專利名稱:細胞致死腫脹毒素及以其為目標的彎曲桿菌屬細菌的檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)的細胞致死腫脹毒素及其編碼多核苷酸。本發明還涉及通過追蹤彎曲桿菌(包括大腸彎曲桿菌)的細胞致死腫脹毒素， 以檢測待測樣品中(如臨床樣品和食物)彎曲桿菌存在與否的方法。
背景技術：
彎曲桿菌是對人類和野生動物以及家畜具有致病性的微生物，它會引起動物的流產和腸炎和人類的腸炎。空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)和大腸彎曲桿菌是已知的人體內引起彎曲桿菌感染的病原菌。這些細菌經常被稱為食物中毒細菌(參見非專利文件1和2)。
到2000年，彎曲桿菌已被分為15個種和9個亞種。空腸彎曲桿菌在人腹瀉病例中分離的細菌中占95-99%，而其它細菌品種，如大腸彎曲桿菌僅占很少的百分比(參見非專利文件幻。然而，豬中大腸彎曲桿菌的攜帶率非常地高。近年來，隨著主要由東南亞進口豬肉的增加，彎曲桿菌感染已經呈現增長趨勢。特別地，由于牛肉如BSE和0-157問題導致與雞肉相關食品消費的增長，雞肉相關食品的感染迅速增加了。
此外，雖然胚胎彎曲桿菌是公知引起綿羊和牛流產的細菌，但是只到最近才報道它同樣涉及人的流產和早產。由于吃了胚胎彎曲桿菌污染的生的肝臟或者牛肉而感染胚胎彎曲桿菌會出現如膿血癥和腦膜炎的癥狀。人類胚胎彎曲桿菌感染的主要來源是雞肉，其腸道內高密度帶菌(參見非專利文件4)。
彎曲桿菌一般高密度分布在動物，如牛、羊、豬和雞的消化道內，因而被稱為人獸互通病病原菌。大多數彎曲桿菌病認為是由雞肉造成。感染會通過直接接觸上述動物或其糞便引起，或者通過攝入或加工被糞便污染的食物、飲用水、牛奶引起。此外，在如新生兒監護室的環境中，也有感染病例的報道(參見非專利文件5)。
彎曲桿菌病有一個3至7天的長潛伏期。其特征表現為胃腸炎癥狀，如腹瀉(有時為出血的粘液性腹瀉)、腹痛、發燒、反胃、嘔吐、頭痛、畏寒和虛弱。雖然致死率低，但是新生兒可能發展成全身感染，如膿血癥和腦膜炎。在大多數情況下，治愈需要幾天至約一周的時間。除了一些免疫缺陷病人，一般預測會有一個有利的治療過程。然而，近些年已經報道，病人感染彎曲桿菌病后可能引起吉蘭-巴雷綜合癥(Guillain-Barre)或者Fischer綜合癥，它們屬于自身免疫病。由彎曲桿菌病引發的病例通常傾向變得嚴重，而且發作的一年后痊愈率只有60%。
對狀況嚴重或者伴有膿血癥的病例，使用抗生素化學療法。首選的藥物是大環內酯物，如紅霉素。由于天然抗性，cephem類抗生素預計沒有治療效果。同時，對新的喹諾酮抗生素有抗性的細菌數量的增長已成為近年來的問題。感染后病原體微生物的快速鑒定對實施正確的彎曲桿菌病治療方案以及發現感染途徑以阻止感染的擴散有重要意義。然而， 僅依據臨床癥狀難以診斷彎曲桿菌病，更不用說鑒定彎曲桿菌及其種類。
彎曲桿菌是微需氧生物。該細菌的培養需要如Skirrow氏培養基的特殊培養基和特殊儀器(厭氧廣口瓶或其類似物)以維持氧氣的濃度在3-10%的絕對微需氧條件。此夕卜，與其它微生物相比，該培養過程是耗時的天)。因此，難以獲得和維持彎曲桿菌的隔離培養。另外，由于彎曲桿菌在空氣中易死亡，因此它們必須在樣品收集后2-3小時內檢測。而且由于彎曲桿菌病的潛伏時間長(3-7天)，出現病癥后，在對相關食物的細菌鑒定的時候，通常不能分離到該細菌。還有，彎曲桿菌有非常強的傳染性，據報道只要幾百個細胞就會造成傳染。因而，對傳染源的鑒定是極度困難的。
區別診斷空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌的一種方法涉及檢測馬尿酸鹽的水解。具體地，該方法是以空腸彎曲桿菌能夠水解馬尿酸鹽，而大腸彎曲桿菌不能水解馬尿酸鹽的事實為基礎。然而，該方法不精確，因為現有技術中已知存在一些馬尿酸鹽陰性的空腸彎曲桿菌(參見非專利文件6)。因此，只有通過從食物攝取的歷史記錄和癥狀估計細菌的存在，以及通過檢測由糞便培養物中得到菌落的細菌的形態和生物特征，這需要數天時間，才能證實彎曲桿菌的存在。
因而，已經嘗試使用利用DNA探針方法或者用寡核苷酸的PCR方法的遺傳診斷方法，作為不需培養的快速診斷方法來鑒定彎曲桿菌和檢測其毒素基因。例如，編碼rRNA的基因通常用作檢測彎曲桿菌的探針(參見專利文件1)。彎曲桿菌rRNA基因的序列已經公開(參見非專利文件7)。另外，檢測彎曲桿菌的核酸片段也是已知的(參見專利文件2、3、 4、5、和6)。然而，雖然這些序列可用于檢測空腸彎曲桿菌和/或大腸彎曲桿菌，但是它們不能夠檢測其它彎曲桿菌。并且特異性的現有水平不夠。
還有報道使用選自大腸彎曲桿菌VC167的f la A基因的寡核苷酸，通過PCR鑒定空腸彎曲桿菌的方法(參見非專利文件8)。另外，有文獻報道使用寡核苷酸引物擴增空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌的過氧化物歧化酶的靶序列(參見專利文件7)。然而，這些方法不能區別空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌。
同時，對彎曲桿菌致病因子的研究活躍。各種因子，如細胞侵入、鞭毛蛋白以及霍亂毒素類腸毒素是已經報道的彎曲桿菌致病因子(參見非專利文件9和10)。最近，從空腸彎曲桿菌中發現作為毒素因子的細胞致死腫脹毒素(CDT)，其與致病力的相關性吸引了人們的注意。例如，已有報道使用產生志賀氏菌(Shigella dysenteriae)⑶T的重組大腸桿菌在動物模型體內引發毒素性腹瀉(參見非專利文件12)。
⑶T是由稱為cdtA、cdtB和cdtC的三個亞基組成的全毒素，它們由縱排排列的基因編碼。毒素的活性中心是在具有I型脫氧核糖核酸酶樣活性的cdtB亞基里，而cdtA和 cdtC亞基認為是用來對靶細胞的粘附。當全毒素作用于細胞時，細胞腫脹即膨脹，最后死亡。因而該毒素被命名為“細胞致死腫脹毒素”。
據信其分子機制如下所述。構成毒素活性中心的CdtB亞基轉運到細胞核內，通過它的I型脫氧核糖核酸酶活性，在染色體DNA上形成缺口，從而誘導DNA損傷應答。然后此細胞阻止處于G2/M相的細胞循環以激活基因修復系統，然后膨脹和死亡(非專利文件13)。 此外已發現⑶T廣泛作用于包括上皮細胞和免疫細胞的多種細胞。特別地，據信⑶T作用于人類淋巴細胞，并誘導其凋亡，借此輕易逃脫了免疫(非專利文件14)。
如上所述，CDT具有在其它已知毒素內沒有發現的獨特分子機制。迄今為止，彎曲桿菌中僅有空腸彎曲桿菌的全長CDT核苷酸序列已經確定(非專利文件11)。
專利文件1 日本專利申請公開號(JP-A) S62_2^096(未審查，公開的日本專利申請)[0018]專利文件2 JP-A H2-84200
專利文件3 JP-A H2-1M700
專利文件4 JP-A H3-112498
專利文件5 JP-A H6-90795
專利文件6 JP-A H6-90796
專利文件7 JP-A
非專利文件1 =Blaser 等，Ann. Intern. Med.，91 179 (1979)
非專利文件 2 :Tauxe, R. , American Society for Microbiology, Washington DC. pg.9(1992)
3 :Takahashi, M.Infectious Diseases Weekly ReportJapan, 3(6) :10(2001)
非專利文件 4 :Simon, Μ. S.等，2003. Campylobacter infection. Diseases of Poultry, Iowa State Press,615—630
非專利文件 5 Japanese Journal of Pediatric Medicine，29 :1219—1222 (1997)
非專利文件6 Jotten 等，J. Clin. Microbiol. ,25 :1747(1987)
非專利文件7 =Romaniuk, P. J.等，J. Bacteriol.，169 :2173 (1987)
非專利文件8 Oyofo 等，J. Clin. Microbiol. ,30 :2613(1992)
非專利文件9 =Mizuno, K.等，Microbios.，78 :215 (1994)
非專利文件10 =Suzuki, S.等，FEMS Immunol. Med. Microbiol.，8 :207(1994)
非專利文件11 =Pickett, C.等· Infect. Immun. ,64 :2070(1996)
非專利文件12 Infect. Immun.，65 :428-433 (1997)
非專利文件13 =Science, 290 :354-357 (2000)
非專利文件14 J. Biol. Chem.，276 :5296-5302 (2001)

發明內容
本發明所解決的問題
如上詳述，盡管彎曲桿菌的致病因子還沒被充分闡明，但是在本領域中需要快速診斷彎曲桿菌感染。傳統上，以其血清型為基礎的鑒定細菌種類的PCR引物和檢測CDT產量的通用引物等已被使用(J. Applied Microbiol. ,94 1003-1014(2003)) 0然而，這些方法需要富集培養步驟，這使得快速探測彎曲桿菌不可能。
因而，本發明的目的是提供大腸彎曲桿菌(即一種CDT核苷酸序列還有待闡述的彎曲桿菌)的CDT及其編碼多核苷酸，是為了使通過遺傳診斷的彎曲桿菌的快速檢測成為可能。本發明的另一目的是提供胚胎彎曲桿菌(其CDT核苷酸序列也還有待闡述)的CDT 及其編碼多核苷酸。
此外，本發明的另一目的是提供能快速檢測彎曲桿菌的方法，其目標是包括大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的彎曲桿菌的CDT，以其得到的大腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的核苷酸序列為基礎。
解決問題的技術手段
當使用限制酶HindIII克隆⑶T基因時，由于它的編碼區含有HindIII位點而不能分離其全長序列。同時，常見限制酶如EcoRI、PstI、KpnI、XbaI、BamHI、SalI和BioI，不能產生用于克隆CDT基因的足夠長(3到51Λ)的片段。根據各種研究的結果，本發明人通過選擇部分消化的條件，其中HindIII不完全消化CDT基因，最終成功克隆了內部序列沒有缺口的全長⑶T基因。
本發明人還將大腸彎曲桿菌的CDT與空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的CDT作了比較，研制出三種彎曲桿菌的通用引物和每種細菌的特異性引物。然后本發明人證明了這些引物可用于快速方便地同時檢測彎曲桿菌CDT的存在和鑒定種類的多元PCR，而且它們還可用于基于PCR-RFLP的分型。
具體地，本發明包括下面的技術實施方案
(1)編碼細胞致死腫脹毒素的多核苷酸，其是下面中的任一種
(a)編碼包含SEQ ID NO 2~4中任一氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)包含SEQ ID NO=I核苷酸序列中編碼區的多核苷酸；
(c)編碼包含由SEQ ID NO :2_4任一氨基酸序列經過一個或多個氨基酸的取代、 缺失、添加和/或插入而形成的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和
(d)在嚴格條件下與包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA雜交的多核苷酸；
(2)含有(1)的多核苷酸的載體；
(3)帶有⑴的多核苷酸或(2)的載體的宿主細胞；
(4)由⑴的多核苷酸編碼的多肽；
(5)生產(4)的多肽的方法，其包括的步驟有培養(3)的宿主細胞和收集由宿主細胞或者培養上清液中產生的多肽；
(6)結合(4)的多肽的抗體；
(7)檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在的方法，其中此方法包括的步驟有
(a)用對編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA具有特異性的引物對的混合物對待測樣品進行聚合酶鏈式反應；和
(b)根據編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的存在或分子量來確定細菌的存在；
(8)檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在的方法，其中此方法包括的步驟有
(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行聚合酶鏈式反應；
(b)用步驟(a)中擴增的基因組DNA作為模板和編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA的特異性引物對的混合物進行聚合酶鏈式反應；和
(c)根據編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的存在或分子量來確定細菌的存在；
(9)⑶所述的方法，其中通用引物對是選自SEQ ID NO :7_10和47-50的引物對， 或者是能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(10) (7)或⑶的方法，其中使用(a)-(c)作為特異性引物對的混合物；
(a)選自SEQ ID NO :13,14和觀_36以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者是能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(b)選自SEQ ID NO :11、12和17-27以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者是能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；和
(c)選自SEQ ID NO :15,16和37_46以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者是能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(11)檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在的方法， 其中此方法包括的步驟有
(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行聚合酶鏈式反應；
(b)用限制酶消化步驟(a)中擴增的基因組DNA ；和
(c)根據由消化獲得的DNA片段的分子量確定細菌的存在；
(12) (11)的方法，其中限制酶可在下列物質構成的組中選擇Sau3 Al,Dsa I,Mbo I、Rsa I、EcoRI、HinfI、Nde I、Pst I、Xba I 和 Xho II;
(13) (11)的方法，其中通用引物對是選自SEQ ID NO :7_10和47-50的引物對，或者能像上述引物對那樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(14)用在(7)的方法中的一種試劑盒，其中包含說明書手冊和對編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA具有特異性的引物對的混合物；
(15) (14)的試劑盒，其中的特異性引物對的混合物如下所述
(a)選自SEQ ID NO :13,14和觀_36以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對那樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(b)選自SEQ ID NO :11、12和17-27以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對那樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；和
(c)選自SEQ ID NO :15,16和37_46以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對那樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(16)用在(8)的方法中的試劑盒，其中包含說明書手冊和
(a)對編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA具有特異性的引物對的混合物；或者
(b)能擴增編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對；
(17) (16)的試劑盒，其中特異性引物對混合物如下所述
(a)選自SEQ ID NO :13,14和觀_36以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(b)選自SEQ ID NO :11、12和17-27以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；和
(c)選自SEQ ID NO :15,16和37_46以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(18) (16)的試劑盒，其中通用引物對選自SEQ ID NO :7_10和47-50，或者能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；
(19)用在(11)的方法中的試劑盒，其中包含說明書手冊和能擴增編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對；和
(20) (19)的試劑盒，其中通用引物對是選自SEQ ID NO :7_10和47-50的引物對， 或者能像上述引物對那樣來對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對。
這里，術語“細胞致死腫脹毒素”(CDT或CLDT)是指屬于蛋白質型的A-B全毒素群的病毒因子。該細胞致死腫脹毒素有一個由三個亞基A、B和C組成的亞基結構。據信亞基 B是毒素活性位點單元，而亞基A和B則涉及細胞粘附。當毒素作用于細胞時，它造成細胞變形，如細胞膨脹，最終導致細胞死亡。試驗中用產毒大腸桿菌產生的熱不穩定腸毒素(LT) 或其類似物對細胞作用時，也可觀察到諸如細胞膨脹的細胞變形。然而，除去該毒素后，細胞恢復原形并且存活下來。相反地，即使除去CDT，細胞不能恢復原形而是被殺死。
此處所用的術語“多核苷酸”是指核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸，或者由一些堿基或者堿基對構成的多聚物。多核苷酸包括單鏈DNA和雙鏈DNA。這里的多核苷酸可既包括未修飾的天然存在的多核苷酸，又包括修飾的多核苷酸。三苯甲基化的堿基和特殊堿基， 例如肌苷，是修飾的堿基的例子。
此處所用的術語“多肽”是指由許多氨基酸構成的多聚物。因此，寡肽和蛋白質也屬于多肽的概念范圍。多肽既包括未修飾的天然存在的多肽，又包括修飾的多肽。多肽修飾的例子包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、與黃素的共價連接、與血紅素部分的共價連接、與核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、與脂或脂的衍生物的共價連接、與磷脂酰肌醇的共價連接、交聯、環化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價交聯、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y -羧基化、糖基化、形成GPI錨體、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、 蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、消旋化、硒化、硫酸鹽化、在蛋白質上添加轉運RNA介導的氨基酸(如精氨酰化)和遍在蛋白化等。
此處所用的術語“分離”是指將物質(例如多核苷酸或多肽)從它的原始環境(例如天然存在的物質的自然環境)之中移出，“人為地”改變它的自然狀態。“分離的”化合物是指這樣的化合物，其包括在大量富含目的化合物的樣品中存在的那些化合物，和/或存在在樣品中(其中目的化合物部分或基本純化)的那些化合物。這里，術語“基本純化的” 是指一種化合物(例如多核苷酸或者多肽)從自然環境中分離出來，其中至少60%、優選 75%、更優選90%的天然與該化合物相關的其它組分不存在。
此處所用的術語“突變”是指氨基酸序列中氨基酸的變化，或核苷酸序列中堿基的變化(即取代、缺失、添加或插入一個或多個氨基酸或核苷酸)。因此，如此處所用的術語“突變體”是指有一個或多個氨基酸變化的氨基酸序列，或有一個或多個核苷酸變化的核苷酸序列。突變體中核苷酸序列的變化可改變由標準多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列，或者沒有改變。突變體可為自然界存在的，例如等位突變體，或為在自然界還沒有確定的突變體。突變體可以是保守性變化，其中取代的氨基酸保持與原始氨基酸類似的結構或者化學特性。很少地，突變體會是非保守性取代。本領域已知的計算機程序，如DNA STAR軟件可用來確定哪些或者多少個氨基酸殘基取代、插入或缺失而不會抑制生物或免疫活性。
“缺失”是指氨基酸序列或核苷酸序列的變化，其中與天然存在的細胞致死腫脹毒素多肽的氨基酸序列或其編碼核苷酸序列相比，缺少一個或多個氨基酸殘基或核苷酸殘基。
“插入”或“添加”是指氨基酸序列或核苷酸序列的變化，其中與天然存在的細胞致死腫脹毒素多肽的氨基酸序列或其編碼核苷酸序列相比，增加一個或多個氨基酸殘基或核苷酸殘基。
“取代”是指氨基酸序列或核苷酸序列的變化，其中與天然存在的細胞致死腫脹毒素多肽的氨基酸序列或其編碼核苷酸序列相比，有一個或多個氨基酸殘基或核苷酸殘基變化為不同的氨基酸殘基或者核苷酸殘基。
此處所用的術語“雜交”是指核酸鏈通過堿基對的形成結合到其互補鏈的過程。


圖1是表示用C. Coli Co 1-192細胞提取物作模板，引物GNW和LPF-D的PCR結果的照片。箭頭1表示由⑶T區(約1.5Kb)擴增產生的帶；箭頭2表示的帶(SOObp)是由 cdtB衍生的第二條帶，其被擴增是由于引物GNW是混合引物。
圖2是表示限制酶HindIII消化C. coli Co 1-192細胞的基因組后雜交結果的照片。
圖3是表示用通用引物對1的PCR結果的照片。電泳泳道2-6中⑶T衍生帶可見于約 1. 9kbp。
圖4是表示用通用引物對2的多種C. jejuni菌株的PCR結果的照片。⑶T衍生帶可見于約720bp。
圖5是表示多種C. jejuni和C. coli菌株用通用引物對2的PCR結果的照片。
圖6是表示C. jejuni、C. coli和C. fetus菌株用通用引物對2的PCR結果的照片。
圖7是表示C. jejuni、C. coli和C. fetus菌株用特異性引物的多重PCR結果的照片。檢測到每種菌株獨特的CDT特異性擴增片段(C. jejuni, 750bp ；C. coli,400bp ； C. fetus,530bp)。
圖8表示C. jejuni、C. coli和C. fetus菌株用通用引物對1的PCR-RFLP的結果的照片。
圖9是表示多種C. jejuni、C. coli和C. fetus菌株用特異性引物的多重PCR結果的一系列照片。檢測到每種菌株獨特的⑶T特異性擴增片段(C. jejuni, 750bp ；C. coli, 400bp ；C. fetus, 530bp)。
圖10是表示限制酶HindIII消化C. fetus Col-187細胞的基因組后雜交結果的照片。
圖11是表示cdtA和cdtC用通用引物的PCR結果的照片。泳道2_8中cdtA衍生帶可見于約550bp ；泳道10-16中cdtC衍生帶可見于約320bp。
圖12是表示多種彎曲桿菌菌株的cdtA用通用引物PCR結果的系列照片。cdtA衍生帶可見于約550bp。
圖13是表示多種彎曲桿菌菌株的Cdtc用通用引物PCR結果的系列照片。Cdtc衍生帶可見于約320bp。
圖14是表示C. jejuni、C. coll和C. fetus菌株用cdtA和cdtC的特異性引物的多重PCR結果的照片。檢測到每種菌株獨特的cdtA特異性擴增片段(C. jejuni，630bp; C. coli，330bp ；C. fetus, 490bp)和 cdtC 特異性擴增片段(C. jejuni, 500bp ；C. coli, 400bp ；C. · fetus, 300bp)。
圖15是表示C. jejuni,C. coli和C. fetus菌株用cdtA特異性引物的多重PCR結果的系列照片。檢測到每種菌株獨特的cdtA特異性擴增片段。
圖16是表示C. jejuni,C. coli和C. fetus菌株用cdtC特異性引物的多重PCR結果的系列照片。檢測到每種菌株獨特的cdtC特異性擴增片段。
圖17顯示了 C. jejuni CDT的ORF和引物退火區域。
圖18顯示了 C. coli⑶T的ORF和引物退火區域。
圖19顯示了 C. fetus CDT的ORF和引物退火區域。
具體實施方式
〈多核苷酸〉
本發明提供了編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的多核苷酸。由本發明人鑒定，包含在本發明范圍之內的編碼C. coli的細胞致死腫脹毒素的多核苷酸序列在SEQ ID NO :1中示出。由該核苷酸序列編碼的三個多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO :2-4中示出。 SEQ ID NO :2，3和4分別對應于cdtA、cdtB和cdtC的氨基酸序列。
本發明還提供了編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的多核苷酸。由本發明人鑒定，包含在本發明范圍之內的編碼C. fetus的細胞致死腫脹毒素的多核苷酸序列在SEQ ID N0:51中示出。由該核苷酸序列編碼的三個多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO :52巧4中示出；SEQ ID NO 52,53和54分別對應于cdtA、cdtB和cdtC的氨基酸序列。
本發明的多核苷酸包括編碼具有SEQ ID NO :2-4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列的編碼區，即SEQ ID NO 1中第1-777位、802-1605位和1615-2187位中任一核苷酸序列的多核苷酸；以及具有與SEQ ID NO=I的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是由于遺傳密碼的簡并性，仍然編碼具有SEQ ID NO :2-4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本發明的多核苷酸還包括編碼具有SEQ ID NO :52巧4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；包含SEQ ID NO :51的核苷酸序列的編碼區，即SEQ ID NO :51中第1-702位、778-1629 位和1615-2187位中任一核苷酸序列的多核苷酸；以及具有與SEQ ID NO :51的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是由于遺傳密碼的簡并性，仍然編碼具有SEQ ID NO :52- 的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。[0122]本發明的多核苷酸進一步包括編碼功能上與由上述多核苷酸編碼的多肽等同的多肽，且其核苷酸序列與上述多核苷酸的全長序列有至少40%或更高，優選60%或更高， 更優選80 %或更高，甚至更優選90 %或更高，還更優選95 %或更高，仍更優選97 %或更高 (例如98-99%)的同一性的多核苷酸。核苷酸序列同一性可被測定，例如使用Karlin和 Altschul 的 BLAST 運算法則(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268,1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877,1993)。在此算法的基礎上已經開發了名為BLASTN的程序 (Altschul 等 J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990)。用 BLASTN 分析核苷酸序列時，例如，參數的設置如下分數=100，字長=12。當使用BLAST和GappedBLAST程序時，每個程序使用默認參數。這些分析方法的特定技術手段是已知的(//WWW. ncbi. nlm. nih. gov.)。本發明的多核苷酸包括具有與上述多核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸。
本發明的多核苷酸可從天然來源，如細菌細胞的基因組DNA中通過標準的克隆和篩選方法獲得。可選的，該多核苷酸從由細菌細胞的mRNA得到的cDNA庫中獲得。該多核苷酸還可使用商業可得的已知的技術來合成。
具有與本發明人鑒定的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO=I和51)高度同源的核苷酸序列的多核苷酸可被制備，例如可使用雜交技術(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel 等(1987)出版 JohnWiley&Sons Section 6.3-6.4)和基因擴增技術(PCR) (Current protocols inMolecular Biology edit. Ausubel 等(1987)出版 John ffiley&Sons Section6. 1_6. 4)。具體地，以本發明人鑒定的多核苷酸序列(例如SEQ ID N0:1和51)或其部分序列為基礎，可用已知的雜交技術分離與此序列高度同源的DNA。可選地，與多核苷酸序列高度同源的多核苷酸可用基因擴增技術分離，使用基于本發明人鑒定的多核苷酸序列的部分序列(例如SEQ ID N0:1和51)設計的引物。因此，本發明包括與具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸。嚴格雜交條件典型的是指1XSSC，0. 1% SDS和37°C的條件。更嚴格雜交條件是指0. 5 X SSC，0. 1% SDS和42°C的條件。還要嚴格的雜交條件是指0. 2 X SSC, 0. 1% SDS和65°C的條件。如上述的雜交條件越嚴格，與探針序列有更高的同源性的DNA可望被分離。然而，SSC,SDS和溫度條件的上述組合只是示范性的。本領域技術人員通過適當結合決定雜交嚴格程度的上述因素或其它因素(例如，探針濃度和長度以及雜交反應時間)，能夠獲得如上面所述的相同嚴格性。
含有與本發明人鑒定的多核苷酸序列高度同源的核苷酸序列的多核苷酸也可用在SEQ ID NO :1和51的核苷酸序列中引入突變的方法(例如定點突變(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel 等(1987)出版 John Wiley&Sons Section 8. 1-8. )來制備。這樣的多核苷酸也可能是自然發生的突變產生的。本發明包括編碼具有由于此類核苷酸序列突變，SEQ ID NO :2-4或52-54的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加而形成的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
當用本發明的多核苷酸生產本發明的多肽時，該多核苷酸包括成熟多肽或僅其片段的編碼序列，或者與其它編碼序列(例如，前導或分泌序列、前蛋白序列、原蛋白序列、前原蛋白序列或編碼其它融合肽部分的序列)處于相同閱讀框的成熟多肽或其片段的編碼序列。例如，可編碼有助于融合多肽純化的標記序列。在本發明的實施方案中，標記序列的優選實施例包括，例如，由pcDNA3. 1/Myc-His載體(Invitrogen)提供的，Gentz等，Proc.
14Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86 :821_824描述的六組氨酸肽或Myc標簽。該多核苷酸也可包括5’和3’非編碼序列，例如，轉錄但不翻譯的序列，剪接信號和聚腺苷酸化信號、核糖體結合位點和mRNA穩定序列。
〈多肽〉
本發明提供了本發明人鑒定的大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素多肽。本發明還提供功能上與本發明人鑒定的多肽等同的多肽。這里，“功能上等同”是指被關注的多肽具有的細胞致死腫脹毒素的特征與本發明人鑒定的多肽的相同。
本發明還提供了本發明人鑒定的胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素多肽。本發明進一步提供功能上與本發明人鑒定的多肽等同的多肽。這里，“功能上等同”是指被關注的多肽具有的細胞致死腫脹毒素的特征與本發明人鑒定的多肽的相同。
在蛋白質的氨基酸序列中引入突變是制備與本發明人鑒定的多肽功能上等同的多肽的一種手段。這些方法包括，例如定點突變(Current Protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel 等(1987)出版 John ffiley&Sons Section 8. 1-8. 5))。多肽的氨基酸突變也可能是自然發生的。本發明包括不論是人工地或是自然地產生的突變蛋白質， 其含有本發明人鑒定的氨基酸序列(如SEQ ID NO :2-4和52-54)，其中一個或多個氨基酸殘基通過取代、缺失、插入和/或添加所改變，仍然與本發明人鑒定的多肽在功能上等同。
從保留蛋白質功能的觀點來看，用于取代的氨基酸殘基優選具有與被取代的氨基酸殘基相似的特性(保守性取代)。例如Ala、Val、Leu、Ile、Pr0、Met、Phe和Trp都被劃分為非極性氨基酸，認為具有相似的特性。另外，不帶電氨基酸的實例有Gly、Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn和Gin。此外，酸性氨基酸的實例有Asp和Glu，而堿性氨基酸的實例有Lys、Arg 和 His。
只要突變的多肽保留原始多肽的功能，這些多肽的氨基酸突變的數量和位點沒有限制。突變的數量典型地是少于全部氨基酸殘基的10%，優選少于5%，更優選少于1%。
制備與本發明人鑒定的多肽功能上等同的多肽的其它手段包括利用雜交技術或者基因擴增技術的方法。更具體地，本領域技術人員在編碼本發明人鑒定的多肽的DNA序列(SEQ ID N0:1 和 51)的基礎上，通過用雜交技術(Current Protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel 等(1987)出版 John ffiley&Sons Section 6.3-6.4)從來自相同或不同物種的生物的DNA樣品中分離高同源性的DNA，能夠得到與本發明人確定的多肽功能上等同的多肽。因而，本發明的多肽也包括這樣的多肽，其由與編碼本發明人鑒定的多肽的DNA雜交的DNA編碼，與本發明人鑒定的多肽功能上等同。
將編碼與本發明人鑒定的多肽功能上等同的多肽的DNA分離需要的雜交嚴格程度通常是“lx SSC，0. SDS，37°C”的程度，更嚴格的雜交條件是“0. 5x SSC, 0. 1% SDS, 42°C”的程度，甚至更嚴格的雜交條件是“0.2x SSC，0. SDS，65°C”的程度。雜交條件越嚴格，預期分離的DNA與探針序列的同源性越高。然而，上述SSC、SDS和溫度條件的組合只是范例，本領域技術人員通過適當組合決定雜交嚴格程度的上述因素或其它參數(例如， 探針濃度、探針長度和雜交反應時間等)，能夠獲得如上所述相同的嚴格性。
用這些雜交技術分離的DNA編碼的多肽具有與本發明人鑒定的多肽的高同源性的氨基酸序列。這里，高同源性表示序列的同一性有至少40 %或更高，優選60 %或更高， 更優選80 %或更高，甚至更優選90 %或更高，還更優選95 %或更高，仍更優選97 %或更高(例如98-99% )。氨基酸序列同源性的測定，例如可使用Karlin和Altschul的BLAST運算法貝U (Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :2264_2268 (1990) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873-5877(1993))。在此運算法則的基礎上已經開發了被稱為BLASTX的程序(Altschul 等· J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990))。用BLASTX分析氨基酸序列時，參數的設置，例如 分數=50，字長=3。當使用BLAST和GappedBLAST程序時，每個程序使用默認參數。這些分析方法的特定技術手段是本領域已知的。
基于作為編碼本發明人分離的多肽的DNA序列的高度同源DNA而分離的DNA片段，利用基因擴增技術(PCR) (Current Protocols inMolecular Biology，edit. Ausubel 等 (1987)出版John ffiley&Sons Section6. 1-6.4)能夠獲得與本發明人分離的多肽功能上等同的多肽。這可通過根據編碼本發明人鑒定的多肽的DNA序列的一部分(SEQ ID N0:1和 51)通過設計引物而實現。
〈多肽的片段〉
本發明還提供了本發明多肽的片段。這些片段是具有與本發明所述多肽氨基酸序列的一部分而不是全部等同的氨基酸序列的多肽。本發明的多肽片段通常包括8個氨基酸殘基或更多，優選12個氨基酸殘基或更多(例如，15個氨基酸殘基或更多)。優選片段的例子包括截斷的多肽，如缺失了包括氨基末端或羧基末端的一段連續氨基酸殘基，或缺失了兩段連續氨基酸殘基，一段包括氨基末端，另一段包括羧基末端。此外，還可優選包含結構或功能特征的片段，它們包括α-螺旋和α-螺旋形成區、β-折疊和β-折疊形成區、 轉角和轉角形成區、卷曲和卷曲形成區、親水區、疏水區、α-兩親區、β-兩親區、可變區、 表面形成區、底物結合區以及高抗原指數區。也優選生物學活性片段。生物學活性片段介導本發明多肽的活性，其包括那些具有相似活性、改進活性、或減少非期望活性的片段。例如，包括那些在動物，特別是人體內具有抗原性或免疫原性的片段。這些多肽片段優選保留本發明的多肽的生物學活性，如抗原性。特定序列或其片段的突變體也組成了本發明的一方面。優選的突變體由于保守性氨基酸(即其中的殘基用具有相似特性的殘基進行取代的氨基酸)取代，而與被試多肽的突變體不同。典型的取代是那些在Ala、Val、Leu、與Ile 之間；Ser與Thr之間；酸性殘基Asp與Glu之間；Asn與Gln之間；堿性殘基Lys與Arg之間；或芳香族殘基Phe與Tyr之間的取代。
〈多肽的制備〉
可用任何合適方式制備本發明的多肽。這些多肽包括分離的天然存在的多肽、通過基因重組或人工合成生產的多肽、或由這些方法結合生產的多肽。制備這些多肽的程序是本領域公知的。重組多肽的制備，例如可通過將插入本發明多核苷酸的載體轉移到合適的宿主細胞中，純化得到在轉化體里表達的多肽。另一方面，天然存在多肽的制備，例如可使用固定有排斥本發明多肽的抗體(如下所述)的親和柱(Current Protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel 等(1987)出版 John Wiley&Sons, Section 16.1-16.19)。用于親和純化的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明的多肽還可通過體外轉譯等方法(例如，參見“On the fidelity of mRNA translation in the nuclease-treated rabbitreticulocyte lysate system"Dasso, M. C.禾口 Jackson, R.J. (1989)NAR 17 :3129_3144)和類似方法制備。本發明多肽片段的制備，例如可通過使用合適的肽酶裂解本發明的多肽。[0141]〈探針，引物〉
本發明提供了具有至少15個核苷酸鏈長的核苷酸，其與本發明人鑒定的多核苷酸互補(例如，具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈和具有SEQ ID NO 51的核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈)。這里，術語“互補鏈”定義為由A:T(RNA中是 A:U)和G:C堿基對組成的雙鏈核酸中的另一條鏈。此外，術語“互補的”不僅包括在至少 15個相續核苷酸的連續區域內完全匹配，也包括在該區域內至少有70%，優選至少80%， 更優選90%，最優選95%或更高的同源性。同源性可用所述的運算法則來確定。這些多核苷酸也包括用于檢測或擴增本發明多肽的探針和引物。用作引物的典型多核苷酸是15-100 個核苷酸長的，優選15-35個核苷酸長的。可選地，用作探針的多核苷酸是至少有15個核苷酸，優選至少有30個核苷酸的核苷酸。它們包含本發明至少一部分DNA序列或全部DNA序列。用本發明核苷酸作引物時，核酸擴增反應沒有特殊限制，只要能夠得到目標擴增產物。 例如，該反應可選自DNA擴增反應，如聚合酶鏈反應(PCR)、ICAN、LAMP、SDA和LCR，以及如 NASBA的RNA擴增反應。優選的方法是PCR。
在一個實施方案中，這樣的核苷酸是那些對編碼本發明多肽的DNA有特異性的核苷酸。術語“特異性的”是指在常規雜交條件下，優選嚴格條件下，只與編碼特定多肽的DNA 雜交，而不與編碼其它多肽的DNA雜交。優選的實施方案是只與編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA(SEQ ID NO 1)雜交，不與編碼空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA雜交的多核苷酸。這些多核苷酸包括，例如選自SEQ ID NO :13、14、28-36、70、71、76和77的引物對。可選地，優選的實施方案是只與編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA (SEQ ID NO 51)雜交，不與編碼空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA雜交的多核苷酸。這些多核苷酸包括，例如選自 SEQ ID N0:15、16、37-46、72、73、78和79的引物對。
此外，由于實施例中鑒定了編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組 DNA(SEQ ID NO :1)，本發明人找到了編碼空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的特異性核苷酸序列。因而，本發明還提供了編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的特異性引物對和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組 DNA的特異性引物對。編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的特異性引物對包括，但不限于，例如SEQ ID N0:ll、12和17-27的引物對。編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的特異性引物對包括，但不限于，例如SEQ ID NO :15、16和37-46 的引物對。
此外，由于實施例中編碼大腸彎曲桿菌(SEQ ID NO 1)和胚胎彎曲桿菌(SEQ ID N0:51)的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的鑒定，本發明人找到了編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物(能夠擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的所有基因組DNA的引物)。本發明也提供了這些通用引物。 優選的通用引物包括，例如SEQ ID N0:64和65的引物(擴增cdtA DNA), SEQ ID NO :7_10 和47-50的引物(擴增cdtB DNA)和SEQ ID NO 66和67的引物(擴增cdtCDNA)。
本領域技術人員能夠合理地制備包含一個或多個與上述引物不同的核苷酸的引物，但能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增。上述引物退火的基因組DNA區域如附圖17-19所示。本發明還提供了這種突變體引物。如上所述，本發明的引物應用的核酸擴增反應沒有特殊限制，只要產生目標擴增產物。例如，該反應可選自DNA擴增反應， 如PCR(聚合酶鏈反應)、ICAN、LAMP、SDA和LCR，以及如NASBA的RNA擴增反應。優選的方法是PCR。基于上述引物，本領域技術人員能夠設計出適用于執行核酸擴增方法的突變體引物。這些突變體引物可以人工合成制備。通過用突變體引物進行核酸擴增反應并分析擴增產物，能夠容易地評定突變體引物能否擴增與原始引物擴增的相同基因組DNA區域。
這些引物優選用于檢測待測樣品中的彎曲桿菌。
<載體、宿主細胞和多肽的制備>
本發明還提供了生產攜帶本發明多核苷酸的載體，生產保留本發明多核苷酸或所述載體的宿主細胞以及利用所述宿主細胞生產本發明多肽的方法。
本發明的載體沒有限制，只要載體中插入的DNA能夠穩定地保留。例如 pBluescript載體(Stratagene)是用大腸桿菌作宿主細胞時優選的克隆載體。當用載體生產本發明的多肽時，表達載體特別有用。這些表達載體沒有特殊限制，只要它們在體外、 大腸桿菌中、培養細胞中或體內表達多肽。然而，優選的實例包括用于在體外表達的PBEST 載體(ProMega)、用于在大腸桿菌中表達的pET載體(Invitrogen)、用于在培養細胞表達 WpME 18S-FL3 載體(GenBankAccession No. AB009864)和用于在體內表達的 pME 18S 載體(Mol. CellBiol. 8 :466-472 (1988))等。本發明的DNA可用常規方法插入載體中，例如通過限制性酶切位點的酶連反應(Current Protocols in MolecularBiology, edit. Ausubel 等，(1987)出版 John Wiley & Sons, Section 11.4-11.11)。
引入本發明載體的宿主細胞沒有特殊限制，根據本發明的目的可使用各種宿主細胞。例如，細菌細胞(如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈霉菌和枯草桿菌)、真菌細胞(如酵母菌和曲霉菌)、昆蟲細胞(如果蠅S2和草地夜蛾SF9)、動物細胞(如CH0、C0S、HeLa、C127、 3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤細胞)以及植物細胞都是用于表達多肽的細胞的例子。載體轉染宿主細胞可使用常規方法進行，如磷酸鈣沉淀法、電穿孔法(Current protocols in Molecular Biology, edit.，Ausubel 等，(1987)出版 John ffiley&Sons, Section 9. 1-9.9)、 脂質體轉染胺法(GIBCO-BRL)和顯微注射法等。
宿主細胞中，為了有利于表達的多肽分泌到內質網腔、細胞間隙或胞外環境中，可以將合適的分泌信號摻入到感興趣的多肽。這些信號可以是內源信號，或者是來自與所述目的多肽不同的種類的信號。
本發明的多肽分泌到培養介質中，收集培養介質以回收本發明的多肽。當在細胞內產生本發明的多肽時，首先裂解細胞，然后收集多肽。
為了從重組細胞培養物中收獲和純化本發明的多肽，可使用本領域已知的方法， 包括硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子交換層析或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。
〈抗體〉
本發明提供了結合本發明多肽的抗體。這里，術語“抗體”是指多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、包括Fab的Fab片段或免疫球蛋白表達文庫的其它產物。
本發明的多肽或其片段、或其類似物、或其表達物細胞可用于生產結合本發明多肽的抗體的免疫原。抗體優選對本發明的多肽有免疫特異性的。術語“免疫特異性”是指同其它多肽相比，抗體對本發明的多肽具有很高的親和力。
結合本發明的多肽的抗體，可使用本領域技術人員已公知的方法制備。例如，多克隆抗體可按如下方法獲得將本發明的多肽或其GST融合蛋白施予小動物(比如兔子)以獲得血清。多克隆抗體通過用硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析以及親和柱(本發明的多肽在其中偶聯)等方法純化血清來制備。另一方面，單克隆抗體可按如下方法獲得，例如將本發明的多肽施予小動物(如小鼠)，隨后摘除脾臟并碾碎分離脾細胞。 用如聚乙二醇的試劑使脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞融合，并從融合細胞(雜交瘤細胞)中篩選能夠生產結合本發明的多肽的抗體的克隆。然后將得到的雜交瘤細胞移植到小鼠的腹膜腔內，并從小鼠體內收集腹水。單克隆抗體通過用例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、 DEAE離子交換層析以及親和柱(本發明的多肽在其中偶聯)等方法純化腹水來制備。
本發明的抗體也可用于檢測和純化待測樣品中本發明的多肽。
<待測樣品中彎曲桿菌的檢測>
本發明提供了檢測待測樣品中彎曲桿菌的方法。檢測待測樣品中的彎曲桿菌有多種用途，例如診斷彎曲桿菌病、快速檢測被彎曲桿菌污染的食物、驗證食品加工方法的正確性以及食物中毒爆發時鑒定病原菌。
在一個實施方案中，本發明的檢測方法，用于檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的存在，其包括的步驟有
(a)用編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA的特異性引物對的混合物對待測樣品進行聚合酶鏈反應；和
(b)根據從編碼上述細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的分子量或存在來確定這些細菌的存在；
在一個可選的實施方案中，本發明的檢測方法，用于檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的存在，其包括的步驟有
(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應；
(b)用步驟(a)中擴增的基因組DNA作為模板和編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA的特異性引物對的混合物對待測樣品進行聚合酶鏈反應；和
(c)根據從編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的分子量或存在來確定這些細菌的存在。
如在實施例中，在一個反應體系中使用多個PCR引物的PCR稱為“多重PCR”。通過對PCR產物的電泳和檢測其帶的尺寸大小可同時鑒定多個細菌種類。本發明提供了通過核酸擴增方法(包括多重PCR作為典型例子)使用適合擴增多個核酸區域的引物或它們的混合物檢測彎曲桿菌的方法。本發明核酸擴增方法的類型沒有限制，只要能夠得到期望擴增產物。優選的方法是PCR。
這些方法中使用的特異性引物對的混合物包括，例如，下面引物對的混合物
(a)選自SEQ ID NO :13、14和28_36以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增的的引物對；
(b)選自SEQ ID NO :11、12和17-27以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對；和
(c)選自SEQ ID NO :15、16和37_46以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對，或者能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對。
此外，選自例如SEQ ID NO :7_10和47_50，或者能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對可用作通用引物對。
在本發明的進一步實施方案中，檢測方法是用于檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、 空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在的方法，其包括的步驟有
(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應；
(b)用限制酶消化步驟(a)中擴增的基因組DNA，和；
(c)根據由消化獲得的DNA片段的分子量來確定這些細菌的存在。該方法中使用的限制酶沒有特殊限制，只要它能夠鑒定編碼C. jejuni、C. coli和C. fetus的細胞致死腫脹毒素的基因組 DNA，包括，例如 Sau3AI、Dsa I、Mbo I、Rsa I、EcoRI、Hinf I、Nde I、Pst I、Xba I和Xho II。同時，通用引物對的例子包括選自SEQ IDNO :7_10和47-50以及能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對。
如下面實施例描述的用于檢測基于多種限制酶消化PCR擴增的DNA產生片段的長度的多態性的方法稱為PCR-RFLP (PCR限制性片段長度多態性)。本發明還提供了基于多種限制酶處理通過核酸擴增方法擴增的DNA產生的片段長度的檢測多態性方法中適用的引物，該方法包括PCR-RFLP作為代表實例。
在本發明的另一個實施方案中，檢測方法是用于檢測待測樣品中彎曲桿菌存在的方法，其包括的步驟有
(a)用能夠擴增編碼彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應；和
(b)根據從編碼彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的分子量或存在來確定彎曲桿菌的存在。該方法所用的引物對是能夠擴增編碼任何種類的彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。這些通用引物對包括，例如選自SEQ ID NO 7-10,47-50和64-67的引物對。如上所述，上述的引物對是能擴增編碼三個種類，即大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的所有基因組DNA的通用引物對。上述的引物對可以期望不僅能夠擴增編碼上述三個種類的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA，而且能夠擴增其它彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA。同樣地，能像上述引物對一樣對相同基因組DNA區域進行擴增的引物對可擴增上述三個種類的基因組區域和其它彎曲桿菌的基因組區域。
本發明還提供了上述本發明檢測方法中使用的試劑盒。這些試劑盒除包括上述引物對外，還包括說明書手冊。試劑盒也可包括其它成分。
彎曲桿菌的檢測既可在蛋白質水平進行，又可在如上述的DNA水平進行。待測樣品中細菌的存在可通過，例如，用蛋白質印跡、斑點印跡、免疫沉淀、酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、免疫熒光或使用對細菌的細胞致死腫脹毒素具有特異性的抗體的方法檢測該細菌的細胞致死腫脹毒素來評定。
這里所有引用的現有技術文件都并入作為參考。
實施例
[實施例1]彎曲桿菌的菌株
使用在2001-2003年從多個臨床樣品中收集的C. jejuni, C. coli和C. fetus。 每個菌株在含有5%去纖維蛋白的馬血(日本生物材料中心)和彎曲桿菌選擇補充劑 SR69 (OXOID)的血瓊脂平板(BloodAgar Base No. 2 :0X0ID)上培養。C. jejuni 和 C. coli 在42°C的5% O2,10% CO2和85% N2氣中培養，而C. fetus在25°C的低溫02/C02氣體孵育箱中培養(M0DEL9200 =Wakenyaku Co.，Ltd)。
[實施例2]PCR模板的制備
刮取每種細菌的五個克隆子，懸于500μ1無菌PBS。得到的細菌以轉速為 10，OOOrmp 離心洗滌 5min(MRX-150 =TOMY SEIKOCo.，Ltd.)，然后重新懸于 300 μ 1 無菌 PBS0然后，懸液在沸水槽中煮沸lOmin，再在冰上冷卻。將懸液以15，OOOrmp的轉速離心 lOmin，收集所得的上清液。收集的上清液中DNA的量用分光光度儀(Ultrospec 3100pro Amersham Biosciences)定量。每份定量的細胞抽提物稀釋至20ng/μ 1，然后作PCR。
[實施例3]C.coli cdtB探針的制備和DNA雜交
通過用引物GNW和LPF-D、DIG標記混合物(Roche)以及作為模板的C. coli Col-192細胞抽提物進行PCR標記制備了 C. colicdtB探針。
具體地，為了檢測C. coli⑶T基因的存在，通過用文獻中記載的簡并引物GNW[SEQ ID NO :5 :5，-GG(ACGT)AA(CT)TGGAT(ACT)TGGGG(ACGT)TA-3，]禾口 LPF-D[SEQ ID NO 6 5'擴增帶與pT7載體(Novagen)連接，并用連接物轉化大腸桿菌(E. coli JM109) 細胞。用測序儀(ABI PRI SM 377 DNA測序儀；Applied Biosystems)對得到的克隆子測序，顯示與cdtB類似的序列。測序反應中使用BigDye終止循環測序試劑盒 (AppliedBiosystems) 0此外，發現了 SOObp帶(圖1中的箭頭2)是由cdtB衍生的第二條帶，其被擴增是由于引物GNW是混合引物。
20μ g 的 C. coli Col-192 基因組 DNA 用 60U 的限制酶 HindIII 在 37°C 消化 12 小時° 然后，按常規方法(Molecular cloning :a laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, (2001))用制備的探針進行 DNA 印跡和 DNA-DNA 雜交。
在42°C的嚴格條件下進行雜交。印跡后，印跡點室溫下用2xSSC/0. 1% SDS溶液清洗兩次，每次5min，然后60°C用0. 2xSSC/0. 1% SDS溶液清洗兩次，每次15min。
結果，發現探針陽性帶約為3kbp和4kbp(圖2)。3kbp帶與pUC18載體連接。連接物將E. coli JM109轉化，得到一個含有cdtB區的克隆子(3k44)。
[實施例4]C.coli cdtB基因的測序
用常規方法對含有實施例3中得到的C. coli cdtB區的克隆子3k44測序。測定
21的C. coli CDT區全長序列如SEQ ID NO 1所示。
[實施例5]通用引物對1的設計和PCR
將本發明的C. coli⑶T序列與來自已知數據庫的C. jejuni⑶T基因進行比較設計了如下述的通用引物U和通用引物R。將引物混合，然后加到1 20ng/yl的細胞抽提物中，使每個引物的濃度為0. 5mM。用PCR緩沖液(TaKaRa Ex Taq kit =Takara Bio)將終體積調整到20 μ 1。反應混合物在94°C 3min，30個循環[94°C 30s，55°C 30s, 72°C lmin] 以及72°C 3min的條件下作PCR。結果如圖3所示。發現了約1900bp的擴增片段，因而檢測到源自C. jejuni (泳道2-4)和C. coli (泳道5_6)的CDT衍生帶。
通用引物U[SEQ ID NO 7 =GATAA (CT) GATCCTTTAAAACT]
通用引物R[SEQ ID NO 8 (AT) (AT) CCAAAGCG (AT) TTTT (CG) TATGG]
[實施例6]通用引物對2的設計和PCR
同樣地，設計如下所示的通用引物Up和通用引物Do，并在94°C 3min，30個循環 [94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 45s]以及72°C 3min的條件下進行PCR。結果如圖4-6所示。 發現了約720bp的擴增片段。
通用引物Up[SEQIDN0:9:ACTTGGAATTTGCAAGGC]
通用引物Do[SEQ ID NO :10 :TCTAAAATTTAC(ACT)GGAAAATG]
[實施例7]特異性引物的設計和用多重PCR的CdtB基因的檢測
將本發明的C. coli⑶T序列與來自已知數據庫的C. jejuni⑶T基因進行比較設計了如下述的C. jejuni特異性引物CjSPBU3和CjSPBR3。同樣地，設計了 C. coli特異性引物 CcSPBU5 和 CcSPBR5 以及 C. fetus 特異性引物 CfSPBUl 和 CfSPBRl。
將引物混合，然后加到Iy 1 20ng/yl的細胞抽提物中，使每個引物的濃度為 0. 5mM。用PCR緩沖液(TaKaRa Ex Taq kit :TakaraBio)將終體積調整到20 μ 1。反應混合物在 94°C 3min，30 個循環[94°C 56s, 55°C 30s, 72°C 45s]以及 72°C 3min 的條件下作多重 PCR(GeneAmp PCR system 9700 ；Applied Biosystems).。結果如圖 7 所示。發現了 C. jejuni特異性CDT擴增片段(約750bp)、C. coli特異性CDT擴增片段(約400 bp)和 C. fetus特異性CDT擴增片段(約530bp)，這樣可區分C. jejuni (泳道2-4)、C. coli (泳道 5-6)和 C. fetus (泳道 7-8)。
特異性引物CjSPBU3[SEQ ID NO :11 :TACTCCGCCTTTTACCGCA]
特異性引物CjSPBR3[SEQ ID NO 12 :GAGTATAGGTTTGTTGTC]
特異性引物CcSPBU5[SEQ ID NO 13 :TTTAATGTATTATTTGCCGC]
特異性引物CcSPBR5[SEQ ID NO 14 :TCATTGCCTATGCGTATG]
特異性引物CfSPBUl [SEQ ID NO :15 :CGCAAGTTGGAAGACTAT]
特異性引物CfSPBRl [SEQ ID NO :16 :TTTATTATCGCCGGAGCA]
[實施例8]用通用引物對1通過PCR-RFLP鑒定細菌種類
用實施例6中獲得的通用引物對1進行PCR后，向8. 5μ 1反應溶液中加入5U的限制酶Sau3AI (NEB)。得到的混合物在37°C反應3h，然后電泳。結果如圖8所示。
[實施例9]通過用特異性引物多重PCR的cdtB基因檢測
用實施例7中獲得的特異性引物和實施例7中實驗條件對其它多種臨床彎曲桿菌菌株進行多重PCR。結果如圖9所示。與實施例7中的情況一樣，發現了 C. jejuni特異性CDT擴增片段(約750bp)、C. coli特異性CDT擴增片段(約400bp)和C. fetus特異性CDT 擴增片段(約530bp)，可使每種細菌區別開來。
[實施例10]C. fetus cdtB探針的制備和DNA雜交
通過用引物對2(通用引物Up和Do)、DIG標記混合物(Roche)以及作為模板的 C. fetus Co 1-187細胞抽提物進行PCR標記制備了 C. fetus cdtB探針。
20μ g 的 C. fetus Col-187 基因組 DNA 用 60U 的限制酶 HindIII 在 37°C 消化 12 小時° 然后，按常規方法(Molecular cloning :a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, (2001))用制備的探針進行 DNA 印跡和 DNA-DNA 雜交。此雜交在42°C的嚴格條件下進行。印跡后，室溫下印跡點用2xSSC/0. 1% SDS溶液清洗兩次， 每次5min，然后60°C用0. 2xSSC/0. 1% SDS溶液清洗兩次，每次15min。
結果，發現探針陽性帶約2kbp和5kbp (圖10)。2kbp帶與pUC18載體連接。連接物將E. coli JM109轉化，得到一個含有cdtB區的克隆子(Cf78)。
[實施例11]C. fetus CDT基因的測序
用常規方法對實施例10中得到的含有C. fetus cdtB區的克隆子Cf78測序以確定C. fetus的cdtA區和cdtB區的序列。因為克隆子Cf78不含有cdtC區，通過在下述的條件下基于測定的cdtB基因序列，用隨機引物進行基因步移測定了 cdtC區的序列。因而， 測定的C. fetus CDT區全長序列如SEQ ID NO 51所示。
[使用隨機引物的基因步移]
基于實施例11測定的基因序列設計了如下所述的由隨機引物、目標擴增引物和測序引物組成的引物組。用C. fetus Col-187基因作為目標擴增的模板。為了進行目標擴增，IOpmol的隨機引物加到20ng的模板基因中，用KOD Dash PCR Kit (Τ0Υ0Β0)將終體積調整到 ΙΟΟμ 1。反應混合物在 94°C 2min 以及 35 個循環[94°C 20s，65°C 5s，74°C 30s]72°C 3min的條件下作PCR。
用測序引物按常規方法對獲得的PCR產物測序。
引物組1
隨機引物[SEQ ID NO :55 :GCTTGTAGCAGTATTGATGCNNNNNNNNN]
目標擴增引物[SEQ ID NO :56 :GCTTGTAGCAGTATTGATGC]
測序引物[SEQID NO :57 :CTAGTTTCGGACCATTTTCC]
引物組2
隨機引物[SEQ ID NO 5 8 :ATACGCAATGCAAACACCGGNNNNNNNNN]
目標擴增引物[SEQ ID NO :59 :ATACGCAATGAAACACCGG]
測序引物[SEQID NO :60 :TAAAAGCGATTTTCAGGGCAG]
引物組3
隨機引物[SEQ ID NO :61 :TGTCGACATAGAGCCTAAACNNNNNNNNN]
目標擴增引物[SEQ ID NO :62 :TGTCGACATAGAGCCTAAAC]
測序引物[SEQID NO :63 :ATTTTCACCGCCGCTTAGTG]
[實施例12]cdt A通用引物的設計和PCR
將本發明的C. coli和C. fetus的cdtA序列與來自已知數據庫的C. jejuni的 cdtA基因進行比較設計了如下述的通用引物U和通用引物R。將引物混合，然后加到Iy 120ng/y 1的細胞抽提物中，使每個引物的濃度為0. 25mM。用PCR緩沖液(TaKaRa Ex Taq kit =Takara Bio)將終體積調整到20 μ 1。反應混合物在94°C 3min,30個循環[94°C 30s， 55°C 30s, 72 °C 30s]以及72 °C 3min的條件下作PCR.。結果如圖11 (左邊)所示。發現了約550bp的擴增片段。因而，檢測到所有C. jejuni (泳道2-4)、C. coli (泳道5-6)和 C. fetus (泳道7-8)的cdtA衍生帶。
CdtA通用引物U
[SEQ ID NO 64 (GA) A (ACT) GAT (AC) (AC) (TAG) GAT (AC) GATCC (AT) (TC) CAAA]
CdtA通用引物R
[SEQ ID NO 65 (GA) (AT) AA (TC) AGG (TC) G (CT) TTG (CT) A (AT) (GA) CA]
[實施例13]用cdtA通用引物通過PCR檢測cdtA基因
用實施例12中獲得的通用引物和實施例12中的實驗條件對其它多種臨床彎曲桿菌菌株進行PCR。結果如圖12所示。與實施例12中的情況一樣，發現了 cdtA特異性擴增片段(約550bp)。
[實施例14]cdtC通用引物的設計和PCR
將本發明的C. coli和C. fetus的cdtC序列與來自已知數據庫(BLAST)的 C. jejuni cdtC基因進行比較設計了如下述的通用引物U和通用引物R。
將1 μ 1 20ng/ μ 1的細胞抽提物和引物混合，使每個引物的濃度為0. 25mM。用 PCR緩沖液(TaKaRa Ex Taq kit Takara Bio)將終體積調整到20 μ 1。反應混合物在 940C 3min，30 個循環[94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s]以及 72°C 3min 的條件下作 PCR.。結果如圖3所示。發現了約320bp的擴增片段。因而，檢測到所有C. jejuni (泳道10-12)、 C. coli (泳道13和14)和C. fetus (泳道15和16)的cdtC擴增帶(圖11，右邊)。
CdtC通用引物U
[SEQ ID NO 66 (AGC) A (TG) (TC) (TC) (AT) (AG) (AT) (AT) (GT) A (CT) CAAAA (CT) TGG]
CdtC通用引物R
[SEQ ID NO 67 (AGC) CTA (AGT) (AT) CC (AT) A (AC) (GT) C (GT) (AT) T (CT) TT (GC)]
[實施例15]用cdtC通用引物通過PCR檢測cdtC基因
用實施例中獲得的通用引物和實施例14中的實驗條件對其它多種臨床彎曲桿菌菌株進行PCR。結果如圖13所示。與實施例14中的情況一樣，發現了 cdtC特異性擴增片段(約 320bp)。
[實施例16]cdtA特異性引物的設計和用多重PCR檢測cdtA基因
將本發明的C. fetus的CDT序列與來自已知數據庫(BLAST)的C. jejuni和C. coli 的CDT基因進行比較設計了如下述的C. jejuni特異性引物CjASPU2和CjASra2。同樣地，設計了 C. coli特異性引物CcASPUI和CcASPRI以及C. fetus特異性引物CfASPUl和CfASPRl。
將引物混合，并加到Iyl 20ng/yl的細胞抽提物中，使每個引物的濃度為 0. 125mM0用PCR緩沖液(TaKaRa Ex Taq kit TakaraBio)將終體積調整到20 μ 1。反應混合物在 94°C 3min，30 個循環[94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s]以及 72°C 3min 的條件下作多重PCR(GeneAmp PCR system 9700 ；Applied Biosystems)。結果如圖 14(左邊)所示。發現了 C. jejuni特異性CDT擴增片段(約630bp)、C. coli特異性CDT擴增片段(約330bp)和C. fetus特異性CDT擴增片段(約490bp)，這樣可區分C. jejuni (泳道2-4)、C. coli (泳道5和6)和C. fetus (泳道7和8)。
特異性引物CjASPU2[SEQ ID NO :68 :AGGACTTGAACCTACTTTTC]
特異性引物CjASPR2[SEQ ID NO :69 :AGGTGGAGTAGTTAAAAACC]
特異性引物CcASPUl [SEQ ID NO 70 :ATTGCCAAGGCTAAAATCTC]
特異性引物CcASPRl [SEQ ID NO :71 :GATAAAGTCTAAAACTGC]
特異性引物CfASPUl [SEQ ID NO :72 :AACGACAAATGTAAGCACTC]
特異性引物CfASPRl [SEQ ID NO 73 TATTTATGCAAGTCGTGCGA]
[實施例17]用cdtA特異性引物通過多重PCR檢測cdtA基因
用實施例中獲得的特異性引物和實施例14中的實驗條件對其它多種臨床彎曲桿菌菌株進行多重PCR。結果如圖15所示。與實施例14中的情況一樣，發現了 C. jejuni 特異性cdtA擴增片段(約630bp)、C. coli特異性cdtA擴增片段(約330bp)和C. fetus 特異性cdtA擴增片段(約490bp)，可使每種細菌區別開來。
[實施例18]cdtC特異性引物的設計和用多重PCR檢測cdtC基因
將本發明的C. fetus的⑶T序列與來自已知數據庫的C. jejuni和C. coli的⑶T 基因進行比較設計了如下述的C. jejuni特異性引物CjCSPUl和CjCSra2。同樣地，設計了 C. coli特異性引物CcCSPUI和CcCSPRI以及C. fetus特異性引物CfCSPU2和CfCSPRl
將引物混合，并加到Ιμ 20ng/yl的細胞抽提物中，使每個引物的濃度為 0. 125mM0 用 PCR 緩沖液(TaKaRa Ex Taq kit :TakaraBio)將終體積調整到 20 μ 1。反應混合物在 94°C 3min，30 個循環[94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s]以及 72°C 3min 的條件下作多重 PCR(GeneAmp PCR system 9700 ；Applied Biosystems)。結果如圖 14(右邊)所示。發現了 C. jejuni特異性⑶T擴增片段(約500bp)、C. coli特異性⑶T擴增片段(約 300bp)和C. fetus特異性CDT擴增片段(約400bp)，這樣可區分C. jejuni (泳道10-12)、 C. coli (泳道 13 和 14)和 C. fetus (泳道 15 和 16)。
特異性引物CjCSPUl [SEQ ID NO 74 :TTTAGCCTTTGCAACTCCTA]
特異性引物CjCSPR2[SEQ ID NO :75 :AAGGGGTAGCAGCTGTTAA]
特異性引物CcCSPUl [SEQ ID NO 76 TAGGGGATATGC ACGCAAAAG]
特異性引物CcCSPRl [SEQ ID NO 77 :GCTTAATACAGTTACGATAG]
特異性引物CfCSPU2[SEQ ID NO :78 :AAGCATAAGTTTTGCAAACG]
特異性引物CfCSPRl [SEQ ID NO :79 :GTTTGGATTTTCAAATGTTCC]
[實施例19]用特異性引物通過多重PCR檢測cdtC基因
用實施例中獲得的特異性引物和實施例14中的實驗條件對其它多種臨床彎曲桿菌菌株進行多重PCR。結果如圖16所示。與實施例14中的情況一樣，發現了 C. jejuni特異性cdtC擴增片段(約500bp)、C. coli特異性cdtC擴增片段(約300bp)和C. fetus特異性cdtC擴增片段(約400bp)，可使每種細菌區別開來。
工業實用性
本發明的引物不僅可應用到流行病學研究、彎曲桿菌的研究和彎曲桿菌病的診斷，而且可用于快速檢測被彎曲桿菌污染的食物、驗證食品加工方法的正確性以及食物中毒爆發時鑒定病原菌，因此可用于防止感染的擴散。
權利要求
1.檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在，從而快速檢測被彎曲桿菌污染的食品或者驗證食品加工方法的正確性的方法，其包括的步驟有(a)用能擴增編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應，其中該通用引物對如SEQ ID NO 9禾口 10所示；禾口(b)根據編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的存在或分子量來確定這些細菌的存在。
2.檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在與否，從而快速檢測被彎曲桿菌污染的食品或者驗證食品加工方法的正確性的方法，其包括的步驟有(a)用編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA的特異性引物對的混合物對待測樣品進行核酸擴增反應；和(b)根據編碼上述細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的存在或分子量來確定細菌的存在與否，其中該方法使用(i)、(ii)或(iii)作為混合物的特定引物對(1)(1)如SEQ ID NO :70和71所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :68和69所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID NO :72和73所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；( )(1)如SEQ ID N0:13和14所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :11和12所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID N0:15和16所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(iii)(l)如SEQ ID NO :76和77所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :74和75所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID NO :78和79所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。
3.檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在與否，從而快速檢測被彎曲桿菌污染的食品或者驗證食品加工方法的正確性的方法，其包括的步驟有(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應；(b)用步驟(a)中擴增的基因組DNA作為模板和編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA的特異性引物對的混合物對待測樣品進行核酸擴增反應；和(c)根據編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA中擴增片段的存在或分子量來確定細菌的存在與否，其中該方法使用(i)、(ii)或(iii)作為混合物的特定引物對(1)(1)如SEQ ID NO :70和71所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :68和69所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID NO :72和73所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；( )(1)如SEQ ID N0:13和14所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :11和12所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID N0:15和16所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(iii)(l)如SEQ ID NO :76和77所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :74和75所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID NO :78和79所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。
4.權利要求
3的方法，其中通用引物對是如SEQID NO 64和65所示序列的引物對。
5.權利要求
3的方法，其中通用引物對是如SEQID NO 9和10所示的引物對。
6.權利要求
3的方法，其中通用引物對是如SEQID NO 66和67所示序列的引物對。
7.檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在，從而快速檢測被彎曲桿菌污染的食品或者驗證食品加工方法的正確性的方法，其包括的步驟有(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的cdtB亞基的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應，其中該通用引物對如SEQ ID NO 9和10所示；(b)用限制酶消化步驟(a)中擴增的基因組DNA，和；(c)根據由消化獲得的DNA片段的分子量確定細菌的存在。
8.權利要求
7的方法，其中限制酶選自:Sau3AI、DsaI、MboI、RsaI、EcoRI、Hinf I、 Nde I、Pst I、Xba I 和 Xho II。
9.在檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在的方法中使用的試劑盒，其包含說明書手冊和能擴增編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對，其中該通用引物對如SEQ ID NO 9和10 所示。
10.在檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在與否的方法中使用的試劑盒，其包含說明書手冊和編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的各個基因組DNA的特異性引物對的混合物，其中該方法使用(i)、(ii)或(iii)作為混合物的特定引物對(1)(1)如SEQ ID NO :70和71所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :68和69所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID NO :72和73所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；( )(1)如SEQ ID N0:13和14所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :11和12所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID N0:15和16所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(iii)(l)如SEQ ID NO :76和77所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(2)如SEQID NO :74和75所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(3)如SEQID NO :78和79所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。
11.權利要求
10的試劑盒，還包含能擴增編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的通用引物對。
12.權利要求
11的試劑盒，其中通用引物對是如SEQID NO 64和65所示序列的引物對。
13.權利要求
11的試劑盒，其中通用引物對是如SEQID NO 9和10所示的引物對。
14.權利要求
11的試劑盒，其中通用引物對是如SEQID NO 66和67所示序列的引物對。
15.在檢測待測樣品中大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌存在的方法中使用的試劑盒，其包含說明書手冊和能擴增編碼大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌和胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的cdtB亞基的基因組DNA的通用引物對，其中該通用引物對如SEQ ID NO 9和10所示，所述方法包括如下步驟(a)用能擴增編碼這些細菌的細胞致死腫脹毒素的cdtB亞基的基因組DNA的通用引物對對待測樣品進行核酸擴增反應，其中該通用引物對如SEQ ID NO 9和10所示；(b)用限制酶消化步驟(a)中擴增的基因組DNA;和(c)根據由消化獲得的DNA片段的分子量確定細菌的存在。
16.如SEQID N0:9和10所示的引物對，用于擴增編碼彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA。
17.下述引物對的混合物(a)如SEQID NO :70和71所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(b)如SEQID NO :68和69所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(c)如SEQ ID NO :72和73所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。
18.下述引物對的混合物(a)如SEQID NO :76和77所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(b)如SEQID NO :74和75所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(c)如SEQID NO :78和79所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。
19.引物對的混合物，其中該混合物是下述引物對的混合物(a)如SEQID N0:13和14所示以擴增編碼大腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；(b)如SEQID NO :11和12所示以擴增編碼空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對；和(c)如SEQID N0:15和16所示以擴增編碼胚胎彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素的基因組DNA的引物對。
專利摘要
本發明人成功克隆了先前未知的C.coli和C.fetus的CDT基因，并測定了它們的序列。另外，本發明人還通過比較C.jejuni和C.fetus的CDT，研制出兩種細菌的特異性引物和通用引物。此外，本發明人證明了這些引物可用于多重PCR，其可快速方便地同時確定彎曲桿菌CDT的存在和鑒定其種類，并且它們還可用于基于PCR-RFLP的分型。
文檔編號C12P21/02GKCN1914322 B發布類型授權 專利申請號CN 200480041257
公開日2012年5月30日 申請日期2004年12月3日
發明者山崎伸二, 朝倉昌博 申請人:扶桑藥品工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),