專利名稱：用于預防、診斷及治療戊型肝炎病毒的多肽,及它們作為診斷試劑和疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，用于編碼HEV-ORF2多肽的DNA分子，含有該DNA分子的表達載體，含有CDR多肽的抗體分子，用于編碼CDR多肽的DNA分子，及它們的用途，尤其是在戊型肝炎預防、診斷及治療方面的用途，如作為戊型肝炎的診斷試劑和疫苗。
發展血清HEV抗體檢測試劑的必要性早已被廣大研究人員所認識，但由于感染者或感染動物的HEV病毒分泌濃度極低而幾乎不可能作為血清檢測試劑的抗原來源，而迄今HEV的細胞培養的效率仍極低，同樣也無法得到足夠量的抗原用于檢測試劑。
1991年，研究者首次獲得了HEV的全長基因組序列，發現其為單股正鏈無包膜RNA病毒(Tam et al.，1991.Virology 185120-131)。對HEV基因組的序列分析表明，約7.2kb的病毒基因組含有三個開放讀碼框架(ORF)。位于5’末端的ORF1編碼病毒非結構蛋白，位于3’末端的ORF2編碼病毒主要結構蛋白。ORF3的5’端與ORF1的3’端有1個堿基的重疊，3’端與ORF2有339個堿基的重疊。ORF3被認為編碼另一個功能尚不明確的結構蛋白。(Tam et al.，1991.Virology185120-131；Aye et al.，1992.Nucleic Acids Res.203512；Ayeet al.，1993.Virus Genes.795-109；Huang et al.，1992.Virology.191550-558；Reyes et al.，1993.Arch Virol Suppl.715-25)。
過去HEV感染的檢測主要依賴于免疫電鏡技術(IEM)或免疫熒光技術，然而，這些檢測技術十分繁雜，價格昂貴，而且在多數實驗室難以完成。在HEV基因組克隆和測序完成之后，發展出了更靈敏的檢測技術如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白印跡試驗(Western blot)和聚合酶鏈反應(PCR)等，用于HEV感染相關標志物的檢測。
ELISA技術使用HEV重組蛋白或合成多肽作為抗原檢測HEV相關抗原/抗體的存在。重組蛋白多選自HEV-ORF2和HEV-ORF3的羧基端，合成多肽選用的多為HEV-ORF2上的幾個線性表位。
最近的研究已發現源于HEV-ORF2的氨基端和羧基端的重組多肽片段可以自組裝成病毒樣顆粒(VLP)(Li et al.，1997.J Virol717207-7213)。雖然顆粒較小，但這些病毒樣顆粒在形態上和在抗原性上與感染性病毒的衣殼蛋白均相近(Li et al.，1997.J Virol717207-7213；Xing et al.，1999.Virology 26535-45)。基于這些發現，看來重組多肽組裝成病毒樣顆粒的基本要素與全長HEV結構蛋白組裝成感染性病毒顆粒的衣殼基本相同。值得注意的是，這些發現提示ORF2編碼的結構蛋白本身就已足夠組裝出病毒衣殼。進一步看，衣殼蛋白的形成本身可能出現在全長ORF2蛋白的從112位氨基酸到608位氨基酸的結構域的相互作用之下(Xing et al.，1999.Virology 26535-45)。而ORF2氨基端的111氨基酸可能主要與病毒核酸進入衣殼有關，然而這一區域顯然并不直接參與病毒衣殼的形成本身。
本發明的目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其氨基末端位于第一個序列(其來源于戊型肝炎病毒第二讀碼框架且序列如后面所示)的225位至459位氨基酸之間，其羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間。
本發明的再一目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其氨基末端位于第一個序列的374位至429位氨基酸之間，其羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間。
本發明的另一目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其氨基末端位于第一個序列的394位至429位氨基酸之間，其羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間。
本發明的另一目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第二個序列。
本發明的另一目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第三個序列。
本發明的另一目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第四個序列。
本發明的另一目的是提供對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第五個序列。
本發明同時還涉及上述多肽的同源多肽和/或衍生多肽。
本發明的另一目的是提供DNA分子，其序列編碼上述之一的戊型肝炎病毒第二讀碼框架多肽。
本發明的另一目的是提供重組表達載體，其中包含上述DNA分子。
本發明的另一目的是提供單克隆抗體，HE1F6，或其片段，特異性地與上述HEV-ORF2多肽結合，所述單克隆抗體由雜交瘤細胞系1F6分泌，所述雜交瘤細胞系的細胞保藏號為_____本發明的另一目的是提供雜交瘤細胞系，分泌一種單克隆抗體HE1F6，該單克隆抗體可特異性地與上述HEV-ORF2多肽結合，細胞保藏號為______本發明的另一目的是提供上述單克隆抗體HE1F6的互補性決定區(CDR)的多肽，及含有所述CDR多肽的抗體分子或其片段。
本發明的另一目的是提供用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含至少一種加在藥物學上可接受的佐劑中的上述重組蛋白質。
本發明的另一目的是提供用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含至少一種加在藥物學上可接受的佐劑中的序列為第六個序列的多肽。
本發明的另一目的是提供用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含至少一種上述DNA分子。
本發明的另一目的是提供一種檢測戊型肝炎病毒感染的方法，其包括用一定數量的至少一種上述多肽，與包含抗體的樣本接觸。
本發明的另一目的是提供一種檢測戊型肝炎病毒感染的方法，其包括至少一種上述抗體分子或其片段。
本發明人經研究發現，氨基端位于第一個序列的225位至459位氨基酸之間，其羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間的HEV-ORF2多肽；更好是氨基末端位于第一個序列的374位至429位氨基酸之間，羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間的HEV-ORF2多肽；更好是氨基末端位于第一個序列的394位至429位氨基酸之間，羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間的HEV-ORF2多肽；更好是序列為第二個序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列為第三個序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列為第四個序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列為第五個序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列為第六個序列的HEV-ORF2多肽，通過合適的原核表達載體在大腸桿菌(E.coli)中表達出的這些HEV-ORF2多肽，去除了全長HEV-ORF2的N端部分氨基酸，同時去除了HEV-ORF2的C端部分氨基酸，從而在E.coli中表達出的重組蛋白能形成病毒樣顆粒，具有高度免疫活性，并均暴露出一個與感染性病毒表面天然構相相近的構相型抗原表位，該表位可與一個識別構相表位的單克隆抗體所特異結合，這一表位的相應抗體在HEV感染的早期即可出現，因此可以作為HEV疫苗及HEV感染檢測試劑。
本發明同時還利用表達出的上述重組蛋白免疫小鼠，制備出了幾株HEV-ORF2特異的單克隆抗體。單克隆抗體HE3F5特異識別上述HEV-ORF2多肽上的一個線性表位，而單克隆抗體HE1F6特異識別HEV-ORF2多肽上的一個構相型表位。
本發明同時提供了一種疫苗組合物，包含序列為第六個序列的HEV重組蛋白，以氫氧化鋁作為佐劑，免疫動物可產生良好抗體反應，可保護實驗動物免受HEV感染。
本發明同時還提供了一個HEV抗體檢測藥盒，以上述重組蛋白作為抗原，檢測標本中的HEV抗體。另外還使用上述單克隆抗體提供了一個HEV近期感染檢測藥盒。術語解釋除非另外定義，這里所用的所有技術和科學名詞都表達的是在本發明涉及領域里的熟練技術人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。在本發明中，除另外指出，以下名詞的含義應為“戊型肝炎病毒”，或“HEV”，是指一種病毒，病毒類型，或病毒類別，(I)它引起來源于水的傳染性肝炎；(II)它在血清學特性上不同于甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、和丁型肝炎病毒(HDV)；(III)該病毒含有一個同源于插入pTZKF1(ET1.1)中之1.33kb cDNA的基因組區域，所述質粒由ATCC寄存登記號67717的大腸桿菌菌株BB4攜帶。如果使用有突變缺口矩陣和缺口障礙數為6或更大的ALIGN程序，得出兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列具有調準比數大于5(標準偏差單位)，則可認為他們是同源的(參見Dayhoff，M.O.，Atlas ofprotein sequence and structure(1972)Vol.5.NationalBiomedical Research Foundation，pp101-110，以及該卷增刊2.pp.1-10)。用上文所述的ALIGN程序進行最大調準時如果兩個序列)或它們的一部分，最好至少有30個氨基酸長)的氨基酸大于或相當于有50％相同，則它們有更好的同源性。如果一個多肽序列包含有權利要求1至7所述多肽序列，但其N端和/或C端帶有其他非所述多肽本身的相鄰序列的其他氨基酸，而得到的多肽的抗原性、免疫原性等生物學性質仍然類似，則稱該多肽為權利要求1至7所述多肽的衍生多肽，其相應的DNA分子稱為衍生DNA。如為利于表達而在權利要求1至7所述多肽序列的N端加上起始氨基酸甲硫氨酸或其他引導肽和/或信號肽，或在C端加上幾個組氨酸以利于純化等。本發明所述的第一序列為第一個序列1 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met PheLeu Pro Met 1617 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg ArgArg Gly Arg 3233 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp ArgVal Asp Ser 4849 Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn ProPhe Ala Pro 6465 Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg Val ArgGln Pro Ala 8081 Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln Ala Gln ArgPro Ala Ala 9697 Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala Gly Ala Ala ProLeu Thr Ala 112113 Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp ValAsp Ser Arg 128129 Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr SerPro Leu Thr 144145 Ser Ser Val Ala Thr Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr AlaAla Pro Leu 160161 Ser Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr HisIle Met Ala 176177 Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala ArgAla Thr Ile 192193 Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly TyrAla Ile Ser 208209 Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr SerVal Asp Met 224225 Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val GlnPro Gly Ile 240
241 Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His TyrArg Asn Gln 256257 Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu GluGlu Ala Thr 272273 Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro ValAsn Ser Tyr 288289 Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu AspPhe Ala Leu 304305 Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr AsnThr Arg Val 320321 Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg ArgGly Ala Asp 336337 Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg PheMet Lys Asp 352353 Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile GlyArg Gly Ile 368369 Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu GlyGly Leu Pro 384385 Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe TyrSer Arg Pro 400401 Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu TyrThr Ser Val 416417 Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro HisAsp Ile Asp 432433 Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp AsnGln His Glu 448449 Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg ProPhe Ser Val 464465 Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr AlaAla Glu Tyr 480481 Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val TyrVal Ser Asp 496497 Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln AlaVal Ala Arg 512513 Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg ProLeu Ser Thr 528529 Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro LeuArg Gly Lys 544545 Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly TyrPro Tyr Asn 560561 Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu AsnAla Ala Gly 576577 His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu GlyAla Gly Pro 592593 Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His SerVal Leu Ala 608609 Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala HisThr Phe Asp 624625 Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln GlyCys Ala Phe 640641 Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met LysVal Gly Lys 656657Thr Arg Glu Leu ***661HEV重組蛋白HEV重組多肽多肽414-603，序列為第四個序列，位于第一個序列的414位氨基酸至603位氨基酸。第四個序列Thr Ser ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp IleAspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe SerValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro多肽459-603，序列為第七個序列，位于第一個序列的459位氨基酸至603位氨基酸。第七個序列Ser Arg Pro Phe Ser ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro多肽429-603，序列為第五個序列，位于第一個序列的429位氨基酸至603位氨基酸。第五個序列His Asp Ile AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe SerValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro多肽394-603，序列為第三個序列，位于第一個序列的394位氨基酸至603位氨基酸。第三個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro多肽374-603，序列為第八個序列，位于第一個序列的374位氨基酸至603位氨基酸。第八個序列Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu ProThr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr SerArg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala lle Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser lle Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro多肽225-603，序列為第九個序列，位于第一個序列的225位氨基酸至603位氨基酸。第九個序列
Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln ProGly IleAla Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr ArgAsn GlnGly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu GluAla ThrSer Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val AsnSer TyrThr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp PheAla LeuGlu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn ThrArg ValSer Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg GlyAla AspGly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe MetLys AspLeu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly ArgGly IleAla Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly GlyLeu ProThr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr SerArg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro多肽394-606，序列為第二個序列，位于第一個序列的394位氨基酸至606位氨基酸。第二個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Val多肽394-610，序列為第十個序列，位于第一個序列的394位氨基酸至610位氨基酸。第十個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp
Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser ValLeu AlaLeu Leu多肽394-593，序列為第十一個序列，位于第一個序列的394位氨基酸至593位氨基酸。第十一個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Ash Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal多肽394-583，序列為第十二個序列，位于第一個序列的394位氨基酸至583位氨基酸。第十二個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro
Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAIa GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr多肽394-578，序列為第十三個序列，位于第一個序列的394位氨基酸至578位氨基酸。第十三個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg多肽193C，序列為第六個序列，其第一位氨基酸為甲硫氨酸，其后為第一個序列的394位氨基酸至578位氨基酸的多肽。第六個序列Met Thr Ser ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp IleAspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe SerValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro本發明同樣也涉及上述多肽的同源多肽及衍生多肽。
編碼多肽的DNA分子是通過PCR方法從質粒pGEX-ORF2中擴增出來。質粒pGEX-ORF2中帶有HEV-ORF2的全長編碼基因。用5’端帶有Nde I位點，3’端帶有EcoR I位點的相應引物擴增出相應片段，插入原核表達質粒pTO-T7的Nde I/EcoR I位點中，并在大腸桿菌表達系統中進行表達。表達出的重組蛋白在N端首先是一個甲硫氨酸，其后為相應多肽序列。參見實施例1至11。
上述產生重組多肽的編碼順序也可從其他攜帶HEV-ORF2基因的克隆載體而來，或通過拉鏈PCR的方法直接人工合成而得，或是通過其他本領域內技術人員可以想見的其他方法得到。HEV重組蛋白疫苗制備上述HEV重組蛋白依照通常的方法制備成疫苗組合物，以提高蛋白的免疫原性。例如，在其中一個組合物，多肽193C(序列為第六個序列)吸附于氫氧化鋁佐劑；在另一個組合物，多肽194-603吸附于氫氧化鋁佐劑。重組蛋白疫苗免疫方法在一個方面，本發明提供了一種使個體免受HEV感染的方法，即給個體注入本發明的疫苗組合物，例如肌肉注射，或是皮下注射。
在該方法中使用的更好的疫苗組合物是包含HEV抗原，其序列為N端為一個甲硫氨酸，自第二個氨基酸開始序列為第二個序列，或第三個序列，或第四個序列，或第五個序列，或第六個序列，或第七個序列，或第八個序列，或第九個序列，或第十個序列，或第十一個序列，或第十二個序列，或上述序列的同源序列或衍生序列。
更好的，上述疫苗組合物通過系列肌肉注射給藥，例如，在0天，10天，30天給予3個劑量，或在0天，28天給予兩個劑量。每個劑量可以從2μg重組蛋白到100μg重組蛋白，更好地是每個劑量5μg～10μg重組蛋白。
在細節如實施例12的方法中，用加入鋁佐劑的抗原多肽414-603(N端帶一甲硫氨酸)肌肉注射免疫恒河猴。三只恒河猴按0，10，30天間隔接受的3個劑量的免疫，每個劑量含10μg重組多肽414-603。通過EIA實驗，在第2周時，三只猴子中的兩只血清中均已可檢測到明顯抗體產生，另7一只在第3周也已產生抗體，在第5周時，三只猴子的血清抗體滴度均達高峰。
在第6周時，猴血清抗體滴度在1∶104～1∶105，此時用猴HEV感染性膽汁靜脈注射攻擊，該感染性膽汁攜帶大量感染性HEV病毒顆粒。攻擊后定期收集血清和糞便，檢測血清ALT(轉氨酶)水平，檢測糞便標本中排毒情況。結果連續觀察2月，免疫組始終未見血清ALT水平的異常，也未檢出糞便排毒。而3只未免疫對照組在攻毒30天內先后出現ALT的明顯升高，黃疸，糞便排毒持續5～8周。詳見實施例12。單克隆抗體HE1F6在細節如實施例13的方法中，以重組多肽414-603為抗原，通過本領域研究人員熟知的常規單克隆抗體制備方法，篩選出了小鼠雜交瘤細胞系HE1F6及其分泌的單克隆抗體HE1F6。該單克隆抗體特異性識別HEV-ORF2多肽上一個天然構相型表位。其證據如下(I)用所述單克隆抗體對重組多肽414-603進行蛋白印跡實驗，結果未煮沸樣品見重組蛋白多聚體位置顯色明顯，單體部分顯色微弱；而煮沸樣品未見顯色，說明該單克隆抗體識別表位為構相依賴型表位；(II)用所述單克隆抗體對急性期人HEV血清或猴HEV血清進行阻斷實驗，抑制率均在50％以上，提示其所識別表位為HEV天然表位；(III)以所述單克隆抗體進行免疫捕獲PCR，結果能捕獲到標本中的HEV病毒顆粒，提示該單克隆抗體識別表位暴露于天然病毒表面。
本發明提供的單克隆抗體HE1F6和/或其片段可用于檢測標本中HEV抗原或抗體或病毒核酸。如用于EIA試劑盒或免疫捕獲PCR。單克隆抗體HE3F5在細節如實施例13的方法中，以重組多肽414-603為抗原，通過本領域研究人員熟知的常規單克隆抗體制備方法，篩選出了小鼠雜交瘤細胞系HE3F5及其分泌的單克隆抗體HE3F5。該單克隆抗體特異性識別HEV-ORF2多肽上一個線性表位。其證據如下(I)用所述單克隆抗體對重組多肽414-603進行蛋白印跡實驗，結果未煮沸樣品見重組蛋白單體位置顯色明顯強于多聚體部分，煮沸樣品顯色依然未見減弱，說明該單克隆抗體識別表位為線性表位；(II)用所述單克隆抗體對急性期人HEV血清或猴HEV血清進行阻斷實驗，抑制率在30％以上，提示其所識別表位為HEV天然表位。
本發明提供的單克隆抗體HE3F5和/或其片段可用于檢測標本中HEV抗原或抗體或病毒核酸。如用于EIA試劑盒或免疫捕獲PCR。
引物A5’-CAT ATG ACA TCT GTA GAG AAT GCT CA-3’引物B5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’多肽193C的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG TCG CGC CCT TTT T-3’引物B5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’多肽459-603的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERRR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
以HEV-ORF2基因(香港大學吳教授贈送)為模板，用引物A和B，對多肽414-603基因進行PCR擴增。PCR條件為94℃1分鐘、57℃1分鐘、72℃50秒，35個循環(BioMetra T-Gradient)。上述PCR產物經過瓊脂糖凝膠回收，經過DNA純化柱(華舜公司)純化后，用NdeI/EcoRI克隆入質粒載體pTO-T7。
引物A5’-CAT ATG CAT GAC ATC GAC CTC G-3’引物B5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’多肽429-603的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’
引物B5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’多肽394-603的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/m1卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG AAC CTT GCT GAC ACC CTG-3’引物B5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’多肽374-603的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Titon X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG AAT TCA ATA ACC TCG ACG-3’引物B5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’多肽225-603的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’引物B5’-GAA TTC TTA CAC AGA GTG GGG GGC TAA-3’多肽394-606的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’引物B5’-GAA TTC TTA AAG CAA TGC TAG CAC AGA-3’多肽394-610的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽，將其對100倍體積的1XPBS(pH7.45)在25℃下進行透析復性，其中換液3次。離心得復性上清液，再用高效液相分子篩色譜(制備型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)進行純化，色譜條件為流速4ml/分鐘，1XPBS(pH7.45)洗脫，UV280nm檢測。
引物A5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’引物B5’-GAA TTC TTA GAC GGG GCC AGC ACC CAG-3’
多肽394-593的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/m1卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽。
引物A5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’引物B5’-GAA TTC TTA GGT GGA AAT AGC AAC CCG-3’多肽394-583的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecolu.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽。實施例11多肽394-578基因的表達質粒構建以HEV-ORF2基因(香港大學吳教授贈送)為模板，用引物A和B，對多肽414-603基因進行PCR擴增。PCR條件為94℃1分鐘、57℃1分鐘、72℃50秒，35個循環(BioMetra T-Gradient)。上述PCR產物經過瓊脂糖凝膠回收，經過DNA純化柱(華舜公司)純化后，用NdeI/EcoRI克隆入質粒載體pTO-T7。
引物A5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’引物B5’-GAA TTC TTA CCG ATG CCC AGC GGC ATT-3’多肽394-578的表達和純化將表達質粒轉化入表達菌株Ecoli.ERR2566，挑取單克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養基37℃振蕩培養過夜至OD550＝1.0，用終濃度為0.2mM的IPTG進行誘導，誘導條件為25℃，190rpm，6小時。離心收集菌體，用細菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)懸浮，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，用含有2％Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)懸浮，離心收集包涵體，再分別用2M、4M、8M的尿素進行分級變性處理。其中4M尿素變性上清液含有絕大量高純度的目的多肽。
檢測時，于每孔中加入100μl細胞培養液上清；每塊96孔微量滴定板設一陽性對照，加入100μl小鼠多抗血清(1∶100稀釋使用)；另設一陰性對照，加入100μl HT細胞培養液。37℃溫浴30分鐘，用PBS-吐溫洗5遍，拍干后加入過氧化物酶結合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM IgG)，37℃溫浴30分鐘，取出后用PBS-吐溫洗5遍，拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分為13.42HPO4·12H2O、4.2g檸檬酸·H2O和0.3g過氧化氫，用去離子水中調節體積為700ml；底物液B成分為0.2g四甲基聯苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去離子水中調節體積為700ml)，37℃顯色10分鐘，加入50μl終止液(2M H2SO4去離子水定容至700ml)終止反應，并于酶標儀上檢測各孔的OD450，通常OD450值高于陰性對照2倍以上者可視為陽性。單克隆抗體腹水的獲得及純化取10周齡的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐劑，每只0.5ml。2~7天后，收集克隆化的雜交瘤細胞，離心去上清，加入不含血清的培養基，調節細胞密度至2×105~2×106個/ml，每只小鼠注射0.5ml。7~10天后小鼠腹部增大，開始收集腹水。3000rpm離心15分鐘，吸取中間澄清部分的液體，一0.45μm的小孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存。
將處理好的腹水用0.02mol/L、Ph 7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa2HPO4，19ml 0.2mol/L NaH2PO4，加生理鹽水至100ml)對倍稀釋，攪拌下逐滴緩慢加入ASA(硫酸銨濃度達到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入ASA使硫酸銨濃度達到33％飽和度，4℃靜置過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入ASA(硫酸銨濃度達到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清。將沉淀溶于適量的PBS中，裝入透析帶中，放入50~100倍含20mmol/L NaCl，pH 7.8的120mmol/L Tris-HCl緩沖液中4℃攪拌下脫鹽12小時左右，期間更換3次以上透析液。取出后分裝-20℃保存。
權利要求
1.對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的的多肽或其二聚體或三聚體，其氨基末端位于第一個序列的225位至459位氨基酸之間，羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間。
2.對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其氨基末端位于第一個序列的374位至429位氨基酸之間，其羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間。
3.對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其氨基末端位于第一個序列的394位至429位氨基酸之間，其羧基末端位于第一個序列的578位氨基酸至610位氨基酸之間。
4.肝炎病毒第二讀碼框架的多肽，其序列為第二個序列。第二個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu TyrThr Ser ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro HisAsp Ile AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp AsnGln His GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg ProPhe Ser ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr AlaAla Glu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val TyrVal Ser AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln AlaVal Ala ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg ProLeu Ser ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro LeuArg Gly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly TyrPro Tyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu AsnAla Ala GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu GlyAla Gly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Val
5.對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第三個序列。第三個序列Gln Leu Phe Tyr Ser Arg ProVal Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu TyrThr Ser ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp IleAspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg ProPhe Ser ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr AlaAla Glu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val TyrVal Ser AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln AlaVal Ala ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg ProLeu Ser ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro LeuArg Gly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly TyrPro Tyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu AsnAla Ala GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu GlyAla Gly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro
6.對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第四個序列。第四個序列Thr Ser ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro
7.對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體，其序列為第五個序列。第五個序列His Asp Ile AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro
8.權利要求1至7的多肽，其還包括與其同源性至少70％以上的多肽。
9.權利要求1至7的多肽，其還包括與其同源性至少80％以上的多肽。
10.權利要求1至7的多肽，其還包括與其同源性至少90％以上的多肽。
11.權利要求1至7的多肽，其還包括其衍生多肽。
12.DNA分子，其序列編碼權利要求1至11之一的戊型肝炎病毒第二讀碼框架多肽。
13.重組表達載體，其中包含權利要求12的DNA分子。
14.用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含至少一種加在藥物學上可接受的佐劑中的權利要求1至11的多肽。
15.用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含加在藥物學上可接受的佐劑中的權利要求5的多肽。
16.用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含加在藥物學上可接受的佐劑中的權利要求6的多肽。
17.用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含加在藥物學上可接受的佐劑中的HEV-ORF2多肽，其序列如第六個序列。第六個序列Met Thr Ser ValGlu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle AspLeu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis GluGln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer ValLeu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu TyrAsp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer AspSer Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla ArgSer Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer ThrIle Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly LysLeu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr AsnTyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla GlyHis Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly ProVal Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro
18.用于免疫個體免受戊型肝炎病毒感染的疫苗組合物，包含至少一種權利要求12的DNA分子。
19.一種檢測戊型肝炎病毒感染的方法，其包括用一定數量的至少一種權利要求1至11的多肽，與包含抗體的樣本接觸。
20.一種檢測戊型肝炎病毒感染的方法，其包括至少一種權利要求14，權利要求16，權利要求17，權利要求19的抗體分子或其片段。
全文摘要
本發明涉及對戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚體或三聚體,用于編碼HEV－ORF2多肽的DNA分子,含有該DNA分子的表達載體,含有CDR多肽的抗體分子,用于編碼CDR多肽的DNA分子,及它們的用途,尤其是在戊型肝炎預防、診斷及治療方面的用途,如作為戊型肝炎的診斷試劑和疫苗。
文檔編號C07K19/00GK1345775SQ0013063
公開日2002年4月24日 申請日期2000年9月30日 優先權日2000年9月30日
發明者夏寧邵, 張軍, 李少偉, 葛勝祥, 顧穎, 何志強 申請人:養生堂有限公司