，2）試管苗處理和接種，3）不定芽壯苗培養，4）生根培養得到蘋果試管苗。本發明的有益效果為：本發明提供的蘋果葉片再生體系的建立方法，建立了“長富2號”蘋果葉片高效再生體系，葉片不定芽再生率達100%，再生系數達5以上，生根率達86%以上，可滿足蘋果開展遺傳轉化的要求。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104798685
【申請號】CN201510214752
【發明人】毛娟, 陳佰鴻, 趙立梅, 馬宗桓, 胡紫璟
【申請人】甘肅農業大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月30日