一種豬戊型肝炎病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測豬戊型肝炎病毒的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]戊型肝炎OfepatitisE)是一種由戊型肝炎病毒（HEV)引起的急性病毒性肝炎， 主要通過糞-口消化道傳播。戊型肝炎呈全球分布，以暴發流行或散發感染的形式存在， 在世界范圍內，無論HEV在這個地區是否流行，豬感染HEV的現象非常普遍。HEV主要 包括1~4個基因型，其中，基因4型具有人獸共患的性質，在人群和豬群中，主要以 基因4型HEV感染為主。研究發現從豬體內分離的基因4型HEV能夠感染人，反之亦 然，并且基因4型HEV對人的致病性較其他基因型更強，危害也更大。
[0003] 戊型肝炎從1955~1956年在印度新德里第一次HE大暴發至今，已廣泛分布于亞 洲、非洲及中美洲等發展中國家。我國HE的高發地區新疆，曾在1986~1988年間暴發該 病，是世界上一次大規模的流行，共計發病119280例，死亡707例。1997年Meng從豬體內 分離出1株野生型HEV，發現其與人類的HEV有極高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴， 因此推測豬可能是HEV感染的一個動物宿主。目前研究表明，HEV在豬群中普遍存在，已經 被世界衛生組織認定是發展中國家的一個重要公共衛生問題，從而引起公眾對公共健康 和食品安全的普遍關注。因此，對豬源戊型肝炎診斷方法的研究十分必要。
[0004]對戊型肝炎病毒的快速準確診斷是臨床上防治豬戊型肝炎病毒的關鍵。目前實驗 室診斷HEV的方法大致可分為2類：①血清學方法，如ELISA方法、血清中和實驗、免疫熒光 等；②分子生物學方法。血清學方法存在假陽性過多的問題和現象，并且不適于HEV急性感 染的早期做出快速準確的診斷。分子生物學方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，雖然PCR方 法較病毒分離鑒定方法快速準確，但需要昂貴的儀器設備，成本較高，在結果判定上需要進 行瓊脂糖凝膠電泳，容易造成實驗室污染導致出現假陽性結果，也不適合基層和現場檢測。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為了提供一種為基層快速、準確并且實時地檢測豬戊型肝炎病毒 的方法，提供一種豬戊型肝炎病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，從而解決基層檢測豬戊 型肝炎病毒困難、耗時長和儀器昂貴等問題。為實現本發明目的所使用的技術方案為： 一種豬戊型肝炎病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括RT-LAMP引物、2X反應緩沖液、EM、熒光目視檢測試劑、超純水和豬戊型肝炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引 物包括外引物F3(SEQIDN0:1)與B3(SEQIDN0:2)、內引物FIP(SEQIDN0:3)與BIP (SEQIDNO：4)； 其中： F3TGCTTGACTTTGCACTCGA B3TCAGTGCTATACCACGACCA FIPACGCGCGCTACTCGAATAACGGAGTTCCGCAATTTGACACC BIPACGGCACTGCAGAGCTAACTACCACCAACACCATTAGTCCCA 所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 以上所述的豬戊型肝炎病毒RNA模板是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取 的豬戊型肝炎的RNA。
[0007] 以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0008]以上所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgS04 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0·4-0. 8%、Betaine1·5-3. 0M和dNTPs 2. 5-4mM，其配制方法在pH為8. 7條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0009] -種豬戊型肝炎病毒逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的應用，用于獸醫臨床上檢測 疑似豬戊型肝炎病毒以及疑似豬戊型肝炎病變組織或豬糞便排泄物中是否感染有豬戊型 肝炎病毒，具體檢測步驟包括： (1) RT-LAMP引物的設計與合成 (2) 豬戊型肝炎病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反應體系建立 (4) RT-LAMP檢測方法。
[0010] 以上所述的RT-LAMP反應體系建立以25μ1計， 2X反應緩沖液 12. 5yL EM 1 yL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol B3 5pmol 豬戊型肝炎病毒RNA 5 μL 超純水 補足25 μL。
[0011] 以上所述的RT-LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測 的方法。
[0012] 以上所述的RT-LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監 控，反應溫度為63 °C、反應在20分鐘前后出現擴增。
[0013] 本發明的實質性特點和進步是： 1)特異性強 本發明的RT-LAMP檢測試劑盒特異性檢測出豬戊型肝炎病毒，而所檢測的陰性對照病 毒和水對照均無陽性結果出來，與RT-PCR檢測結果一致。且操作簡便、快速獲得檢測結果、 無需昂貴復雜的儀器。普通RT-PCR法需先進行反轉錄（RT)，然后再以RT產物為模板進行 PCR反應，使用了兩個反應程序，而RT-LAMP方法可在一個反應管內同時完成兩個反應程 序，一個小時即可完成擴增。
[0014] 2)靈敏度高 提取的豬戊型肝炎病毒RNA原始濃度為6. 310X10ng/μL，普通PCR檢測方法的靈敏 度為6. 31X10-6ng/yL，而使用本發明的RT-LAMP檢測方法，檢測限約為6. 31X10-8ng/ μL，敏感性是普通PCR的100倍。
[0015] 3)迅速獲得結果 普通的RT-PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，目前多數建立的RT-LAMP反應 方法在反應結束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結果，從病毒基因組RNA 提取到獲取試驗結果，需要5-6小時左右。本發明提供的RT-LAMP檢測方法反應在23分鐘 左右出現擴增，60分鐘內即可完成擴增，且結果判讀方式簡便，依據反應管濁度值的變化情 況即可判讀結果，擴增反應結束即可獲得試驗結果，不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線 顯像分析或者反應結束后加入熒光染料來判讀結果，從病毒基因組DNA/RNA提取到獲得最 終結果可在2-3小時內完成。
[0016] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應后加入，而本發明的熒光染料是在 反應前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋，能有效避免實驗 環境的污染。此外，本發明的RT-LAMP檢測方法在結果判定上，直接通過濁度儀檢測反應管 的濁度值來判定結果，可不進行熒光染料法檢測結果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果， 不需要開蓋，能有效避免污染。
[0017] 5)可實時定量 本發明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度儀來實時分析RT-LAMP反應的結果， 不同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可 求出各時間的豬戊型肝炎病毒拷貝數，達到定量檢測產物的目的。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明豬戊型肝炎病毒RT-LAMP方法特異性檢測結果，其中1:豬戊型肝 炎病毒；2 :豬瘟病毒；3 :豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒；4 : 口蹄疫病毒；5 :偽狂犬病毒；6 : 傳染性胃腸炎病毒；7 :流行性腹瀉病毒；8 :豬細小病毒；9 :空白對照(水)。結果顯示豬戊型 肝炎病毒反應管出現濁度的上升曲線，7株對照病毒反應管和水對照反應管均無擴增。
[0019] 圖2和圖3是分別使用本發明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法進行的豬戊型肝炎 病毒敏感性檢測的結果。其中 1 :6· 31X10ng/yL;2 :6· 31ng/yL;3 :6. 31X10-lng/yL; 4 ：6. 31X10-2ng/μL； 5 ：6. 31Xl〇-3ng/μL；6 ：6. 31Xl〇-4ng/μL；7 ：6. 31Xl〇-5ng/ yL;8:6.31X10-6ng/yL;9:6.31X10-7ng/yL;10:6.31X10-8ng/yL;ll:水。豬 戊型肝炎病毒基因組RNA的起始濃度為6. 31X10ng/μL，經10倍倍比連續稀釋后，進行 RT-LAMP和PCR擴增，結果顯示本發明的RT-LAMP法檢測限約為6. 31X10-8ng/μL，而普 通PCR方法檢測限約為6. 31X10-6ng/μL。
[0020] 圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結果：左管為以豬戊型肝炎病毒基因組RNA為模 板的反應情況，為陽性結果，右管為陰性對照的反應情況，為陰性結果。
[0021] 圖5是本發明豬戊型肝炎病毒定量標準曲線：利用不同的標準樣品的濃度對應的 濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的豬戊型肝炎病毒 拷貝數。
【具體實施方式】
[0022] 1、材料的準備 豬戊型肝炎病毒、豬瘟病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病毒、 傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒、豬細小病毒，均為市售疫苗，或為廣西獸醫研究所分 離鑒定和保存。RT-LAMPRNA擴增試劑盒購自北京藍譜生物科技有限公司，貨號SLP246 ;病 毒基因組RNA/RNA提取試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0548。
[0023] 2、RT_LAMP引物的設計與合成 根據GenBank中的戊型肝炎病毒部分0RF2基因序列，利用RT-LAMP法引物輔助設計軟 件PrimerExplorerV4軟件設計一套RT-LAMP引物，其中F3、B3為外引物，FIP、BIP為內 引物，其中F3、B3為豬瘟病毒RT-PCR檢測引物，其中 F3TG