一種茶樹組織培養再生體系構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種茶樹組織培養再生體系構建方法。
【背景技術】
[0002]茶{Camellia sinensis L.)為山茶科山茶屬多年生常綠喬木或灌木,具有悠久的栽培歷史，是我國重要的經濟作物之一。茶樹喜光怕曬，喜溫怕寒，對土壤含水量有一定的要求。我國山茶屬植物資源豐富，是華南地區綠化荒山，保持水土的經濟作物。
[0003]常規茶樹育種技術具有局限性，如遠緣雜交困難、有益突變頻率低、選育優良品種耗時長、花期不遇等，制約了茶樹優質資源的利用，使得茶樹品種選育工作難以取得突破性的進展。而植物組織培養技術具有加速育種進程、縮短繁殖時間、改良植物品質、節省空間、減少勞動、可終年生產、不受自然條件限制等特點，可有效解決茶樹品種選育耗時長的問題。近年來茶樹組織培養研究方面取得了一定的進展，但依然存在一些問題，如外植體褐化現象嚴重、出梢率低、生根困難、移栽大田成活率低等，使組織培養技術在茶樹中的應用受到很大的限制。因此，非常有必要建立系統的茶樹離體快繁體系，為今后對茶樹進行品質遺傳改良奠定基礎。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供出一種茶樹組織培養再生體系構建方法，本發明以茶樹未成熟胚為外植體，經過種子消毒、胚愈傷組織誘導、分化培養、生根培養、煉苗及移栽等步驟構建了茶樹組織培養再生體系，從而實現了本發明的目的。
[0005]本發明的一種茶樹組織培養再生體系構建方法，包括以下的步驟:
(O種子消毒:選擇8月份底未成熟茶果，去葉后于洗衣粉水浸泡10?30min，刷凈后自來水沖洗I?2h，取出尚未成熟的乳白或略帶棕色的種子，在超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次，再用0.1%升汞溶液消毒10?25min，用無菌水沖洗4?6次后備用。
[0006](2)胚愈傷組織誘導:將經步驟(I)處理后未成熟種胚切成0.5cmX0.5cmX0.5cm接種到誘導培養基上，先在25?28°C條件下全暗培養30?45天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至誘導形成胚性愈傷組織。
[0007](3)分化培養:將步驟(2)培養獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉入分化培養基上進行分化培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養7?14天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為3000?50001x，置于培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成叢生芽。
[0008](4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的叢生芽分切接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養7?14天，然后置于每天光照14?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養至生根。
[0009](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質中并定植于大田中。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導培養基為:ER+6-BAl.0?3mg/L+NAA0.1?0.5mg/L+GAS3 ?5 mg/L+ 鹿糖 15 ?30g/L+ 瓊脂 3.5 ?6.0g/L, pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的分化培養基為:ER+6-BAl.0?5.0mg/L+IBA0.1?0.5mg/L+鹿糖 15 ?30g/L+ 瓊脂 3.5 ?6.0g/L, pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.2?1.0mg/L+GGRl.0?2.0mg/L+KT1.0 ?3.0mg/L+ 蔗糖 15 ?30g/L+ 瓊脂 3.5 ?6.0g/L, pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]與現有技術相比本發明的優點是:目前國內關于茶樹組培快繁技術尚未成熟，而本發明具有簡單、易行、經濟的特點。通過本發明育成的茶樹試管苗移栽成活率達到89%以上，可以有效解決茶樹種苗缺乏的問題。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0015]實施例1:
(I)種子消毒:選擇8月份底未成熟茶果，去葉后于洗衣粉水浸泡lOmin，刷凈后自來水沖洗lh，取出尚未成熟的乳白或略帶棕色的種子，在超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒lOmin，用無菌水沖洗4次后備用，接種一周后統計污染率可低至3%。
[0016](2)胚愈傷組織誘導:將經步驟(I)處理后未成熟種胚切成0.5cmX0.5cmX0.5cm接種到誘導培養基上，先在28°C條件下全暗培養30天，然后置于每天光照10小時，光照強度為1500x，直至誘導形成胚性愈傷組織，愈傷組織誘導率為67%。所述的誘導培養基為ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA35 mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 瓊脂 3.5g/L, pH 為 5.8。
[0017](3)分化培養:將步驟(2)培養獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉入分化培養基上進行分化培養，接種后先在28°C條件下全暗培養7天，然后置于每天光照12小時，光照強度為30001x，置于培養溫度為28°C的條件下培養直至形成叢生芽。所述的分化培養基為ER+6-BA1.0mg/L+IBA0.lmg/L+ 蔗糖 15g/L+ 瓊脂 3.5g/L, pH 為 5.8。
[0018](4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的叢生芽分切接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在28°C條件下全暗培養7天，然后置于每天光照14小時，光照強度為20001x，培養溫度為28°C的條件下培養至生根，生根率為88.3%。所述的生根培養基為 1/2MS+IBA0.2mg/L+GGRl.0mg/L+KTl.0mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 瓊脂 3.5g/L，pH 為5.8ο
[0019](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質中并定植于大田中，移栽成活率可達91.7%。
[0020]實施例2:
(I)種子消毒:選擇8月份底未成熟茶果，去葉后于洗衣粉水浸泡15min，刷凈后自來水沖洗2h，取出尚未成熟的乳白或略帶棕色的種子，在超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒8s后用無菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒12min，用無菌水沖洗4次后備用，接種一周后統計污染率可低至5%。
[0021](2)胚愈傷組織誘導:將經步驟(I)處理后未成熟種胚切成0.5cmX0.5cmX0.5cm接種到誘導培養基上，先在28°C條件下全暗培養30天，然后置于每天光照12小時，光照強度為1500x，直至誘導形成胚性愈傷組織，愈傷組織誘導率為63%。所述的誘導培養基為ER+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA33 mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 瓊脂 3.5g/L, pH 為 5.8。
[0022](3)分化培養:將步驟(2)培養獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉入分化培養基上進行分化培養，接種后先在28°C條件下全暗培養7天，然后置于每天光照12小時，光照強度為30001x，置于培養溫度為28°C的條件下培養直至形成叢生芽。所述的分化培養基為ER+6-BA1.2mg/L+IBA0.5mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 瓊脂 3.5g/L, pH 為 5.8。
[0023](4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的叢生芽分切接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在28°C條件下全暗培養7天，然后置于每天光照14小時，光照強度為25001x，培養溫度為28°C的條件下培養至生根，生根率為84.1%。所述的生根培養基為 1/2MS+IBA0.4mg/L+GGRl.5mg/L+KTl.0mg/L+ 蔗糖 15g/L+ 瓊脂 3.5g/L，pH 為5.8ο
[0024](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質中并定植于大田中，移栽成活率可達89%。
【主權項】
1.一種茶樹組織培養再生體系構建方法，其特征在于包括以下步驟: (1)種子消毒:選擇8月份底未成熟茶果，去葉后于洗衣粉水浸泡10?30min，刷凈后自來水沖洗I?2h，取出尚未成熟的乳白或略帶棕色的種子，在超凈工作臺中，剝開外種皮，先用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次,再用0.1%升萊溶液消毒10?25min,用無菌水沖洗4?6次后備用； (2)胚愈傷組織誘導:將經步驟(I)處理后未成熟種胚切成0.5cmX0.5cmX0.5cm接種到誘導培養基上，先在25?28°C條件下全暗培養30?45天，然后置于每天光照10?12小時，光照強度為1500?30001x，直至誘導形成胚性愈傷組織； (3)分化培養:將步驟(2)培養獲得的呈綠色的子葉愈傷組織轉入分化培養基上進行分化培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養7?14天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為3000?50001x，置于培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成叢生芽； (4)生根培養:將步驟(3)過程獲得的高度約為2.5?3.5cm的叢生芽分切接種到生根培養基上進行生根培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養7?14天，然后置于每天光照14?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養至生根； (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約6?8cm的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入由泥炭土和黃沙泥混合成的基質中并定植于大田中。
2.根據權利要求1所述的一種茶樹組織培養再生體系構建方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養基為:ER+6_BA1.0?3mg/L+NAA0.1?0.5mg/L+GAs3?5 mg/L+鹿糖15?30g/L+ 瓊脂 3.5 ?6.0g/L, pH 為 5.4 ?5.8。
3.根據權利要求1所述的一種茶樹組織培養再生體系構建方法，其特征在于步驟(3)所述的分化培養基為:ER+6-BAl.0?5.0mg/L+IBA0.1?0.5mg/L+蔗糖15?30g/L+瓊脂3.5 ?6.0g/L, pH 為 5.4 ?5.8。
4.根據權利要求1所述的一種茶樹組織培養再生體系構建方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.2 ?1.0mg/L+GGRl.0 ?2.0mg/L+KTl.0 ?3.0mg/L+ 蔗糖 15 ?30g/L+ 瓊脂 3.5 ?6.0g/L, pH 為 5.4 ?5.8。
【專利摘要】本發明公開了一種茶樹組織培養再生體系構建方法，涉及茶（Camellia sinensis L.）通過無性快繁技術獲得株性穩定茶樹種苗的技術方法。本發明以茶樹未成熟胚為外植體，經過種子消毒、胚愈傷組織誘導、分化培養、生根培養、煉苗及移栽等步驟構建了茶樹組織培養再生體系，既解決茶樹優質種苗缺乏的問題，又可為今后開展茶樹遺傳轉化工作奠定基礎。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686332
【申請號】CN201510085922
【發明人】劉木嬌
【申請人】劉木嬌
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月22日