一種培養戊型肝炎病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，涉及一種戊型肝炎病毒毒株在體外成功培養并提高子代病毒復制效率的新方法。
【背景技術】
[0002]戊型肝炎病毒(!fepatitis E Virus，HEV)是一種經腸道傳播的病毒性肝炎病原體，可以跨種間感染人和多種動物。HEV為無囊膜單股正鏈RNA病毒，球型病毒顆粒大小為27?34nm，表面有突起和缺刻，內部密度不均勻，基因組全長約為7.3 kb，由3個開放閱讀框組成。全球HEV主要有4種基因型，在中國主要以IV型HEV毒株常見。HEV傳播途徑主要經糞-口途徑，也可通過其他途徑傳播，包括血液傳播，接觸傳播，垂直傳播，以及器官移植進行傳播。
[0003]HEV是導致許多發展中國家戊型肝炎暴發性流行的病原體，HEV感染后，一般患者在4-6周內自愈，免疫缺陷病人及老年人易發展成為慢性肝炎。據世界衛生組織估計，全球每年大約有2010萬人感染HEV，造成70萬人死亡和3000胎兒宮內死亡，感染HEV的非孕婦和孕婦患者死亡率分別為1.9%和19.8%孕婦感染HEV，發病率高，病情嚴重，尤其以妊娠晚期最為嚴重，病死率可高達25%，常發生胎兒早產，流產，死胎及孕婦產后急性肝壞死等癥狀。戊型肝炎的防控形勢已經迫在眉睫，發展有效的戊型肝炎疫苗已成為關系公眾健康的急為緊迫的問題，而在這一過程中病毒培養至關重要。
[0004]病毒培養是研究病毒生物學特性，致病機理及疫苗研制的基礎。自1983年首次電鏡下觀察到HEV病毒顆粒，距今已經超過30年，一直以來，大量涉及HEV的研究，病毒的體外培養一直是研究的熱點和難點之一，這也就嚴重阻礙了病毒在細胞中復制機制的研究，進而阻滯了 HEV疫苗的研發。直到2007年Tanaka等，嘗試用21種細胞系培養HEV，HEV在A549和PLC/PRF/5細胞中增殖較快且易于被檢測，2011年Okamoto和Tanaka等，進一步利用A549和PLC/PRF/5細胞系成功建立了 HEV細胞培養體系，通過接種高滴度的病毒(17)后獲得了更高滴度的子代病毒(接種50天后達到10s)。HEV體外培養體系的建立為后續HEV復制機制、抗病毒藥物研發等奠定堅實的基礎。然而，HEV病毒復制仍然受限，因而必須優化。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)在體外培養的方法，該方法通過添加孕晚期血清對流行病學調查分離到的較高滴度的HEV毒株在體外進行培養，能夠使病毒大量復制，為深入研究HEV生物學、免疫學特性及致病性提供必不可少的病原材料，為戊型肝炎的診斷、藥物篩選與評價以及疫苗的研究提供有效的體外實驗模型。
[0006]本發明戊型肝炎病毒體外培養方法，采用如下步驟進行:
(I)將HEV病毒溶液經0.22 μ m濾膜過濾除菌后，加入病毒溶液體積I?2%的雙抗溶液，4°C處理lh，-80°C保存備用，經Real-time qPCR測定其病毒拷貝數為2X105?2X10 6拷貝數/mL，其中雙抗溶液為含有400U/mL青霉素和1000U/mL鏈霉素的溶液；
(2)將A549細胞按2X15/孔接種至6孔板中，用含質量百分比10%胎牛血清的DMEM培養基在37°C、5% 0)2培養箱中靜止培養細胞，直至細胞長成單層；
(3)將步驟(2)的HEV病毒懸液按每孔100yL接種至單層細胞中，置37°C孵育I小時，每15min輕微搖勻一次，使病毒充分吸附到細胞上；棄上清，I XPBS洗滌細胞3次，加入含質量百分比2?5%孕晚期血清的DMEM培養基，同時添加0.0lmM MgCl2保護病毒顆粒的完整性及增強病毒與細胞的吸附作用，置于37°C、5% CO2培養箱中繼續培養；
(4)接種HEV病毒6天后A549細胞出現病變現象，反復凍融，收集病變細胞及培養液，-80 °C保存待用。
[0007]所述孕晚期血清時至孕婦晚期血清或動物孕晚期血清，采用常規方法采集。
[0008]相比于現有技術，本發明采用戊型肝炎病毒在A549細胞中培養，添加孕婦晚期血清可使病毒復制效率增加至2X 18拷貝數/ml。
[0009]采用本發明方法對分離自中國云南昆明市HEV RNA陽性豬糞便樣品的一株HEV病毒，基因型為4型，GenBank N0.JF747598 ;該毒株能在體外培養，培養上清中未經濃縮的病毒滴度達2X 18拷貝數/ml，病毒在-80°C冰箱保存3年生物活性不變，仍能感染人肺癌細胞(A549)株，在體外可連續傳代到9代以上。
【附圖說明】
[0010]圖1是本發明中使用的A549細胞感染HEV的示意圖；其中A圖為正常A549細胞，B圖為HEV感染6天后的A549細胞，C圖為A549細胞感染HEV的電鏡照片；
圖2是本發明中RT-nPCR檢測培養上清中HEV RNA示意圖；其中I為孕婦血清培養A549細胞；2為小牛血清培養A549細胞；3為孕婦血清培養HEV感染的A549細胞；4為小牛血清培養HEV感染的A549細胞；
圖3是本發明中RT-qPCR檢測孕婦晚期血清促進HEV mRNA的復制示意圖；
圖4是本發明中Western blot檢測HEV 0RF2蛋白示意圖；其中I為A549細胞；2為小牛血清培養HEV感染的A549細胞；3為孕婦血清培養HEV感染的A549細胞。
【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容；實施例中主要采用常規的細胞生物學方法，這些方法是本領域普通技術人員所熟知的。按照以下實施例，不難根據具體情況略作修改和變換而成功實施本發明，這些修改和變換均落在本申請權利要求的范圍內。
[0012]實施例1:A549細胞培養
自液氮中取出A549細胞(購買于美國ATCC，編號CCL - 185)迅速放入37°C的溫水中，使細胞懸液快速融化；然后加入含有10%新生牛血清DMEM (購買于GIBCO InvitrogenCorporat1n公司)培養液，調pH至7.2于37°C培養4h左右，棄去全部培養液，加入新鮮的培養液繼續培養，待長成致密單層后，用PBS(購買于GIBCO Invitrogen Corporat1n公司)洗細胞，胰酶-EDTA (購買于GIBCO Invitrogen Corporat1n公司)消化，加入上述培養液，置于37°C、5% CO2培養箱中繼續培養，如圖1A正常A549細胞所示。
[0013]實施例2:用添加孕婦晚期血清的DMEM培養基培養HEV
1、將收集到的用于HEV分離的HEV陽性糞便制備重量體積比10%的PBS(pH7.4)糞便懸液，劇烈震蕩，使糞便乳化，經4°C，12000g離心lOmin，收集上清，0.22 μ m濾膜過濾除菌，加入病毒溶液體積2%的雙抗溶液(400U/mL青霉素和1000U/mL鏈